劉思藝

廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006

飛龍掌血又名見血飛，為蕓香科飛龍掌血屬植物飛龍掌血(Toddalia asiatica Lam)的干燥根或根皮，始載于《植物名實(shí)圖考》，是貴州苗族習(xí)用藥材。其味辛，微苦，性溫;入肝、肺經(jīng)。臨床主要用于感冒、胃氣痛、胸脅痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、跌打損傷、月經(jīng)不調(diào)、勞傷吐血、瘡癤腫痛、毒蛇咬傷、外傷出血等［1-2］?，F(xiàn)代研究表明其具有抗A 型流感病毒活性、抑制白色念珠菌、痢疾桿菌等細(xì)菌、抗心肌缺血等作用［3-6］，研究前景廣闊?？偵飰A作為其一個(gè)有效部位群，占藥材分離物的54.5%［7］，有明顯的抗炎、鎮(zhèn)痛、止血活性［8-9］，目前尚無優(yōu)選飛龍掌血總生物堿富集純化研究的報(bào)道。酸性染料比色法可對(duì)總有效部位進(jìn)行含量測(cè)定，已有用于飛龍掌血提取物中總生物堿含量的測(cè)定［10］。本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)考察7 種大孔樹脂對(duì)飛龍掌血總生物堿的吸附、解吸性能，并對(duì)篩選出的AB-8 樹脂的純化工藝做進(jìn)一步的研究，確定了適宜的吸附、解吸的工藝條件。

1 材料與儀器

1.1 儀器 WFZ UV-2100 型紫外-可見分光光度計(jì)(尤尼柯儀器有限公司);XS225A 型分析天平(瑞士普利賽斯公司);GKC21CR4 型可控硅恒溫水浴鍋(上海錦屏儀器儀表有限公司);MD200-2 型氮?dú)獯祾邇x(杭州奧盛儀器有限公司)。

1.2 試劑與材料 檸檬酸固體、溴百里香草酚藍(lán)、十二水磷酸氫二鈉(天津市大茂化學(xué)試劑廠);乙醇、甲醇(天津市百世化工有限公司);三氯甲烷(衡陽(yáng)市凱信化工試劑有限公司);氫氧化鈉(廣州市海珠區(qū)化學(xué)試劑廠);無水硫酸鈉(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)，所用試劑均為分析純。DA-201、NKA-II、DM-301、DM-130、NKA-9、AB-8、D-101 大孔吸附樹脂(天津市海光化工有限公司)。

1.3 藥品 鹽酸小檗堿對(duì)照品(批號(hào):0713-200208，中國(guó)藥品生物制品鑒定所);飛龍掌血藥材購(gòu)自廣州致信中藥飲片有限公司，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)周勁松副教授鑒定為蕓香科植物飛龍掌血Toddalia asiatica Lam 的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析方法［10］

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 取小檗堿對(duì)照品適量，精密稱足，置稱足量瓶中，加甲醇溶解并稀釋成每1ml 含小檗堿50μg 的對(duì)照的溶液。精密吸取濃度為50μg·ml-1小檗堿對(duì)照品溶液3.0ml，空氣吹干后精密加入酸性染料溶液4.0ml 及4.0ml 緩沖液，用10.0ml 氯仿萃取，加少量無水硫酸鈉吸水。

2.1.2 陰性溶液的制備 精密吸取酸性染料溶液4.0ml 及緩沖溶液4.0ml，加10.0ml 氯仿萃，加少量無水硫酸鈉吸水。

2.1.3 供試品溶液的制備 按單因素考察和正交試驗(yàn)得出的提取方法，取飛龍掌血藥粉(40 目)約10g，25 倍量75%乙醇，75℃水浴回流提取40 min，提取液濃縮至無醇味，取上清液，稀釋至適宜的質(zhì)量濃度，備用。精密吸取原液。經(jīng)靜態(tài)和動(dòng)態(tài)吸附后藥液適量，20ml 量瓶中按對(duì)照品溶液的制備方法項(xiàng)下操作。

2.1.4 波長(zhǎng)選擇 分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性溶液進(jìn)行全掃描，記錄吸收曲線，對(duì)照品和供試品的吸收曲線形狀一致，均在波長(zhǎng)418nm 處有最大吸收，陰性溶液無干擾，故選擇418nm 為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取鹽酸小檗堿對(duì)照品儲(chǔ)備液(50μg·ml-1)0.6、1.2、1.8、2.4、3.0、3.6ml 于錐形瓶中，自“空氣吹干”按“對(duì)照品溶液的制備方法”操作，418nm 處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=0.044X+0.050，r=0.9991。線性范圍2.87～22.91μg·ml-1

2.1.6 測(cè)定方法 精密吸取原液、經(jīng)靜態(tài)和動(dòng)態(tài)吸附后藥液適量，置20ml 量瓶中，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”項(xiàng)下操作，計(jì)算總生物堿的量。

2.2 樹脂的篩選

2.2.1 樹脂的預(yù)處理 分別取上述7 種大孔吸附樹脂，在使用前一晚用蒸餾水浸泡洗至無醇味，備用。

2.2.2 堿靜態(tài)吸附率比較 精密稱取各樹脂2.5g (濕重)，置150ml 具塞三角瓶中，加入制備好的樣品溶液 (0.4 g/mL)20ml，置于恒溫?fù)u床中振搖24h 后，測(cè)定樣品液中總生物堿含量，計(jì)算樹脂吸附率。上述7 種樹脂吸附后，依次加入水10mL、75%乙醇25ml ×2 次，置于恒溫?fù)u床中依次振搖24h，測(cè)定各解吸液中總生物堿含量，計(jì)算解吸率。結(jié)果見表1。綜合考慮吸附率和解吸率，選用AB-8型大孔樹脂作為總生物堿純化的載體。

2.3 AB-8 型大孔樹脂純化飛龍掌血總生物堿工藝參數(shù)

2.3.1 濃度對(duì)樹脂吸附率的影響 取預(yù)處理樹脂適量(相當(dāng)于干樹脂約1.0g)，精密稱定，分別加入0.2、0.4、0.6 g/ml 的樣品液20.0ml，置于恒溫?fù)u床中振搖24h，測(cè)定樹脂的靜態(tài)吸附率，吸附率分別為75.62%，50.00%，54.52%。因此飛龍掌血總生物堿的最佳吸附濃度為0.2g/ml。

表1 不同型號(hào)大孔吸附樹脂對(duì)總生物堿吸附與解析結(jié)果

2.3.2 pH 值對(duì)樹脂吸附率的影響 將濃度0.2g/ml 樣品溶液調(diào)成pH 值為4.0、5.0 (原液)、6.0、7.0 和8.0 的溶液，分別精密吸取20.0ml，置裝有預(yù)處理樹脂(相當(dāng)于干樹脂約1.0g)的具塞三角瓶中，恒溫?fù)u床中振搖24h，測(cè)定 樹 脂 的 靜 態(tài) 吸 附 率，分 別 是 79.24%、82.94%、83.29%、80.82%、79.14%，上樣液最佳pH 值為5.0～6.0，用原藥液上樣即可。

2.3.3 樹脂靜態(tài)吸附平衡曲線的測(cè)定 取預(yù)處理樹脂適量(相當(dāng)于干樹脂約1.0g)，精密稱定，加入濃度0.2g/ml 樣品液20ml，置于恒溫?fù)u床中振搖，分別于0.5、1、2、3、4、6、8、12、24h 取樣，測(cè)定AB-8 大孔樹脂對(duì)總生物堿的吸附率，以吸附率對(duì)時(shí)間作圖，繪制AB-8 樹脂對(duì)總生物堿的靜態(tài)吸附平衡曲線。由圖1 可知，吸附4h 后樹脂對(duì)總生物堿吸附率基本不再變化，說明AB-8 型樹脂對(duì)總生物堿的吸附速度較快，4h 即達(dá)到吸附平衡。

2.3.4 流速對(duì)樹脂吸附量的影響 將等量的0.2g/ml 樣品液分別以1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 BV/h 的流速通過樹脂層析柱，考察不同流速對(duì)樹脂吸附量的影響。結(jié)果吸附量依次 為88.34、87.66、87.82、84.95、74.77mg/g，表 明AB-8 型樹脂對(duì)總生物堿的最佳吸附流速為3BV/h。

2.3.5 總生物堿在AB-8 樹脂上的泄露曲線 將0.2g/ml的樣品溶液加到AB-8 樹脂層析柱中進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，流速3BV/h，按保留體積分段收集流出液，并測(cè)定各段流出液中總生物堿的濃度，以流出液中總生物堿濃度對(duì)上樣體積作圖，繪制泄露曲線。由圖2 可知，第9個(gè)保留體積液中總生物堿明顯增多，說明上樣至第8個(gè)保留體積時(shí)總生物堿開始明顯泄漏。綜合考慮，選擇上樣量為8BV。

2.3.6 洗脫方法的考察 向充分吸附飛龍掌血提取液后的AB-8 大孔樹脂中加入2BV 水，置于恒溫?fù)u床中振搖24 h后，測(cè)定水解析液中總生物堿含量。再向水解吸后樹脂中依次加入各5BV 不同濃度的乙醇 (10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%)，同法操作，測(cè)定醇解析液中總生物堿的含量，結(jié)果見表2?？紤]成本，確定洗脫方法為水洗脫后，依次用5BV 10%、20%、30%、40%、50%、60%乙醇洗脫。

表2 不同洗脫液對(duì)總生物堿解析率結(jié)果

2.4 工藝驗(yàn)證 根據(jù)上述確定的樹脂類型和工藝條件，用3 根樹脂柱同時(shí)進(jìn)行純化試驗(yàn)，初步確定飛龍掌血生物堿純化工藝為:采用AB-8 大孔樹脂，濕法裝柱，上樣藥材濃度為0.2g/ml，pH 值5.0～6.0，藥材與干樹脂質(zhì)量之比為2.3∶1，室溫下以3.0 BV/h 的體積流速進(jìn)行吸附飽和。解吸時(shí)，先以2BV 的水洗脫(棄去)，再依次用5BV 10%、20%、30%、40%、50%、60% 乙 醇 洗 脫。吸 附 率80.27%，解吸率為72.87%，生物堿純度從9.15%提高至為39.09%，工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

本文圍繞大孔樹脂純化的“上樣-吸附-洗脫”步驟進(jìn)行考察，設(shè)定的工藝參數(shù)便于實(shí)際操作與應(yīng)用。醇解吸前先用水洗脫雜質(zhì)、色素等，但水對(duì)飛龍掌血生物堿有一定的解吸作用，為了生物堿收率需要控制洗脫用水量。其結(jié)果表明試驗(yàn)方案證可行，對(duì)工業(yè)生產(chǎn)有一定指導(dǎo)意義。

在酸性染料法測(cè)總生物堿含量的操作時(shí)應(yīng)注意避光，且不同pH 對(duì)結(jié)果影響較大。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中對(duì)緩沖溶液的pH值進(jìn)行了考察，配制pH 分別為4、4.5、5、5.5 的緩沖溶液，在其他條件相同時(shí)對(duì)同提取液進(jìn)行萃取分離，檢測(cè)其含量，結(jié)果顯示當(dāng)pH 為5.5 時(shí)總生物堿的含量最高，所以嚴(yán)格控制水相pH 為5.5。

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