李娜娜，黃嘉榮，詹求強(qiáng)

(華南師范大學(xué)華南先進(jìn)光電子研究院，廣州510006)

納米金表面等離子體因其獨(dú)特的光學(xué)、化學(xué)性質(zhì)和良好的生物相容性，近年來被廣泛用于光學(xué)探針、電化學(xué)傳感和生物傳感等領(lǐng)域［1－2］. 納米金具有明顯的表面等離子體共振吸收峰，其波長與納米金的粒徑、周圍的介質(zhì)、粒子的間距等密切相關(guān)，導(dǎo)致納米金溶膠顏色差異較大［3］. 納米金比色法則通過納米金溶液顏色的變化檢測微量樣品. 在納米金比色法中，微量的待測樣品可改變納米金顆粒的聚集情況，從而導(dǎo)致溶液產(chǎn)生顏色變化，用肉眼即可分辨.

結(jié)合抗體或其他靶向試劑(如蛋白質(zhì)、多肽和核酸)，納米金比色法被廣泛用于金屬離子［4－5］、DNA［6－7］、生物酶［8－9］等目標(biāo)分子的微量檢測和分析. 與傳統(tǒng)熒光分子相比，納米金具有很高的消光系數(shù)，其檢測靈敏度可達(dá)到熒光分子的103～104倍［10－11］. 納米金比色法以其簡單快速、靈敏度高、肉眼可分辨且不需要借助復(fù)雜儀器等卓越優(yōu)勢，在生化檢測、環(huán)境檢測等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景［12－13］.

過氧化氫(H2O2)在生化領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，尤其常用于傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)中. 利用納米金比色法設(shè)計(jì)檢測微量H2O2的方法，可得到較高的檢測靈敏度［14］. 結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)，該方法可直觀快速、靈敏地檢測多種微量目標(biāo)物質(zhì). 將傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)和納米金測定H2O2的方法相結(jié)合，已經(jīng)成為一種新型的檢測艾滋病病毒技術(shù)［15］，檢測靈敏度可達(dá)到10－18g/mL，比目前檢測技術(shù)高10 倍以上.該技術(shù)用過氧化氫酶標(biāo)記HIV-1 衣殼抗原p24，濃度極低的p24 即可引起H2O2濃度的減小和納米金顆粒的不規(guī)則聚集，進(jìn)而使溶液顏色呈現(xiàn)藍(lán)色;陰性結(jié)果則是納米金粒子仍保持為單分散形態(tài)，溶液顏色顯示為紅色，用肉眼就可以分辨出以上的顏色變化. 運(yùn)用這個(gè)技術(shù)，在釆用常規(guī)核酸檢測方法都無法檢出的情況下，研究人員可以在HIV 患者血液中檢測出超低濃度的p24. 但該技術(shù)具有一定的局限性:(1)反應(yīng)體系穩(wěn)定性較差，其結(jié)果隨反應(yīng)時(shí)間的變化較快，為檢驗(yàn)帶來不便;(2)只能定性分析所測樣品濃度在檢測極限范圍內(nèi)外，卻無法精確定量. 本文在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用納米金表面等離子體建立微量H2O2的檢測體系，提高反應(yīng)體系的穩(wěn)定性并探索精確定量方法，并降低檢測的分辨極限，為微量樣品檢測提供更好的平臺(tái).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

紫外－可見－近紅外分光光度計(jì)(PerkinElmer，Lambda 950);酶標(biāo)儀(Bio-Rad，iMark);電子透射顯微鏡;磁力攪拌器;pH 計(jì);2-嗎啉乙磺酸(西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司);氫氧化鈉(國藥試劑，分析純);過氧化氫(阿拉丁試劑有限公司，分析純);氯金酸(阿拉丁試劑有限公司，Au≥48%).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

取1.95 g 2-嗎啉乙磺酸粉末溶于80 mL 去離子水中，在磁力攪拌下用1 mol/L 過氧化氫溶液調(diào)節(jié)pH 6.5，轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶定容，為100 mmol/L 2-嗎啉乙磺酸儲(chǔ)備液，室溫儲(chǔ)存?zhèn)溆? 另外，將1 g氯金酸粉末溶于25.4 mL 去離子水中，為100 mmol/L 氯金酸儲(chǔ)備液，避光存于4 ℃中，保存時(shí)間勿超過15 d. 稱取0.012 3 g 還原型半胱甘肽粉末溶于100 mL 去離子水中，配制成400 μmol/L 半胱甘肽溶液，4 ℃保存.

使用1 mmol/L 的2-嗎啉乙磺酸溶液配置濃度為20 ～200 μmol/L 的H2O2溶液以及0.2 mmol/L 氯金酸溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用.于96 孔板中，每孔各加100 μL氯金酸溶液和100 μL H2O2溶液，靜置反應(yīng)10 min.向各反應(yīng)孔加入10 μL 半胱甘肽溶液，并于紫外－可見－近紅外分光光度計(jì)或者酶標(biāo)儀下讀取吸光度.反應(yīng)系統(tǒng)穩(wěn)定情況檢測部分未加半胱甘肽溶液.

2 結(jié)果與討論

2.1 裸眼檢測體系的辨色極限及金顆粒電鏡圖

2-嗎啉乙磺酸可作為一種弱還原劑，與氯金酸溶液反應(yīng)將生成團(tuán)聚態(tài)的納米金顆粒，反應(yīng)溶液呈現(xiàn)裸眼可辨的藍(lán)色. 此時(shí)，如果加入過量的H2O2作為輔助還原劑，將促進(jìn)反應(yīng)生成分散態(tài)的納米金顆粒，使反應(yīng)溶液呈現(xiàn)紅色. 因此，納米金表面等離子體可作為檢測微量H2O2的靈敏探針.

實(shí)驗(yàn)分別檢測0、20、40、60、80、100、120、140、160、180 及200 μmol/L 的H2O2溶液，反應(yīng)10 min后辨色(圖1). 當(dāng)H2O2的濃度c ＜100 μmol/L 時(shí)，反應(yīng)溶液肉眼觀察顯示藍(lán)色;當(dāng)c ＞120 μmol/L 時(shí)，反應(yīng)溶液呈現(xiàn)紅色. 該檢測體系裸眼檢測H2O2極限可分辨濃度差為20 μmol/L.

其中，取加入了60 μmol/L 和160 μmol/L H2O2的反應(yīng)孔產(chǎn)物分別作為藍(lán)色和紅色反應(yīng)孔的代表，制備銅網(wǎng)樣品，用電子透射電鏡觀察結(jié)果(圖2).藍(lán)色反應(yīng)孔的反應(yīng)產(chǎn)物為團(tuán)聚態(tài)的的納米金顆粒，紅色反應(yīng)孔的反應(yīng)產(chǎn)物為分散態(tài)的納米金顆粒，與實(shí)驗(yàn)原理相符.

圖1 不同H2O2 濃度反應(yīng)孔的辨色圖Figure 1 Photograph of nanoparticle solutions for different H2O2 concentrations

圖2 不同顏色反應(yīng)孔產(chǎn)物電鏡圖Figure 2 TEM images of nanoparticles in solutions of different colors

2.2 反應(yīng)體系穩(wěn)定性分析及其終止

2.2.1 反應(yīng)體系的穩(wěn)定性分析 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)體系在3 h 內(nèi)穩(wěn)定性差，且在反應(yīng)進(jìn)行45 min 內(nèi)顏色變化較快，對下一步檢測和定量分析帶來困難. 隨著反應(yīng)時(shí)間增加，c ＞120 μmol/L 的反應(yīng)孔所生成的分散態(tài)納米金顆粒將逐漸增加，紅色逐漸加深;c＜100 μmol/L 的反應(yīng)孔也將生成分散態(tài)的納米金顆粒，逐漸呈現(xiàn)紅色，具體辨色結(jié)果見圖3A. 反應(yīng)進(jìn)行15 min 后，c 為100 μmol/L 和80 μmol/L 的反應(yīng)孔開始略微變紅;反應(yīng)進(jìn)行20 min 后，此2 孔與更低過氧化氫濃度的反應(yīng)孔顏色有明顯區(qū)別，呈現(xiàn)紅色，并逐漸加深(圖3A). 此外，c ＜60 μmol/L 的反應(yīng)孔所呈現(xiàn)的藍(lán)顏色也隨著反應(yīng)時(shí)間不斷加深.其中，c=60 μmol/L 的反應(yīng)孔在反應(yīng)進(jìn)行45 min 后也已變?yōu)榧t色.

由于納米金溶液在波長為570 nm 處有特征吸收，實(shí)驗(yàn)也通過檢測溶液在570 nm 處的吸光度(OD570)來監(jiān)測納米金生成的穩(wěn)定情況. 圖3B 為不同反應(yīng)時(shí)間各反應(yīng)孔的吸光度OD570變化曲線. c＞180 μmol/L 的反應(yīng)孔在反應(yīng)10 min 后OD570保持不變，反應(yīng)穩(wěn)定;而c ＜160 μmol/L 時(shí)，反應(yīng)孔的OD570則在反應(yīng)45 min 內(nèi)變化較快，之后達(dá)到穩(wěn)定.此外，隨著反應(yīng)孔中所加入H2O2濃度的降低，反應(yīng)體系的OD570需要的穩(wěn)定時(shí)間明顯增加，與辨色結(jié)果中較低H2O2濃度反應(yīng)孔逐漸變紅的現(xiàn)象相吻合.

圖3 不同反應(yīng)時(shí)間下不同濃度H2O2 的穩(wěn)定情況Figure 3 Detection stability of different reaction time for different hydrogen peroxide concentrations

2.2.2 半胱甘肽對反應(yīng)體系的終止效果 為了方便下一步的檢測和量化分析，實(shí)驗(yàn)使用還原型半胱甘肽作為反應(yīng)體系的終止劑，以提高反應(yīng)體系的穩(wěn)定性. 由于還原型半胱甘肽對納米金顆粒表面具有較好的親和性，反應(yīng)體系中的半胱甘肽將附著于納米金表面，從而阻止了金顆粒的進(jìn)一步團(tuán)聚，終止反應(yīng). 反應(yīng)進(jìn)行10 min 后，向各反應(yīng)孔中加入10 μL的半胱甘肽溶液，所得不同反應(yīng)時(shí)間各反應(yīng)孔情況見圖4A. 加入半胱甘肽后，各反應(yīng)孔的辨色結(jié)果不再隨時(shí)間改變，c ＜100 μmol/L 的反應(yīng)孔保持藍(lán)色，c ＞120 μmol/L 的反應(yīng)孔保持紅色. 不同反應(yīng)時(shí)間各反應(yīng)孔的吸光度OD570變化曲線見圖4B. 加入半胱甘肽后，各反應(yīng)孔在反應(yīng)15 min 后的OD570基本不變，反應(yīng)穩(wěn)定，與辨色結(jié)果中各反應(yīng)孔顏色穩(wěn)定的現(xiàn)象相吻合. 實(shí)驗(yàn)表明，還原型半胱甘肽溶液可有效終止各孔的反應(yīng)，使納米金顆粒的狀態(tài)穩(wěn)定.

圖4 加入半胱甘肽后不同反應(yīng)時(shí)間下H2O2 的穩(wěn)定情況Figure 4 Detection stability of different reaction time with L-glutathione for different hydrogen peroxide concentrations

2.3 檢測結(jié)果吸收光譜及定量分析

為了精確定量H2O2濃度，實(shí)驗(yàn)使用紫外－可見－近紅外分光光度計(jì)測定不同H2O2濃度反應(yīng)孔生成物的吸收光譜(圖5A). c ＜100 μmol/L 的反應(yīng)孔產(chǎn)物在波長約550 nm 處有吸收峰，且吸收強(qiáng)度與c 成正相關(guān). 而c ＞120 μmol/L 的反應(yīng)孔產(chǎn)物吸收峰逐漸往短波長方向偏移，最終峰值約為540 nm.實(shí)驗(yàn)對各反應(yīng)孔產(chǎn)物在630 nm 和545 nm 處吸光度的比值(OD630/545)進(jìn)行分析，得到不同濃度H2O2的定量分析曲線(圖5B). 各反應(yīng)孔產(chǎn)物的OD630/545與c(μmol/L)呈良好的線性關(guān)系，其回歸方程為OD630/545=－0.003 02c+1.011 77.

圖5 不同濃度過氧化氫反應(yīng)孔的吸收光譜及定量分析Figure 5 Ultraviolet-visible spectra and linear relativity of regressive curves of OD630/545 for different H2O2 concentrations

2.4 裸眼分辨極限下的檢測分析

根據(jù)定量分析曲線，可有效地對裸眼分辨極限下的檢測樣品進(jìn)行定量分析. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了加入100、102、104、106、108、110、112、114、116、118 和120 μmol/L 過氧化氫的反應(yīng)孔，辨色結(jié)果見圖6. c =100 μmol/L 的反應(yīng)孔呈現(xiàn)藍(lán)色，c =120 μmol/L 的反應(yīng)孔呈現(xiàn)紅色，而中間濃度的反應(yīng)孔呈現(xiàn)從藍(lán)色過渡到紅色的辨色結(jié)果，裸眼難以區(qū)分. 實(shí)驗(yàn)中各反應(yīng)孔的吸光度OD630/545如圖7 所示，OD630/545與過氧化氫濃度c(μmol/L)呈良好的線性關(guān)系. 應(yīng)用OD630/545可精確定量H2O2濃度，降低裸眼檢測途徑下該方法的分辨極限.

圖6 不同濃度過氧化氫反應(yīng)孔的辨色圖(100 ～120 μmol/L)Figure 6 Photograph of nanoparticle solutions for different H2O2 concentrations (100 ～120 μmol/L)

圖7 裸眼分辨極限下不同濃度過氧化氫反應(yīng)孔吸光度OD630/545(100 ～120 μmol/L)Figure 7 OD630/545 for different H2O2 concentrations (100 ～120 μmol/L)beyond the limit of detecting resolution with naked eyes

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在酸性2-嗎啉乙磺酸介質(zhì)中，建立基于納米金表面等離子體的微量過氧化氫的檢測體系，其裸眼檢測H2O2極限可分辨濃度差為20 μmol/L.實(shí)驗(yàn)使用半胱甘肽有效終止反應(yīng)，提高了體系的穩(wěn)定性，并利用光譜分析精確定量H2O2濃度，降低裸眼檢測途徑下該方法的分辨極限. 該檢測方法操作簡單、靈敏度高，便于結(jié)合傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)，在微量生物分子檢測領(lǐng)域有廣闊應(yīng)用前景.

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