謝　珍劉　波　徐　彭　談偉鋒　周　年　曹　怡(江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)科組，江西　南昌　330004)

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二仙湯及其拆方對(duì)去卵巢大鼠更年期綜合征的影響

謝珍1劉波徐彭談偉鋒周年曹怡
(江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)科組，江西南昌330004)

〔摘要〕目的探討二仙湯及其拆方對(duì)去卵巢大鼠實(shí)驗(yàn)性更年期綜合征的影響。方法以卵巢摘除SD雌性大鼠為動(dòng)物模型，隨機(jī)分為模型組、二仙湯整方及其4個(gè)拆方組(二仙湯A方、B方、C方、D方、E方)，另設(shè)一組假手術(shù)組，連續(xù)給藥90 d，比較大鼠體重、血清性激素水平及胸腺、脾臟、子宮指數(shù)的變化，并對(duì)子宮進(jìn)行組織學(xué)觀察。結(jié)果A方可顯著抑制因摘除卵巢引起的體重升高(P＜0. 01);與模型組相比，A方、C方及E方能顯著提高大鼠的胸腺系數(shù)(P＜0. 05)，E方可使脾臟系數(shù)明顯升高(P＜0. 05)，C方能顯著升高促黃體生成素(LH)水平(P＜0. 05)，除B方外，其余各方均可明顯提高卵泡刺激素(FSH)水平。組織學(xué)方面，A方、E方可增加腺體數(shù)目，除A方外，其余各方均使內(nèi)膜增厚。結(jié)論二仙湯及其拆方緩解更年期綜合征的作用與從多環(huán)節(jié)調(diào)節(jié)生殖內(nèi)分泌功能有關(guān)，且各個(gè)拆方起著不同的調(diào)節(jié)作用，具有臨床指導(dǎo)意義。

〔關(guān)鍵詞〕二仙湯及其拆方;更年期綜合征;卵巢摘除

1浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院

第一作者:謝珍(1989-)，女，在讀碩士，藥師，主要從事內(nèi)分泌代謝藥理學(xué)研究。

二仙湯是上海中醫(yī)藥大學(xué)已故名醫(yī)張伯訥教授針對(duì)圍絕經(jīng)期綜合征研制的名方，主要由溫腎益精藥淫羊藿、仙茅、巴戟天，補(bǔ)血活血藥當(dāng)歸和滋陰降火藥知母、黃柏六味中藥組成〔1〕，其中淫羊藿、仙茅為君，巴戟天為臣，知母、黃柏為佐，當(dāng)歸為使，臨床上廣泛用于更年期綜合征、高血壓和絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的治療〔2〕。更年期綜合征是婦女絕經(jīng)后卵巢功能衰退導(dǎo)致的生殖系統(tǒng)萎縮、自主神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂的一組癥候群，是女性整體衰老的結(jié)果和早期表現(xiàn)。二仙湯的藥理研究涉及抗自由基作用〔3〕、增強(qiáng)下丘腦-垂體-性腺軸的功能〔4，5〕及提高免疫功能〔6〕等。二仙湯用于更年期綜合征的治療已經(jīng)證實(shí)，本研究依據(jù)君、臣、佐、使的配伍關(guān)系對(duì)二仙湯進(jìn)行拆方，研究二仙湯及其拆方對(duì)去卵巢大鼠體重、血清促黃體生成素(LH)、卵泡雌激素(FSH)、相關(guān)臟器指數(shù)及其組織學(xué)形態(tài)的影響，并比較各個(gè)拆方作用的不同。

1　材料與方法

1. 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雌性SD大鼠，6月齡，體重230～250 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào): SCXK(湘)2009-0004，室溫控制在20～22℃，恒濕，光照與環(huán)境一致，實(shí)驗(yàn)期間自由飲水，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食。

1. 2藥物飲片均購(gòu)自南昌昌幫中藥行，由江西中醫(yī)學(xué)院中藥鑒定學(xué)科組付小梅副教授鑒定為朝鮮淫羊藿，仙茅，巴戟天，當(dāng)歸，知母，黃柏。

1. 3儀器與試劑血清LH放射性免疫試劑盒(批號(hào): 20130101)、血清FSH放射性免疫試劑盒(批號(hào): 20130101)均購(gòu)自濰坊三維生物工程集團(tuán)有限公司; Access全自動(dòng)微粒子免疫化學(xué)發(fā)光儀(美國(guó)Bekman公司產(chǎn)品);手動(dòng)轉(zhuǎn)輪切片機(jī)、石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica公司產(chǎn)品);光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司產(chǎn)品)。

1. 4方法

1. 4. 1造模方法3%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，雙側(cè)背部切口，揭開(kāi)脂肪層，在卵巢和子宮交接處結(jié)扎，徹底切除兩側(cè)卵巢，逐層縫合皮膚。不做卵巢切除的大鼠則同樣切開(kāi)腹腔，揭開(kāi)脂肪層，將卵巢移出后復(fù)位，并不切除卵巢而縫合切口。手術(shù)第2天起進(jìn)行陰道涂片檢查，連續(xù)觀察10 d，1次/d，不出現(xiàn)規(guī)則動(dòng)情變化的大鼠為造模成功的大鼠，可供實(shí)驗(yàn)用。

1. 4. 2動(dòng)物分組共分為七組，其中篩選后的60只卵巢徹底切除的雌性大鼠，隨機(jī)分成六組，即模型組、二仙湯整方(A 方)及依據(jù)君、臣、佐、使配伍關(guān)系的二仙湯4個(gè)拆方組，即淫羊藿+仙茅(B方)、淫羊藿+仙茅+巴戟天(C方)、淫羊藿+仙茅+當(dāng)歸(D方)、淫羊藿+仙茅+知母+黃柏(E方)，每組10只，以未作卵巢切除雌性大鼠(10只)為假手術(shù)組。

1. 4. 3藥物的制備與給藥統(tǒng)一煎煮標(biāo)準(zhǔn)為加入4倍體積水浸沒(méi)藥材3～5 cm，浸泡30 min后，先用武火煮沸，再改用文火慢煎50 min(期間如水過(guò)少可多加一定比例的水)。按原方比例2∶2∶2∶2∶1∶1，拆方藥物劑量與原方劑量一致，劑量分別為含生藥8，3. 2，4. 8，4. 8，4. 8 g/kg，假手術(shù)組、模型組均灌服純凈水，二仙湯整方及拆方組分別灌服相應(yīng)的藥物煎煮液，每周稱(chēng)量體重，隨體重調(diào)整藥量，給藥容積均為10 ml/kg，連續(xù)給藥90 d。

1. 4. 4血清LH、FSH的測(cè)定3%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，4℃靜置4 h，3 000 r/min離心10 min，分離血清，－80℃保存，分別用血清LH、FSH放射性免疫試劑盒，在Access全自動(dòng)微粒子免疫化學(xué)發(fā)光儀免疫分析系統(tǒng)上測(cè)定LH、FSH水平。

1. 4. 5臟器系數(shù)的測(cè)定及組織形態(tài)學(xué)觀察取血后，解剖取出胸腺、脾臟及子宮，精確稱(chēng)重后，子宮放入10%甲醛溶液中固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋、脫蠟、切片(片厚4 μm)、蘇木精-伊紅染色、封片，在顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1. 5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS20. 0統(tǒng)計(jì)軟件，行單因素方差分析。

2　結(jié)果

2. 1二仙湯及其拆方對(duì)大鼠體重的影響大鼠摘除卵巢恢復(fù)性飼養(yǎng)1 w后，各組動(dòng)物體重均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，E方動(dòng)物體重增長(zhǎng)最為明顯，至給藥后第4、8、12周，雙側(cè)卵巢摘除致大鼠體重明顯增加，與假手術(shù)組相比均有極顯著差異(P＜0. 01)，其中在給藥后第8周，A方大鼠體重與模型組相比顯著降低(P＜0. 01)，其他各組與模型組均無(wú)差異。見(jiàn)表1。

2. 2二仙湯及其拆方對(duì)大鼠臟器系數(shù)的影響與假手術(shù)組相比，模型組的子宮顯著降低(P＜0. 01)，可見(jiàn)大鼠去卵巢后子宮明顯萎縮，脾臟系數(shù)也有下降的趨勢(shì)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但胸腺系數(shù)略微升高。與模型組相比，A方能使胸腺系數(shù)升高34%(P ＜0. 01)，C方及E方可使其升高26%、20%(P＜0. 05);脾臟系數(shù)方面，E方可使其顯著升高(P＜0. 05);整方及各個(gè)拆方均可不同程度的提高子宮系數(shù)，但無(wú)顯著差異，其中A方和C方效果較好。見(jiàn)表2。

表1　大鼠術(shù)后3個(gè)月體重變化(x ±s，n=10，g)

與假手術(shù)組比較: 1)P＜0．01;與模型組比較: 2)P＜0．01

2. 3二仙湯及其拆方對(duì)大鼠血清LH、FSH的影響與假手術(shù)組相比，模型組的血清LH水平大幅升高(P＜0. 01)，而FSH下降了56%(P＜0. 05)。與模型組相比，除A方和B方使LH有下降的趨勢(shì)，分別為6%、27%，其余各方均可使其提高，其中C方有顯著性(P＜0. 05);而除B方外，治療組的FSH均呈極顯著性提升，其中A方和E方的FSH水平與假手術(shù)組相比較為接近，B方可使其比假手術(shù)組降低39%。見(jiàn)表2。

2. 4二仙湯及其拆方對(duì)大鼠胸腺、子宮組織形態(tài)學(xué)的影響假手術(shù)組:大鼠的子宮管壁較厚，內(nèi)膜下分布有大量的腺體，形態(tài)規(guī)則，腺腔大小不等，腺上皮以單層柱狀細(xì)胞為主;去卵巢模型組大鼠子宮體積變小，管壁明顯變薄，內(nèi)膜下腺體減少，腺腔萎縮，血管擴(kuò)張; A方:固有層腺體和血管豐富，與假手術(shù)組相近，上皮細(xì)胞排列較緊密; B方:內(nèi)膜增厚明顯，腔面呈波浪狀，腺上皮細(xì)胞增高且相互擁擠，腺體稀少; C方:內(nèi)膜增厚明顯，纖毛長(zhǎng)而密，腺腔擴(kuò)張，腺體間質(zhì)細(xì)胞肥大，胞質(zhì)多; D方:內(nèi)膜增厚程度與C方相似，表層上皮細(xì)胞高柱狀游離，部分有被覆纖毛; E方:內(nèi)膜顯著增厚，內(nèi)膜上皮細(xì)胞排列整齊且緊密，腺體多，彎曲度增加。見(jiàn)圖1。

表2　各組大鼠胸腺、脾臟、子宮臟器系數(shù)及血清性激素水平的比較(x±s，n=10)

圖1　各組大鼠子宮組織形態(tài)的比較(HE，×200)

3　討論

更年期綜合征是因性激素分泌量減少，產(chǎn)生以自主神經(jīng)功能失調(diào)為主的一系列癥狀，內(nèi)分泌異常是其主要的特征。本文結(jié)果顯示大鼠摘除卵巢后，體重增長(zhǎng)與假手術(shù)組相比速度加快，其中A方可顯著抑制因卵巢摘除引起的體重增長(zhǎng)(P＜0. 01)，說(shuō)明二仙湯整方在調(diào)節(jié)更年期體重變化方面有重要意義。

胸腺是中樞性免疫器官，是T淋巴細(xì)胞分化成熟的場(chǎng)所，脾臟是人體中最大的淋巴器官，含有大量的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，是機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的中心〔6〕。本研究發(fā)現(xiàn)造模后大鼠的胸腺系數(shù)較假手術(shù)組有升高的趨勢(shì)，脾臟系數(shù)則下降，而經(jīng)治療后，各組的胸腺系數(shù)及脾臟系數(shù)均有不同程度的升高，其中A方、C方及E方可顯著提高胸腺系數(shù)，E方能使脾臟系數(shù)升高19%，提示二仙湯A方、C方及E方可以通過(guò)提高去卵巢大鼠的胸腺或脾臟系數(shù)來(lái)增強(qiáng)其免疫功能。

FSH、LH均由腺垂體分泌，其中FSH的主要作用為促進(jìn)卵泡成熟，并可促進(jìn)新細(xì)胞合成FSH受體;而LH作用于成熟的卵泡，引起排卵并生成黃體。由于卵巢摘除導(dǎo)致的雌激素不足，使下丘腦-垂體-卵巢軸之間的平衡失調(diào)，對(duì)下丘腦-垂體不能進(jìn)行有效的負(fù)反饋而致使FSH、LH含量升高〔7〕，本文中LH與之符合，而模型組的FSH與假手術(shù)組相比顯著下降，可能與以下因素有關(guān):體內(nèi)雌激素在正常情況下大部分由卵巢分泌，但也存在非性腺器官的分泌，可對(duì)垂體產(chǎn)生負(fù)反饋來(lái)抑制FSH的分泌，且垂體FSH的釋放受卵巢激素的反饋抑制較LH敏感，此外，實(shí)驗(yàn)采用6月齡的大鼠作為受試對(duì)象，此月齡大鼠正處于壯年時(shí)期，內(nèi)分泌器官正處于功能旺盛階段，卵巢的摘除可作為一種刺激，可引起機(jī)體神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的應(yīng)激反應(yīng)，各系統(tǒng)功能的整合可能會(huì)激活其他內(nèi)分泌腺的代償性功能增強(qiáng)，如腎上腺皮質(zhì)等〔8〕，分泌產(chǎn)生更多的雌激素來(lái)對(duì)垂體形成負(fù)反饋。本文顯示君藥B方在降低FSH、LH水平方面藥力最為強(qiáng)烈，有君藥與佐藥組成的E方作用略緩和，提示可減緩君藥的烈性。

本研究結(jié)果表明各方均可不同程度的提高子宮系數(shù)，提示有緩解子宮萎縮的作用。還可改善去卵巢大鼠子宮的一些病理改變，且有不同的側(cè)重點(diǎn)，A方和E方可明顯增加腺體數(shù)目，B方、C方、D方及E方可使內(nèi)膜增厚，顯示出改善子宮內(nèi)膜狀態(tài)，維持內(nèi)膜及腺體生長(zhǎng)的作用，即二仙湯及其拆方具有一定營(yíng)養(yǎng)子宮并改善其功能的作用。

綜上，二仙湯及其抗拒方可從多方面對(duì)生殖內(nèi)分泌功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，使得機(jī)體的內(nèi)環(huán)境達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，且各個(gè)拆方作用的靶點(diǎn)不同，拆方的這種作用靶點(diǎn)的不同可提高用藥針對(duì)性，為臨床上二仙湯用于更年期綜合征的治療提供指導(dǎo)意義。

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〔2014-06-25修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)

通訊作者:劉波(1972-)，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事內(nèi)分泌代謝藥理學(xué)研究。

基金項(xiàng)目:江西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No．20151BAB205072; No．20114BAB205073);江西省科技計(jì)劃項(xiàng)目(No．20122BBG70090-1);江西省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研項(xiàng)目(No．2011A142; No．2012A031)

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2015)20-5691-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 006

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R285. 5