韋日明　李統(tǒng)四郭亞芬杜　森　夏春波　(桂林醫(yī)學(xué)院，廣西　桂林　54004)

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海馬認(rèn)知障礙對血脂水平的影響及其與肝臟HMG-CR表達(dá)的關(guān)系

韋日明李統(tǒng)四1郭亞芬2杜森夏春波(桂林醫(yī)學(xué)院，廣西桂林541004)

〔摘要〕目的探討海馬認(rèn)知障礙對血脂水平的影響及其與肝臟3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG-CR)表達(dá)的關(guān)系。方法采用Aβ1～42大鼠海馬內(nèi)注射構(gòu)建認(rèn)知障礙模型，全自動生化分析儀檢測血脂水平，半定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)檢測肝臟HMG-CR mRNA的表達(dá)，蛋白印跡法檢測肝臟HMG-CR的表達(dá)。結(jié)果①實驗組大鼠甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)分別為(2. 30± 0. 08)mmol/L、(4. 60±0. 10)mmol/L、(2. 41±0. 06)mmol/L，與假手術(shù)組和對照組相比均顯著升高(P＜0. 05)。②實驗組大鼠肝臟HMG-CR mRNA表達(dá)水平為0. 49±0. 03，明顯高于假手術(shù)組和對照組(P＜0. 05)。③實驗組大鼠肝臟HMG-CR表達(dá)水平為0. 50±0. 02，顯著高于假手術(shù)組與對照組(P＜0. 05)。結(jié)論海馬認(rèn)知障礙可引起大鼠血脂水平升高，其機制可能與認(rèn)知障礙大鼠肝臟HMG-CR表達(dá)水平升高有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕認(rèn)知功能障礙;脂代謝; 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶

1岑溪市中醫(yī)醫(yī)院2廣西大學(xué)

第一作者:韋日明(1978-)，男，講師，廣西大學(xué)在讀碩士，主要從事分子生物學(xué)的基礎(chǔ)應(yīng)用和疾病動物模型的研究。

大腦海馬與認(rèn)知功能的關(guān)系一直是研究熱點〔1〕，但對內(nèi)臟活動的影響知之甚少。臨床上，老年癡呆患者常常伴有代謝水平異常，高達(dá)81%的散發(fā)性老年癡呆患者有不同程度的代謝異?！?〕。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG-CR)是脂代謝的關(guān)鍵酶，為深入揭示認(rèn)知功能障礙對血脂代謝的影響及其發(fā)生機制，本研究通過制備認(rèn)知障礙模型，分析血脂水平變化與肝臟HMG-CR表達(dá)水平的關(guān)系。

1　材料與方法

1. 1實驗材料與試劑30只健康SD大鼠(雌雄不分，200～250 g)，由桂林醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，合格證號: SCXK桂2007-000。β淀粉樣蛋白(Aβ1～42)購自美國Sigma公司，總RNA提取試劑盒以及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均為TaKaRa公司產(chǎn)品，HMG-CR、β-actin引物序列由invitrogen公司設(shè)計并合成，HMGCR上游引物: 5＇-CCTTCTACCTCAGCAAGCCT-3＇，下游引物: 5＇-GATGCTCAAGCTGCCTTC T-3＇，產(chǎn)物為243 bp;β-actin上游引物: 5＇-GAGGGAAATCGTGCGTGAC-3＇，下游引物: 5＇-CTGGAAGGTGGACAGTGAG-3＇，產(chǎn)物為445 bp。HMG-CRpAb、β-actinpAb 為Bioworld Technology公司產(chǎn)品，辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1. 2大鼠認(rèn)知障礙模型制備及實驗分組30只健康SD大鼠隨機分成三組，每組10只。將大鼠腹腔麻醉(10%水合氯醛，3 ml/kg)，頭部備皮，參照《大鼠腦立體定位圖譜》將大鼠固定于腦立體定位儀上，沿其頭頂切開長約1 cm的縱形切口，分離骨膜，牙科鉆在右側(cè)海馬上方(前囟后3. 8 mm，右旁開2. 2 mm)打孔。實驗組:微量注射器進(jìn)針2. 9 mm海馬內(nèi)注射Aβ1～4215 μg;假手術(shù)組:注射等體積磷酸鹽緩沖液(PBS);對照組:不作任何處理。Morris水迷宮實驗檢測大鼠認(rèn)知功能，以大鼠逃避潛伏期、在原平臺象限時間百分比、跨越平臺次數(shù)三項指標(biāo)中的任意兩項與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義評定為認(rèn)知功能障礙。

1. 3大鼠血脂水平的檢測大鼠飼養(yǎng)45 d后，腹腔麻醉，胸部備皮，1 ml注射器心臟取血約0. 8～1 ml，分離血漿，全自動生化分析儀檢測甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平。

1. 4大鼠肝臟組織樣本采集大鼠腹腔麻醉，腹部備皮，打開腹腔并剪取部分肝臟組織，快速放入液氮中，12 h后將大鼠肝臟組織從液氮中轉(zhuǎn)移至－80℃冰箱備用。

1. 5 RT-PCR法測定肝臟HMG-CR mRNA的表達(dá)水平在液氮中充分研磨肝臟組織，利用TaKaRa總RNA提取試劑盒提取樣本總RNA，紫外分光光度計檢測總RNA的純度和濃度，TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為穩(wěn)定的cDNA，運用HMG-CR引物和β-actin引物進(jìn)行PCR擴增，反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃2 min，變性94℃30 s、退火63℃30 s、延伸72℃30 s共32個循環(huán)，終延伸72℃2 min。1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，全自動數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，并分析。

1. 6 Western印跡法測定肝臟HMG-CR的表達(dá)水平在液氮中充分研磨肝臟組織至粉末狀，加入蛋白組織細(xì)胞裂解液(RIPA)中15 min，離心并取上清，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒檢測組織蛋白質(zhì)濃度，制備上樣蛋白樣本，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂牛奶封閉，孵育HMG-CR(β-actin)一抗，Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜，孵育二抗，TBST洗膜，PVDF膜發(fā)光，測定蛋白條帶灰度值，并分析。

1. 7統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS17. 0軟件行單因素方差分析。

2　結(jié)果

2. 1各組大鼠血脂水平比較大鼠飼養(yǎng)45 d后，表現(xiàn)為體型偏瘦、行動遲鈍、毛發(fā)淡黃且粗糙:實驗組大鼠TG、TC、LDL-C均明顯高于假手術(shù)組和對照組(P＜0. 05)，HDL-C水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0. 05)。見表1。

2. 2各組大鼠肝臟HMG-CR mRNA的表達(dá)情況實驗組大鼠肝臟HMG-CR mRNA表達(dá)水平為0. 49±0. 03，明顯高于假手術(shù)組與對照組(分別為0. 24±0. 02和0. 22±0. 01)(P＜0. 05)，假手術(shù)組與對照組相比無明顯變化(P＞0. 05)。見圖1。

2. 3各組大鼠肝臟HMG-CR的表達(dá)情況實驗組大鼠肝臟HMG-CR的表達(dá)水平為0. 50±0. 02，明顯高于假手術(shù)組(0. 28±0. 02)與對照組(0. 27±0. 03)(P＜0. 05)，假手術(shù)組與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0. 05)。見圖2。

表1　各組大鼠血脂水平(x ±s，mmol/L，n=10)

圖1　肝臟HMG-CR mRNA的表達(dá)

圖2　肝臟HMG－CR的表達(dá)

3　討論

老年癡呆也稱作阿爾茲海默病(AD)，其主要特征為記憶缺失、認(rèn)知損害和人格改變，并逐漸進(jìn)展為嚴(yán)重認(rèn)知障礙。AD與脂代謝關(guān)系密切，有研究表明〔3〕，AD患者體內(nèi)HDL與TC水平呈動態(tài)表達(dá)。黃德弘等〔4〕對51例AD、43例血管性癡呆(VD)以及30例正常人血脂檢測發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，AD與VD患者血清TC、LDL-C、TG水平顯著升高。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，AD患者與正常人相比，TC、LDL、TG水平明顯升高〔5〕。另有報道〔6〕，認(rèn)知障礙大鼠海馬神經(jīng)元凋亡增加，且TC、TG、LDL水平顯著升高，推測AD大鼠導(dǎo)致脂代謝異常與海馬神經(jīng)元凋亡增加有關(guān)。本實驗也提示大鼠認(rèn)知功能障礙可能會引起血脂水平升高。

HMG-CR是脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶〔7〕，蛋白激酶可以催化HMG-CR發(fā)生磷酸化從而失去活性。胰高血糖素通過影響蛋白激酶的活性，促使HMG-CR磷酸化，降低膽固醇的合成，而胰島素則可以通過增加HMG-CR的去磷酸化，提高HMG-CR水平及活性，促進(jìn)膽固醇的合成。本實驗推測認(rèn)知障礙大鼠血脂水平升高可能與肝臟HMG-CR表達(dá)升高有關(guān)，但認(rèn)知障礙大鼠肝臟HMG-CR表達(dá)升高的機制尚不清楚。

海馬在大腦邊緣系統(tǒng)中占有重要的地位，海馬神經(jīng)元凋亡可以促進(jìn)認(rèn)知功能障礙的發(fā)生發(fā)展。海馬神經(jīng)元與周圍神經(jīng)核團(tuán)廣泛聯(lián)系，如下丘腦室旁核(PVN)、前腦終紋床核(BNST)、杏仁核等。下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸(HPA軸)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)參與內(nèi)臟調(diào)節(jié)主要通路，HPA軸的激活點位于PVN。研究表明〔8〕，海馬可以通過HPA軸參與機體的調(diào)節(jié)。此外，Guan等〔9〕通過運用顯微注射器海馬內(nèi)注射胃動素研究發(fā)現(xiàn)，海馬可以影響胃腸蠕動，并且海馬CA3區(qū)的神經(jīng)元對胃擴張敏感，而膈下迷走神經(jīng)切斷幾乎可以完全阻斷海馬對胃腸動力的影響，提示海馬與迷走-迷走神經(jīng)反射通路之間具有功能性的相互作用。另有研究表明〔10〕，海馬可以通過自主神經(jīng)參與機體的代謝調(diào)節(jié)。

綜上，海馬可能會通過多種神經(jīng)傳導(dǎo)通路參與機體代謝調(diào)節(jié)，推測在本實驗中肝臟HMG-CR表達(dá)水平升高可能與認(rèn)知障礙大鼠海馬神經(jīng)元受損有關(guān)。

4參考文獻(xiàn)

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6杜森，夏春波，葉琳，等.大鼠海馬認(rèn)知障礙對糖脂代謝的影響及其與海馬神經(jīng)元凋亡的關(guān)系〔J〕．中國老年學(xué)雜志，2015; 35(4): 1000-1.

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〔2015-02-11修回〕

(編輯袁左鳴)

The effects of cognitive impairment in hippocampus on lipid levels and its relations with the expression of HMG-CR in liver

WEI Ri-Ming，LI Tong-Si，GUO Ya-Fen，et al．
Guilin Medical University，Guilin 541004，Guangxi，China

【Abstract】Objective To investigate the effects of cognitive impairment in hippocampus on lipid levels and its relations with the expression of HMG-CR in liver．Methods The Aβ1～42was injected into the hippocampus of rats to build cognitive impairment model，automatic biochemical analyzer were used to detect lipid levels，the expression of HMG-CRmRNA in liver was detected by RT-PCR，the expression of HMG-CR in liver was detected by Western blot．Results①In experimental group，the levels of total triglyceride(TG)，total cholesterol(TC)，low-density lipoprotein(LDL)were significantly higher than those of sham and control groups(P＜0．05)．②The expression of HMG-CR mRNA in liver of experimental group was significantly increased comparing with that of control and sham groups(P＜0．05)．③The expression of HMG-CR in liver of experimental group was significantly increased comparing with that of control and sham groups(P＜0．05)．Conclusions

Cognitive impairment in hippocampus could cause lipid levels elevating，which might be related to the increasing of the expression of HMGCR in liver．

【Key words】Cognitive impairment; Lipid metabolism; HMG-CR

通訊作者:夏春波(1977-)，男，碩士生導(dǎo)師，副教授，主要從事認(rèn)知障礙與代謝疾病的研究。

基金項目:國家自然科學(xué)基金資助項目(No．81260137)

〔文章編號〕1005-9202(2015)20-5683-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 002

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔中圖分類號〕R338. 2+6