張麗紅 , 劉艷芳 胡青平

(1.山西師范大學 生命學院, 山西 臨汾 041004; 2.中國農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室, 北京100083)

生物固氮是氮素循環(huán)的重要環(huán)節(jié), 為整個生物圈提供了重要的氮素營養(yǎng)源。生物固氮反應是一種極其溫和及零污染排放的生化反應, 它與人類發(fā)明的化學固氮相比有著無比優(yōu)越性, 固氮微生物的深入研究、開發(fā)和利用, 有利于發(fā)展生態(tài)農(nóng)業(yè), 達到土地可持續(xù)利用的戰(zhàn)略目標[1]。在生物固氮中, 大約40%的氮源由海洋固氮生物完成, 60%的氮源由陸生固氮生物完成。人們已對多個海域(阿拉伯海、紅海、太平洋、中國南海、大西洋)進行了固氮微生物多樣性的分析[2-4], 結(jié)果顯示海洋中固氮微生物多集中于海洋沉積物中。目前文獻報道的海洋固氮微生物包括三大類: 異養(yǎng)細菌類、光合細菌類以及藍藻類[5-7]。2012年, Farnelid等[8]對海洋固氮微生物群落固氮酶基因庫信息全面分析后提出: 海洋中占固氮微生物總數(shù) 42%的微生物群落屬于非藍藻細菌。這一結(jié)果表明在海洋生態(tài)系統(tǒng)中非藍藻細菌發(fā)揮著不可低估的固氮作用。海洋中已報道的異養(yǎng)固氮細菌包括克氏桿菌屬(Klebsiella)、固氮菌屬(Azotobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、梭菌屬(Clostridium)、產(chǎn)氣腸桿菌屬(Enterobacter)、弧菌屬(Vibrio)等屬中的一些種[9]。

南海是僅次于阿拉伯海和珊瑚海的世界第三大陸緣海, 是海洋資源非常豐富的地區(qū)之一。迄今, 有關分離培養(yǎng)南海固氮菌的報道并不多見[10], 本研究采集南海底泥樣品并采用煮沸淤泥樣品結(jié)合無氮培養(yǎng)基富集培養(yǎng)的方法進行初篩, 進一步通過固氮酶分子標記及固氮酶活性檢測進行復篩, 最終獲得一株固氮菌。對所獲菌株形態(tài)特征、生理生化指標及16S rDNA序列等結(jié)果進行分析確定其分類地位。這一研究為海洋自生固氮菌的多樣性提供了新的證據(jù)。

1 材料和方法

1.1 固氮類芽孢桿菌的分離

1.1.1 海底淤泥樣品的采集及處理

底 泥 樣 品 采 自 南 海 東 經(jīng) 110°51′227′′, 北 緯20°42′193′′; 水深 29 m 處(pH 8.30); 采集的樣品封口于測序袋后并立即置于冰盒內(nèi)(定期更換冰盒), 帶回實驗室后, 儲存在4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基

無氮培養(yǎng)基: 用于分離、純化固氮菌。2% (w/v)蔗糖; 1.2% (w/v) 磷酸氫二鉀; 0.34% (w/v) 磷酸二氫鉀; 0.05%(w/v) 硫酸鎂; 0.001% (w/v) 氯化鈉; 0.0015%(w/v) 氯化鐵; 0.0005%(w/v) 鉬酸鈉; 1.2%~1.4%(w/v) 瓊脂粉; pH 7.0。

限氮培養(yǎng)基: 用于測定固氮酶活性。1000 mL ddH2O 中溶解 26.3 g Na2HPO4?12H2O; 3.4 g KH2PO4;10 μg 生物素; 26 mg CaCl2?2H2O; 30 mg MgSO4;0.33 mg MnSO4?H2O; 36 mg 檸 檬 酸 鐵 ; 7.6 mgNa2MoO4?2H2O; 10 μg 對氨基苯甲酸; 4 g 葡萄糖; 谷氨酸終濃度為2 mmol/L。

1.1.3 分離方法

稱取適量淤泥樣品以1/10比例加入液體無氮培養(yǎng)基中, 30℃富集培養(yǎng)1 h。系列梯度稀釋后于沸水中煮沸 10 min, 以期獲得能產(chǎn)芽孢的菌株(期間搖動3~5次), 每個稀釋度各取 100μL涂布于無氮平板中,于30℃培養(yǎng)3 d。挑取單菌落多次劃線純化后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 菌株的鑒定

將菌株接種到LB培養(yǎng)基, 30℃培養(yǎng)過夜, 利用光學顯微鏡觀察革蘭氏染色結(jié)果; 利用電子顯微觀察細菌的大小、形態(tài)特征; 各項生理生化指標的測定參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[11]和《微生物學實驗》[12]進行。

1.3 nifH基因的擴增

采用菌落 PCR方法, 以固氮菌Paenibacillus sophoraeS27T(DSM23020T)為陽性對照(菌株由中國農(nóng)業(yè)大學陳三鳳教授提供), 檢測固氮酶保守基因nifH。引物(PolF/PolR)參照參考文獻[13]。具體序列如下: PolF 5′-3′TGCGAYCCSAARGCBGACTC; PolR 5′-3′ATSGCCATCATYTCRCCGGA, 擴增產(chǎn)物約 360 bp。擴增體系 20 μL, 組成如下: 10×PCR緩沖液 2 μL,dNTP 混合物(10 mmol/L)0.5 μL, 引物各 0.5 μL, Tap酶1~2 U, 菌落少許, 無菌水16.5μL。充分混勻。擴增程序: 95℃ 10 min; 95℃ 30 s; 55℃ 30 s; 72℃ 30 s。30個循環(huán); 72℃ 10 min。用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物。將符合測序要求的PCR產(chǎn)物送北京博邁德公司測序, 序列相似性分析使用軟件 DNAMAN完成; 基因比對通過NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST在線完成。

1.4 菌株16S rDNA的PCR擴增

引物: 采用 通 用引物 對 27F (5′-3′TACGGCTACCTTGTTACGACTT)以及 1492R(5′-3′AGA-GTT TGATCCTGGCTCAG)進行擴增, 擴增產(chǎn)物約1.5 kb。擴增體系為50μL, 反應條件如下: 95℃ 5 min, 94℃1 min, 50℃ 1 min, 72℃ 2 min, 30 個循環(huán), 72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物凝膠系統(tǒng)檢測后送北京博邁德公司測序。序列相似性分析及基因比對方法同上。

1.5 固氮酶活性的檢測

根據(jù) Aranibar等[14]測定固氮菌酶活性的方法,將活化菌株接種到液體培養(yǎng)基LB中, 于30℃搖床振蕩培養(yǎng)過夜, 用無菌去離子水清洗3遍后, 限氮培養(yǎng)基調(diào)整OD600=0.3左右, 分別取1 mL菌液加入滅菌的26 mL的厭氧管中, 反復抽充N2后, 用注射器注入?yún)捬豕苁Ｓ囿w積的10%的乙炔, 30℃振蕩培養(yǎng), 每隔2 h, 從厭氧管中取100 μL氣體, 采用氣相色譜儀測定固氮酶活性(負對照為未接種的管, 固氮菌P.sophoraeS27T菌株為正對照)。固氮酶活[nmol/(mg·h)]的計算公式為:

1.6 序列比對及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

nifH與 16S rDNA基因序到 GenBank數(shù)據(jù)庫,BLASTN在線比對同源序列, 從 GenBank數(shù)據(jù)庫下載與提交序列相似性較高的基因序列。使用DNAMAN、MEGA5軟件中ClustalX功能比對序列,鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹, bootstrap值設為1000。

2 結(jié)果

2.1 類芽孢固氮菌的分離和篩選

2.1.1 固氮菌的分離

經(jīng)過富集培養(yǎng)、從南海底泥中分離到30株能在無氮培養(yǎng)基上生長的菌株, 進一步分離純化后, 保存?zhèn)溆?。?0株菌株進行固氮菌保守基因nifH的擴增, 進一步進行復篩。被測試菌株菌落邊緣整齊, 圓形扁平, 呈乳白色, 表面比較光滑、濕潤。

2.1.2 固氮酶基因nifH的擴增及系統(tǒng)發(fā)育分析

nifH是固氮微生物的“分子標記”。目前, 固氮微生物分子水平的檢驗主要集中在nifH。用nifH兼并引物對挑選得到的30株菌進行了PCR擴增, 結(jié)果只從7株菌株中擴增到目的基因nifH, 7株菌株編號分別為: NH-1、NH-3、NH-9、NH-15、NH-21、NH-24及NH-30(圖1)。將PCR產(chǎn)物進行回收測序, 對測序結(jié)果進行分析。通過DNAMAN軟件分析, 7株菌株之間nifH同源性達到 99%以上, 因此, 后續(xù)試驗選擇其中一株NH-1作為代表菌株。根據(jù)其DNA序列推測的氨基酸序列, GenBank在線比對分析表明,NH-1的nifH與其他已知固氮菌的nifH具有較高的同源性(同源性 70%以上)。從 NCBI數(shù)據(jù) GenBank中下載相關菌株的nifH序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹, 結(jié)果如圖2所示。以上結(jié)果表明, 該菌基因組中確實存在固氮保守基因nifH。nifH基因序列已上傳至 NCBI數(shù)據(jù)庫中(GenBank登錄號KJ627375)。

2.1.3 固氮酶活性測定

根據(jù) Aranibar等[14]測定固氮菌酶活性的方法,對該菌株固氮酶活性進行了測定, 結(jié)果如下: 陽性菌株 S27T的固氮酶活為 283.3±33.1[nmol C2H4/(mg蛋白/h)], 該菌株固氮酶活為 897.4±11.8 [nmol C2H4/ (mg蛋白/h)], 最終確定該菌株具有固氮能力。

圖1 nifH PCR擴增圖Fig.1 Amplification of the nifH gene of the isolates

2.2 菌株NH-1的表型特征

菌株NH-1為桿狀, 大小(0.5~0.7) μm×(1.5~2.5) μm,革蘭氏染色為陽性, 能運動, 端生鞭毛(圖3), 產(chǎn)芽孢(圖4)。其生理生化特性見表1所示。

2.3 菌株NH-1 16S rDNA序列PCR擴增及系統(tǒng)發(fā)育分析

菌株NH-1 16S rDNA序列的測定結(jié)果已上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫中(GenBank登錄號KJ627376)。將序列導入 NCBI數(shù)據(jù)庫, 利用 BLAST在線比對, 結(jié)果顯示菌株 NH-1與固氮類芽孢桿菌屬模式菌株Paenibacillus stellifer的 16S rDNA 同源關系最近(達到99%)。從GenBank中選出與NH-1同源性較高的10株菌株的16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹(圖5)。結(jié)果顯示, NH-1在進化樹中與Paenibacillus stellifer的親緣關系最近。根據(jù)固氮菌NH-1的形態(tài)特征、生理生化特性、固氮酶活性及16S rDNA序列分析, 將篩選到的產(chǎn)芽孢固氮菌定名為Paenibacillussp.NH-1。

圖2 NH-1 nifH系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of nifH gene of NH-1 and other diazotrophic bacteria

圖3 NH-1菌株鞭毛透射電鏡圖Fig.3 Transmission electron microscopic image showing the flagellum of strain NH-1

圖4 菌株NH-1芽孢掃描電鏡圖Fig.4 Scanning electron microphotograph of the isolate NH-1

表1 固氮類芽孢桿菌Paenibacillus sp.NH-1生理生化特征Tab.1 Morphological and biochemical characteristics of the isolate NH-1

3 討論及結(jié)論

盡管人類已從多種環(huán)境中分離得到了固氮菌,但是到目前為止, 仍然有許多的固氮菌在實驗條件下無法成功培養(yǎng)。所有固氮生物的鐵蛋白均由nifH基因編碼, 因此, 研究人員往往通過對nifH的分析來了解環(huán)境中固氮微生物的生物多樣性及進化地位。目前, 海洋環(huán)境中異養(yǎng)固氮細菌的多樣性研究大多集中在固氮酶保守基因nifH水平的檢測上。1993年, 在對芽孢桿菌屬51個種的16S rDNA序列比對后, 類芽孢桿菌(Paenibacillus)被單獨分離出來形成一個新屬[15]。該屬細菌是一類 GC含量較低、能產(chǎn)芽孢, 兼性厭氧生長的革蘭氏陽性細菌。到2013年統(tǒng)計為止, 該屬已經(jīng)包括100多個種和兩個亞種, 其中19個種被確定為固氮菌[15-18]。固氮類芽孢菌純培養(yǎng)物的報道多見于陸地土壤, 海洋中的報道并不多見。Steward等[19]利用固氮酶基因nifH檢測技術(shù)對加利福尼亞高鹽度莫諾湖水進行固氮菌多樣性的分析研究, 結(jié)果顯示該環(huán)境中存在有固氮類芽孢桿菌;Choi等[20]從韓國東海海底淤泥中分離到一株能夠降解木聚糖的菌株Paenibacillus donghaensissp.Nov.,在DNA水平檢測到固氮酶基因nifH后, 初步確定該菌株具有固氮作用。此外, Dang等[21]利用固氮酶基因nifH擴增技術(shù)對中國南海北部固氮細菌進行研究,結(jié)果表明該海洋同樣分布有固氮類芽孢桿菌。由于這些固氮類芽孢菌的確認都是基于基因水平, 并未檢測到它們的具體固氮酶活性, 因此, 無法比較這些菌株與本實驗中分離得到的純培養(yǎng)物 NH-1之間固氮酶活性的差異。本實驗利用純培養(yǎng)技術(shù)分離得到 NH-1, 通過固氮酶活性檢測、形態(tài)觀察、生理生化測定、系統(tǒng)發(fā)育分析等, 最終確定該菌株為固氮類芽孢菌。這一實驗結(jié)果與Dang等[21]研究結(jié)果保持一致, 進一步豐富了海洋中固氮菌的多樣性。

隨著海洋固氮生物多樣性的深入研究, 人們發(fā)現(xiàn)海洋自生固氮菌的多樣性遠遠超出人類之前的認識。固氮菌的開發(fā)和研究對充分發(fā)揮生物固氮在農(nóng)業(yè)中的作用具有十分重要的理論意義和實踐價值[22-24]。自生固氮微生物因其獨立生活條件下就能實現(xiàn)固氮而成為研究生物菌肥的熱點。固氮類芽孢菌在微生物菌劑方面有著巨大的開發(fā)潛能和利用價值。目前已知的固氮類芽孢桿菌種類較少, 因此不同環(huán)境中固氮類芽孢桿菌的篩選, 對科學研究和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有著十分重要的意義。

圖5 NH-1 16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of 16S rRNA gene of NH-1 and those of other bacteria

致謝:感謝中國農(nóng)業(yè)大學國家重點實驗室李穎教授為本實驗提供的南海海底淤泥樣品; 感謝中國農(nóng)業(yè)大學國家重點實驗室陳三鳳教授對本實驗酶活性測定提供的幫助。

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