鐘占瓊 馬鵬云 曾 茜 張 婷 楊 拯 王廷華 張 曉△

1（成都醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心，成都610500）

2（四川大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院 神經(jīng)疾病研究室，成都610041）

3（昆明醫(yī)科大學(xué) 神經(jīng)科學(xué)研究所，昆明650504）

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是一種致殘率高的脊柱脊髓疾患，嚴(yán)重威脅到人類健康、影響人們的生活及就業(yè)情況。SCI所引起的并發(fā)癥也是臨床治療上的一大難點(diǎn)，往往會(huì)出現(xiàn)炎癥，細(xì)胞凋亡，感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)功能降低或消失等一系列的變化。因此，脊髓損傷后，減少并發(fā)癥可能會(huì)成為治療脊髓損傷的關(guān)鍵步驟之一。

磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白1（PEBP1）是一種廣泛表達(dá)的具有高度保守的特殊調(diào)控因子。PEBP蛋白家族已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)20多年。PEBP家族共有4個(gè)亞類，包括PEBP1-4。其中，PEBP1又稱RKIP，在人體的心、肺、腦、肝和睪丸等組織中的胞質(zhì)與胞膜中表達(dá)。PEBP家族參與多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)。PEBP1 是 Raf-1／MEK／ERK，IKK／IKB／NF-kB，GRK-2信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子，PEBP1通過(guò)選擇性地調(diào)節(jié)c-Raf-1而不是通過(guò)調(diào)節(jié)b-raf，激活MAPK信號(hào)分子對(duì)于生長(zhǎng)因子的反應(yīng)，在生長(zhǎng)和發(fā)育中發(fā)揮重要作用。另外，PEBP1是癌轉(zhuǎn)移中的抑癌基因，PEBP1也參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、胞膜的生成及精子的發(fā)生等生理過(guò)程有關(guān)，在生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡、腫瘤發(fā)生和癌癥轉(zhuǎn)移中具有重要作用。然而，PEBP1在正常大鼠脊髓中表達(dá)還不清楚，并且，在脊髓損傷之后的表達(dá)也未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究PEBP1在正常脊髓組織中的定位表達(dá)和在脊髓損傷后的表達(dá)變化，探討可能的作用機(jī)制。因此，研究PEBP1在脊髓損傷后的變化情況，可以為脊髓損傷后的分子治療和基因治療提供新的靶點(diǎn)，具有重要的臨床意義。

1 材料及方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年Sprague-Dawley大鼠105只（由成都達(dá)碩公司提供），雌性，體重（210±20）g，單籠飼養(yǎng)，環(huán)境溫度為20℃～28℃。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組（sham）和實(shí)驗(yàn)組，其中實(shí)驗(yàn)組包含6個(gè)亞組，動(dòng)物術(shù)后分別允許存活12h、1d、3d、7d、14d和28d，每組15只。

1．2 動(dòng)物模型制備

動(dòng)物采用3．6%水合氯醛腹腔麻醉。俯臥位固定，背部剃毛，碘伏常規(guī)消毒。體表定位，然后于T10處縱行切開皮膚及皮下組織。剝離椎旁肌肉，暴露棘突和椎板，隨后咬除T10棘突及其椎板，暴露脊髓。用改良的Allen’s法損傷動(dòng)物。即10g金屬棒在30mm處下落，砸傷脊髓，造成脊髓鈍損傷模型。假手術(shù)組只剝離椎板，暴露脊髓但不損傷脊髓。術(shù)畢，逐層縫合傷口，持續(xù)3天給予大鼠注射青霉素（80 000IU／kg·d）。術(shù)后大鼠正常進(jìn)食、飲水，獨(dú)籠飼養(yǎng)。每日兩次擠壓膀胱協(xié)助大鼠排尿，直至大鼠恢復(fù)自主排尿。

1．3 組織獲取

大鼠分別在對(duì)應(yīng)的存活時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取材。動(dòng)物用3．6%水合氯醛腹腔注射麻醉，仰臥固定，暴露胸腔，通過(guò)心臟灌注生理鹽水和4%多聚甲醛。充分暴露脊髓，取出整個(gè)脊髓損傷段，并放于4%多聚甲醛中后固定，用于后期的免疫組織化學(xué)分析。而用于實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)和免疫印跡反應(yīng)的脊髓損傷段標(biāo)本在心臟灌注生理鹽水后立即取材并存放于-80℃冰箱。

1．4 免疫組織化學(xué)

將后固定的假手術(shù)組和實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物脊髓標(biāo)本進(jìn)行組織脫水后，用石蠟包埋，制備石蠟切片（5μm）。烤片2h后，脫蠟，用梯度酒精水化，高壓修復(fù)5 min，自然冷卻。采用SP法，進(jìn)行免疫組化染色。根據(jù)試劑盒（中杉金橋）進(jìn)行一下操作。即用3%過(guò)氧化氫封閉15min，PBS液洗后用5%羊血清37℃條件下孵育15min。滴加一抗PEBP1（1∶200，Rb，博士德），4℃條件下孵育過(guò)夜。加辣根過(guò)氧化酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG二抗于37℃條件下孵育30min后用DAB顯色。常規(guī)脫水，透明，封片。陰性對(duì)照用PBS代替一抗，其余步驟不變。

染色切片在光學(xué)顯微鏡（Motic）下觀察免疫陽(yáng)性反應(yīng)的分布，圖像用Image pro-plus計(jì)算免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1．5 免疫印跡反應(yīng)

為了檢測(cè)PEBP1蛋白表達(dá)變化，本研究采用免疫印跡法檢測(cè)。取假手術(shù)組和實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物脊髓損傷段組織，粉碎后加入適量RIPA裂解液冰上裂解和勻漿，并采用超聲進(jìn)行粉粹。離心后取上清液，根據(jù)試劑盒（碧云天公司）測(cè)定總蛋白濃度。各組取等量蛋白上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫下封閉后，用一抗PEBP1（1∶300，Rb，博士德）和beta-actin（1∶6000，Mouse，proteintech）于4℃冰箱中過(guò)夜孵育。洗膜后加HRP偶聯(lián)羊抗兔IgG（1∶50 000，中杉金橋）和羊抗小鼠IgG（1∶20 000，proteintech）二抗室溫下孵育2 h。然后根據(jù)試劑盒（凱基）采用ECL發(fā)光法。用膠片進(jìn)行曝光，圖像用圖像分析軟件（Quantity One）進(jìn)行灰度值測(cè)定。

1．6 實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)

為了檢測(cè)脊髓損傷后PEBP1mRNA的表達(dá)變化，本研究采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。取假手術(shù)組和實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的脊髓損傷段組織，加入TRIzol裂解液體試劑并于冰上勻漿，提取總RNA。根據(jù)試劑盒（RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit）說(shuō)明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

配置含有2×PCR Mix，上游引物，下游引物，探針，PCR water nucle-free，cDNA 模板的反應(yīng)體系，并于 Real-time PCR system（BIO RAD 7300）在95℃，2min預(yù)變性；95℃，15s；53℃，20s；60℃，40 s，45個(gè)循環(huán)的條件下測(cè)試。所采用的引物由上海生工公司合成，基因序列如下，PEBP1Forwad primer sequence：5′-ATGCTCCCAGCAGGAAGGA-3′，backwad primer sequence：5′-GACAGTGCCACTGCTAAT-3′；beta-actin Forwad primer sequence：5′-GAAGATCAAGATCATTGCTCCT-3′， backwad primer sequence：5′-ACAGTGCCACTGCTAAT-3′。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

SPSS 18．0用于數(shù)據(jù)處理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤。采用單因素方差分析方法（ANOVA）用于比較各組之間的差異性，采用＜0．05表示數(shù)據(jù)間存在顯著性差異。

2 結(jié)果

2．1 PEBP1在脊髓中的分布和表達(dá)變化

運(yùn)用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)PEBP1在脊髓中的定位表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PEBP1在脊髓后角的膠質(zhì)細(xì)胞的胞漿中有陽(yáng)性表達(dá)，也有少量定位于細(xì)胞核內(nèi)。免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)結(jié)果顯示脊髓損傷后PEBP1的表達(dá)在12h（＜0．001），1d（＝0．025），3d（＜0．001），7d（＝0．001），14d（＝0．006）和28d（＝0．001）降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖1）。

圖1 PEBP1在脊髓后角的定位表達(dá)Fig．1 The locoation of PEBP1in posterior horn of spinal cord

2．3 脊髓損傷后PEBP1蛋白的表達(dá)變化

為了進(jìn)一步研究PEBP1的作用，采用免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)脊髓損傷后PEBP1蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組術(shù)組比較，在大鼠脊髓損傷后7d（＝0．025），14d（＝0．035）和28d（＝0．023）PEBP1蛋白的表達(dá)量降低，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖2）。

圖2 PEBP1蛋白脊髓損傷中表達(dá)Fig．2 The level of PEBP1protein in rats with spinal cord injury

2．4 脊髓損傷后PEBP1mRNA的表達(dá)變化

為了進(jìn)一步檢測(cè)脊髓損傷后PEBP1mRNA的表達(dá)變化，我們采用的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。如圖1結(jié)果顯示，與假手術(shù)組（sham）比較，大鼠脊髓損傷后PEBP1mRNA表達(dá)量在12h（＜0．001），1d（＜0．001），3d（＜0．001），7d（＜0．001），14d（＜0．001）和28d（＜0．001）明顯降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖3）。

圖3 PEBP1mRNA在脊髓損傷中表達(dá)Fig．3 The relative expression of PEBP1mRNA in spinal cord after injury

3 討論

PEBP1作為磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白家族（PEBP）的成員之一，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡、神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育以及腫瘤相關(guān)等生理過(guò)程。然而，PEBP1在正常脊髓中的定位表達(dá)和在脊髓損傷后的表達(dá)變化還未見報(bào)道。本研究通過(guò)大鼠脊髓損傷模型，采用免疫組織化學(xué)的方法進(jìn)行定位研究，運(yùn)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和免疫印跡法檢測(cè)PEBP1 mRNA和蛋白的表達(dá)變化。

3．1 PEBP1在脊髓中的分布

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)到PEBP1在正常脊髓后角的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞胞漿和胞核表達(dá)，在脊髓損傷后PEBP1免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在12h，1d，3d，7d，14d和28d降低。因此，我們推測(cè)PEBP1在脊髓損傷后的表達(dá)降低可能與脊髓損傷后感覺(jué)功能的恢復(fù)有關(guān)，這可能因?yàn)镻EBP1參與脊髓損傷后神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的存活和凋亡有關(guān)。Burgula等將大鼠置于模擬海拔高度中5d，檢測(cè)大腦組織中PEBP1蛋白表達(dá)降低，推測(cè)PEBP1可能與癡呆癥和缺氧有關(guān)。George等通過(guò)基因表達(dá)系列分析在阿爾茲海默病小鼠模型中基因的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)PEBP1在阿爾茲海默癥的大腦組織中表達(dá)減少，提示PEBP1可能作為阿爾茲海默癥的標(biāo)志物。在給大鼠服用冰毒后，發(fā)現(xiàn)位于突觸的PEBP1表達(dá)降低，說(shuō)明PEBP1參與藥物成癮行為，因此，其可能會(huì)作為潛在的治療藥物成癮行為的靶點(diǎn)。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)研究，我們的結(jié)果顯示PEBP1在脊髓中有表達(dá)，在脊髓損傷后的表達(dá)降低，這與以前研究顯示在人類疾病中PEBP1的表達(dá)降低一致。PEBP1在正常脊髓后角的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，提示PEBP1在脊髓中對(duì)于維持正常的生理功能有重要作用。在脊髓損傷后，PEBP1的免疫陽(yáng)性細(xì)胞減少可能與脊髓損傷后神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡壞死有關(guān)，這提示PEBP1可能影響脊髓損傷后感覺(jué)功能。

3．2 PEBP1mRNA和蛋白在脊髓損傷之后的表達(dá)變化

為了進(jìn)一步研究PEBP1在脊髓中作用，采用實(shí)時(shí)定量PCR和免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PEBP1在脊髓損傷后的蛋白和基因的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PEBP1蛋白在大鼠脊髓損傷后7d，14d和28d下降，此外，PEBP1mRNA的表達(dá)水平在脊髓損傷后12h，1d，3d，7d，14d和28d降低。結(jié)果提示PEBP1在脊髓損傷后參與調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的存活和凋亡，從而影響大鼠脊髓損傷后感覺(jué)功能的恢復(fù)。

PEBP1影響細(xì)胞的分化，細(xì)胞存活以及細(xì)胞遷移等重要生理過(guò)程。Sagisaka等通過(guò)體外培養(yǎng)大鼠海馬細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PEBP1與海馬祖細(xì)胞向神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化有關(guān)，提示PEBP1在海馬祖細(xì)胞分化為特定細(xì)胞系的過(guò)程中可能作為關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子。Zeng等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PEBP1的表達(dá)與轉(zhuǎn)移性腫瘤發(fā)生，它主要參與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，存活和遷移。另外，PEBP的在黑色素瘤中表達(dá)降低，在體內(nèi)黑色素瘤中缺失PEBP會(huì)增加細(xì)胞的侵襲性。當(dāng)上調(diào)PEBP在的結(jié)腸癌細(xì)胞中表達(dá)可以抑制細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，眾多研究顯示PEBP通過(guò)參與MAPK、G蛋白偶聯(lián)受體、GSK3β和NF-κB等信號(hào)通路發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

結(jié)合本研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在脊髓損傷后PEBP1的蛋白和基因均下降，這與以往的關(guān)于PEBP1在腫瘤和神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中的作用一致，因此，我們推測(cè)PEBP1減少會(huì)影響脊髓的正常生理動(dòng)能，從而影響脊髓損傷后的感覺(jué)功能。PEBP1通過(guò)激活 MAPKG，GSK3β和 NF-κB等信號(hào)通路影響神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的存活和凋亡，從而影響感覺(jué)功能的恢復(fù)。綜上所述，在脊髓損傷后，PEBP1在脊髓后角的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞胞漿和胞核表達(dá)，同時(shí)PEBP1的蛋白和基因的水平下調(diào)，提示PEBP1參與調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的存活和凋亡，影響大鼠脊髓損傷后感覺(jué)功能的恢復(fù)。這種作用可能與MAPK，GSK3β和NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。

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