楊國(guó)香，徐元宏

?；撬釋?duì)苯并芘體外誘導(dǎo)血小板聚集活化功能的影響

楊國(guó)香，徐元宏

取健康志愿者外周靜脈血并分離血小板，采用隨機(jī)分組的方式將血小板分成6組。通過(guò)檢測(cè)血小板最大聚集率、膜表面CD62P及PAC-1陽(yáng)性表達(dá)率，探討不同濃度的?；撬幔═au）對(duì)苯并芘（BAP）體外誘導(dǎo)血小板聚集活化功能的影響。結(jié)果表明，血小板最大聚集率在二磷酸腺苷（ADP）和膠原誘導(dǎo)下各濃度BAP-Tau組與溶劑對(duì)照組之間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。血小板膜表面CD62P、PAC-1表達(dá)率BAP-Tau高濃度組與溶劑對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。不同濃度的Tau均可拮抗BAP致血小板功能損傷的作用，且呈濃度梯度性變化。

苯并芘；牛磺酸；血小板功能；流式細(xì)胞儀

?；撬幔╰aurine，Tau）是人體內(nèi)一種條件必需氨基酸，具有廣泛的生物學(xué)作用［1］。研究［2］證實(shí)Tau在體內(nèi)能抑制血小板聚集降低血小板活化等作用。苯并芘（benzo pyrene，BAP）廣泛存在于香煙等燃燒產(chǎn)生的煙氣中，通過(guò)增強(qiáng)體內(nèi)血小板活化促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化和血栓的形成［3－4］。血小板可以被膠原、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）等誘導(dǎo)劑誘發(fā)聚集，活化后會(huì)釋放出特異性的血小板膜表面CD62P和血小板活化復(fù)合物PAC-1［5］。但Tau對(duì)BAP在體外保存血小板中致血小板的聚集和活化功能怎樣，目前很少有報(bào)道。根據(jù)研究［4］，BAP選用10 μmol／L、Tau選用正常成人血漿濃度值上限約5倍值（1、5、25 mmol／L）作為實(shí)驗(yàn)濃度梯度，觀測(cè)Tau對(duì)BAP體外誘導(dǎo)血小板功能的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑FACSCalibur流式細(xì)胞儀和CellQuest分析軟件，F(xiàn)ITC標(biāo)記的單克隆抗體PAC-1-FITC、IgG1-FITC，PE標(biāo)記的單克隆抗體CD62PPE、IgG1-PE、PerCP標(biāo)記的單克隆抗體CD41a-Per-CP（美國(guó)BD公司）；PL-11血小板分析儀，ADP、膠原誘導(dǎo)劑（江蘇英諾華公司）；PH-A型恒溫?cái)[動(dòng)保存箱（濰坊普華公司）；Tau、BAP（美國(guó)Sigma公司）。

1.2 樣本制備與處理 用枸櫞酸納抗凝真空采血管采集健康體檢志愿者全血190份，抗凝劑與全血比例1∶9。志愿者納入標(biāo)準(zhǔn)包括：①年齡18～55周歲；②血小板計(jì)數(shù)＞150×109／L或＜450×109／L；③無(wú)吸煙史；④近2周未服用抗血小板類(lèi)藥物；⑤非月經(jīng)期。將采集后的血樣1 000 r／min離心10 min即得富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）；再3 000 r／min離心10 min，去除部分上清液得到濃縮血小板血漿。取其中10份于采集后30 min內(nèi)用1%甲醛固定處理，作為血小板采集和制備過(guò)程中導(dǎo)致CD62P及PAC-1表達(dá)陽(yáng)性率的測(cè)定。其余180份隨機(jī)分成6組：空白對(duì)照組，溶劑對(duì)照組（10% DMSO液）、BAP組（10 μmol／L BAP液）、BAP-Tau低濃度組（10 μmol／L BAP＋1 mmol／L Tau液）、BAP-Tau中濃度組（10 μmol／L BAP＋5 mmol／L Tau液）、BAP-Tau高濃度組（10 μmol／L BAP＋25 mmol／L Tau液）。上述操作均在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。將制備好的各組血小板樣本輕搖混勻后，置血小板振蕩保存箱內(nèi)（22±2）℃保存24 h。

1.3 血小板膜表面CD62P和PAC-1陽(yáng)性表達(dá)率的測(cè)定 采用FACSCalibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)管：在FCM專(zhuān)用上樣管中依次加入CD62P-PE、PAC-1-FITC、CD41a-PerCP、血小板懸液；同型對(duì)照管：依次加入IgG1-PE、IgG1-FITC、CD41a-Per-CP、血小板懸液；輕輕混勻置室溫避光反應(yīng)15 min，用PBS洗一次，加入1%甲醛1 ml避光固定15 min，24 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)分析。以CD41a-PerCP和側(cè)散射光散點(diǎn)圖設(shè)血小板門(mén)，用同型對(duì)照管設(shè)定陰性群體，測(cè)定血小板膜表面CD62P和PAC-1陽(yáng)性表達(dá)率（%）。見(jiàn)圖1。

1.4 血小板聚集功能測(cè)定 采用PL-11血小板分析儀進(jìn)行檢測(cè)。將各組濃縮血小板按儀器流程要求進(jìn)行檢測(cè)，適時(shí)加入40 μl ADP（20 μmol／L）或膠原（0.2 mg／ml）誘導(dǎo)劑，記錄血小板最大聚集率（%）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，多組之間的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊時(shí)采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Dunnett′s T3檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 血小板膜表面CD62P和PAC-1表達(dá) 采集樣本30 min內(nèi)固定的血小板膜表面CD62P和PAC-1表達(dá)陽(yáng)性率（%）說(shuō)明血小板在采集和制備過(guò)程中并沒(méi)有過(guò)度激活血小板。BAP-Tau高濃度組與BAP組、BAP-Tau低、中濃度組CD62P比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝9.919，P＜0.01）；PAC-1比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝5.534，P＜0.01）。提示不同濃度的Tau對(duì)體外保存血小板活化均具有抑制作用。見(jiàn)表1。

表1 不同組別血小板膜表面CD62P和PAC-1表達(dá)測(cè)定結(jié)果（±s，%）

與溶劑對(duì)照組比較：**P＜0.01；與BAP組比較：＃P＜0．05，＃＃P＜0.01；與BAP-Tau低濃度組比較：△P＜0.05，△△P＜0.01；與BAP-Tau中濃度組比較：▲▲P＜0.01

組別n CD62PPAC-1 103.96±0.900.88±0.22空白對(duì)照3060.60±4.092.08±0.47溶劑對(duì)照3060.81±4.042.10±0.48 BAP3062.47±4.142.17±0.39 BAP-Tau低濃度3060.51±3.872.17±0.48 BAP-Tau中濃度3059.16±2.83＃＃1.90±0.34?！鰾AP-Tau高濃度3055.93±4.04**＃?！鳌鳌?.72±0.36**＃?！鳌?/p>

2.2 血小板最大聚集率情況 膠原誘導(dǎo)的血小板最大聚集率BAP-Tau低、中、高濃度組3組之間及與其他各組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝ 3 841.677，P＜0.01）；ADP誘導(dǎo)的血小板最大聚集率BAP組與BAP-Tau中、高濃度組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝514.953，P＜0.01）。提示不同濃度的Tau均可拮抗BAP對(duì)血小板的作用，且呈濃度梯度性改變。見(jiàn)表2。

表2 不同組別血小板最大聚集率測(cè)定結(jié)果（n＝30，%，±s）

與溶劑對(duì)照組比較：＃＃P＜0.01；與BAP組比較：**P＜0.01；與BAP-Tau低濃度組比較：△P＜0.05，△△P＜0.01；與BAP-Tau中濃度組比較：▲▲P＜0.01

組別膠原（0.2 mg／ml）ADP（20 μmol／L）空白對(duì)照4.59±0.517.20±0.81溶劑對(duì)照4.56±0.477.17±0.66 BAP4.28±0.454.63±0.85＃＃BAP-Tau低濃度6.43±0.46**＃＃4.82±0.64＃＃BAP-Tau中濃度7.12±0.99△**＃＃7.31±0.70**△△BAP-Tau高濃度23.24±0.82**＃?！鳌鳌?3.49±0.94**＃＃△△▲▲

3 討論

目前，體外血小板功能評(píng)價(jià)還沒(méi)有一套完整的評(píng)價(jià)體系［6］，但大多影響血小板功能的因素都可能引起血小板聚集和活化功能改變。Dumont et al［7］研究認(rèn)為，CD62P表達(dá)率是有效預(yù)測(cè)血小板輸注體內(nèi)回收率和存活率的最佳指標(biāo)。血小板隨著體外保存時(shí)間的延長(zhǎng)，其聚集功能逐漸下降，CD62P等活化功能指標(biāo)會(huì)逐漸升高［8］。因此，本研究運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)，同時(shí)檢測(cè)血小板各實(shí)驗(yàn)組的最大聚集率、膜表面CD62P、PAC-1表達(dá)率，來(lái)判斷和評(píng)價(jià)保存血小板聚集活化功能的變化。

Tau是一種細(xì)胞保護(hù)劑，除對(duì)外源化合物解毒外，還具有穩(wěn)定溶酶體膜，調(diào)節(jié)細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)，抗脂質(zhì)過(guò)氧化，調(diào)節(jié)滲透壓以及促進(jìn)血小板內(nèi)NO合成增加NOS活性等作用［1］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［9］顯示BAP能加速血小板脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，減少氧自由基的生成，加快血小板膜的破壞。本研究基于Tau、BAP和血小板之間的聯(lián)系，觀察Tau對(duì)BAP致體外保存血小板聚集活化功能的影響，以探討二者在血小板保存質(zhì)量方面的作用。

結(jié)果顯示空白對(duì)照組測(cè)得值與謝作聽(tīng)等［10］報(bào)道基本一致。BAP組和溶劑對(duì)照組相比，對(duì)膠原誘導(dǎo)的保存血小板聚集功能未見(jiàn)影響；對(duì)ADP誘導(dǎo)的保存血小板聚集功能有明顯的抑制作用，對(duì)保存血小板功能產(chǎn)生明顯損傷。和上述報(bào)道［4］略有不同，推測(cè)是由于血小板體外保存與體內(nèi)生理環(huán)境存有的差異，活化后血小板對(duì)聚集誘導(dǎo)劑的致聚反應(yīng)能力會(huì)產(chǎn)生不同的現(xiàn)象。體外血小板會(huì)隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，脂質(zhì)過(guò)氧化的加速，從血小板內(nèi)部移位到血小板表面的GPⅡb／Ⅲa受到保存體系中蛋白酶的降解失去正常聚集功能，且體外血小板內(nèi)GPⅡb／Ⅲa儲(chǔ)備有限，導(dǎo)致活化后血小板對(duì)聚集誘導(dǎo)劑的致聚反應(yīng)能力逐漸下降。同時(shí)設(shè)置BAP組、BAP-Tau低濃度組、BAP-Tau中濃度組、BAP-Tau高濃度組，探討不同濃度Tau對(duì)BAP致血小板損傷的作用。結(jié)果表明，高、中、低濃度的Tau都可拮抗BAP對(duì)保存血小板產(chǎn)生的影響，且高濃度的Tau作用尤為明顯。另外，選用比人體血漿濃度高多倍的Tau作為實(shí)驗(yàn)終濃度，保障保存血小板回輸體內(nèi)后Tau依然能達(dá)到實(shí)驗(yàn)效果的濃度。

綜上所述，本研究可為在血小板捐獻(xiàn)者篩選時(shí)規(guī)避吸煙等不利因素，或在血小板保存液中注入一定濃度的Tau保護(hù)血小板功能，提高血小板輸注效果提供了一種思路。

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Effects of taurine on platelet aggregation induced by benzo pyrene in vitro activation function

Yang Guoxiang，Xu Yuanhong
（Dept of Clinical Laboratory，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

The peripheral renous blood which were taken from healthy volunteers and platelet was isolated.Platelet samples were randomly divided into six groups.The effects of different concentration of taurine（Tau）on benzo pyrene（BAP）induced platelet aggregation in vitro activation function were investigated by detecting the maximum platelet aggregation rate，the positive expression rates of platelet membrane surface CD62P and PAC-1.The results showed that platelet maximum aggregation rate had significant differences between each concentration of BAP-Tau groups and solvent control group in adenosine diphosphate（ADP）and collagen induced（P＜0.01）.The positive expression rates of platelet membrane surface CD62P and PAC-1 in BAP-Tau high concentration group had significant differences compared with solvent control group（P＜0.01）.Different concentration of Tau could antagonize platelet function damage induced by BAP with a concentration gradient change.

benzo pyrene；taurine；platelet function；flow cytometry

R 446.9

1000－1492（2015）01－0116－03

2014－09－12接收

安徽省科技創(chuàng)新公共服務(wù)平臺(tái)項(xiàng)目（編號(hào)：PT20081011）

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，合肥 230022

楊國(guó)香，女，主管檢驗(yàn)師，碩士研究生；徐元宏，男，教授，主任技師，責(zé)任作者，E-mail：xyhong1964＠163.com