任周新，沈俊嶺，李 亞綜述 余海濱審校

綜述

TGF-β誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究進(jìn)展

任周新1，2，沈俊嶺1，2，李 亞1綜述 余海濱1審校

上皮－間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是源于上皮細(xì)胞的惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷徙和侵襲能力的重要生物學(xué)過(guò)程。惡性上皮性腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞分泌的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）誘導(dǎo)和促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的EMT過(guò)程。有研究表明TGF-β借助于Smad依賴性或非Smad依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)或抑制EMT過(guò)程關(guān)鍵基因的表達(dá)；細(xì)胞外及細(xì)胞膜的多種因子則對(duì)上述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。結(jié)果提示，在TGF-β誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的EMT過(guò)程，涉及一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β；上皮－間充質(zhì)轉(zhuǎn)化；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

上皮－間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是上皮細(xì)胞來(lái)源的惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過(guò)程，是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程的重要啟動(dòng)步驟；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）是腫瘤細(xì)胞EMT過(guò)程的重要誘導(dǎo)因子。在TGF-β的介導(dǎo)下，上皮腫瘤細(xì)胞獲得了更多的間充質(zhì)的表型、喪失了上皮細(xì)胞的表型，導(dǎo)致侵襲和遷移能力的提升［1］，從而加速了腫瘤的擴(kuò)散和發(fā)展，見(jiàn)圖1。近年來(lái)針對(duì)TGF-β誘導(dǎo)的EMT過(guò)程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行了大量的研究，取得了一定的進(jìn)展，筆者就這些研究結(jié)果作一綜述。

1 TGF-β信號(hào)通路

TGF-β超家族包括TGF-β、活化素（activin）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、多種生長(zhǎng)與分化因子（growth and differentiation factors，GDFs）等成分，這些成分對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、生存、分化和遷移具有調(diào)節(jié)作用；在胚胎形成和成年組織的局部?jī)?nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持中，TGF-β也具有重要的作用［2］。TGF-β與某些疾病之間存在密切的聯(lián)系，如自身免疫性疾病、心血管疾病和腫瘤［3］。在腫瘤形成的早期階段，TGF-β通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)以及促進(jìn)細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生抑制效應(yīng)；但在隨后腫瘤的進(jìn)展階段，卻促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，這種作用與其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的EMT有關(guān)。例如，上皮腫瘤細(xì)胞獲得了更多的間充質(zhì)的表型并喪失了上皮細(xì)胞的表型，導(dǎo)致侵襲和遷移能力的增強(qiáng)［1］，加速了腫瘤的擴(kuò)散和發(fā)展。此外，TGF-β的促腫瘤形成作用還涉及實(shí)體瘤的基質(zhì)細(xì)胞，機(jī)制涉及對(duì)血管形成的刺激、免疫監(jiān)視的抑制以及炎癥細(xì)胞的募集。

TGF-β與細(xì)胞膜Ⅰ型和Ⅱ型serine／threonine激酶受體（TGF-βRⅠ／Ⅱ）結(jié)合，改變TGF-βRⅠ／Ⅱ的結(jié)構(gòu)，磷酸化并激活胞質(zhì)內(nèi)的TGF-βRⅠ激酶，催化受體活化型Smads（如Smad2、Smad3）并使其活化，然后與Smad-4結(jié)合形成復(fù)合物，進(jìn)入并積聚于細(xì)胞核，在細(xì)胞核與其他的轉(zhuǎn)化因子結(jié)合，調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)。此外，該TGF-β受體活化后，還能磷酸化其他信號(hào)通路蛋白，影響其他信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。如磷酸化Shc的tyrosine活化Ras／MAP-激酶通路；磷酸化Par6的tyrosine導(dǎo)致上皮極性復(fù)合物失活。此外，該TGF-β受體復(fù)合物形成一個(gè)募集泛素激酶TRAF6的信號(hào)支架，后者啟動(dòng)Jun N-terminal激酶和P38 MAP-激酶的信號(hào)瀑布［4］。

另外，TGF-β還有非-Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，涉及phosphatidylinositol 3’-激酶，the tyrosine kinase Src和小GTPase Rho。另外，TGF-βRⅠ也可能被基質(zhì)金屬蛋白酶TACE裂解，該裂解方法依賴于泛素連接酶TRAF6和蛋白激酶C，裂解后的TGF-βRⅠ的細(xì)胞內(nèi)部分被轉(zhuǎn)座到細(xì)胞核，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力［5］。

2 TGF-β和腫瘤EMT

腫瘤細(xì)胞進(jìn)入不同的組織，需要經(jīng)歷一系列的遷移過(guò)程。如從原位癌突破局部上皮細(xì)胞基底膜，侵入周圍組織；通過(guò)循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移；在特定位點(diǎn)從循環(huán)系統(tǒng)中轉(zhuǎn)移到新的宿主環(huán)境。

與腫瘤有關(guān)的EMT的實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在某些爭(zhēng)議，原因在于EMT過(guò)程的短暫、具有可逆轉(zhuǎn)的性質(zhì)以及較難識(shí)別人類腫瘤樣本中的正在進(jìn)行EMT轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞。某些研究［3］提示腫瘤的發(fā)展過(guò)程與EMT有關(guān)。EMT是指在特定的生理和病理情況下，具有極性的上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象。EMT現(xiàn)象最早于1982年被發(fā)現(xiàn)，研究顯示胚胎期和成年期晶狀體的上皮細(xì)胞在三維膠原凝膠中培養(yǎng)可形成偽足，隨后轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)樣細(xì)胞［6］。目前認(rèn)為EMT是啟動(dòng)腫瘤轉(zhuǎn)移反應(yīng)的關(guān)鍵步驟，可參與多種腫瘤（前列腺癌、食管癌及胃癌等）的侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程。

TGF-β是EMT產(chǎn)生的初始誘導(dǎo)者，之后發(fā)生了廣泛的上皮細(xì)胞核的重新編程，產(chǎn)生出progenitorlike特征，細(xì)胞之間的連接發(fā)生了改變，以至于原本正常的上皮細(xì)胞之間的連接變得易于彎曲和可塑，造成細(xì)胞從上皮組織的脫離［3］。上述現(xiàn)象是細(xì)胞內(nèi)外一系列結(jié)構(gòu)變化的結(jié)果。在細(xì)胞內(nèi)，微絲、微管和中間絲發(fā)生了結(jié)構(gòu)變化，而在細(xì)胞外，細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）也發(fā)生了結(jié)構(gòu)改變，這些變化促進(jìn)了細(xì)胞之間形成新的膜連接方式；另外，細(xì)胞外基質(zhì)中的細(xì)胞因子、趨化因子等生物活性分子組成和數(shù)量也發(fā)生了相應(yīng)的變化。所有這些變化為腫瘤入侵提供了適宜的微環(huán)境，而且為腫瘤向周圍血管內(nèi)滲提供了關(guān)鍵步驟。

3 細(xì)胞外和細(xì)胞膜因子共同調(diào)節(jié)TGF-β誘導(dǎo)的EMT

沉積于ECM中的靜止形式的TGF-β，通過(guò)蛋白裂解方式、與基質(zhì)和細(xì)胞膜蛋白的相互作用方式被活化，活化后與受體結(jié)合產(chǎn)生信號(hào)［7］。如電離輻射能夠活化靜止?fàn)顟B(tài)的TGF-β，誘導(dǎo)乳腺癌腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生EMT［8］。此外，TGF-β表達(dá)的調(diào)控、相關(guān)受體以及信號(hào)介質(zhì)等，均能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞對(duì)TGF-β的反應(yīng)能力以及EMT反應(yīng)的強(qiáng)弱。如CCN5蛋白（一種在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核之間的往來(lái)穿梭的蛋白質(zhì)），在細(xì)胞核內(nèi)，該蛋白與HDAC1連接，抑制TGF-βRⅡ的表達(dá)，因此限制了TGF-β信號(hào)通路的作用，產(chǎn)生抑制TGF-β誘導(dǎo)EMT的效應(yīng)［9］。與之相反，具有促進(jìn)生長(zhǎng)作用的同源框轉(zhuǎn)錄因子Six1通過(guò)轉(zhuǎn)錄方式誘導(dǎo)TGF-βRⅠ表達(dá)，因此Six1活化具有提高TGF-β誘導(dǎo)EMT的效能［10］。

最近的研究［11］表明：其他類型的蛋白，如SCUBE3，能夠與TGF-βRⅡ結(jié)合，促進(jìn)肺癌細(xì)胞中的EMT反應(yīng)并提高癌細(xì)胞的侵襲能力。Klotho是一種腎轉(zhuǎn)膜蛋白，當(dāng)Klotho的細(xì)胞外決定區(qū)伸出細(xì)胞膜時(shí)，能夠與TGF-βRⅡ結(jié)合、阻止信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制EMT反應(yīng)；Klotho不僅僅拮抗TGF-β，而且拮抗Wnt和胰島素樣生長(zhǎng)因子1信號(hào)通路。鑒于這兩條信號(hào)通路直接或間接地促進(jìn)了EMT，因此，Klotho能夠同時(shí)阻斷多條誘導(dǎo)EMT信號(hào)通路，具有較為廣泛的作用途徑［12］。

與其他研究的廣度和深度相比，TGF-β細(xì)胞外和細(xì)胞膜調(diào)節(jié)因子的研究較為薄弱，有必要深入開(kāi)展這方面的研究工作，確認(rèn)抑制和促進(jìn)TGF-β的調(diào)節(jié)因子，了解這些因子的作用機(jī)制和效應(yīng)。然后，從中選擇出適宜的研究對(duì)象作為藥物研究的新靶點(diǎn)，建立一條治療腫瘤遷徙和擴(kuò)散新的藥物研究途徑。

4 TGF-β誘導(dǎo)EMT的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

TGF-β誘導(dǎo)EMT的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及一個(gè)相互交織、精細(xì)調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，不僅Smad而且非Smad通路均可誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，其詳細(xì)的動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)機(jī)制正在研究中［13］。

4.1 Smads參與TGF-β誘導(dǎo)的EMT反應(yīng)

Smads蛋白存在于胞質(zhì)中，含有高度保守的N端功能域（Mad-Homology domain 1，MH1）和C端功能域（MH2），前者可與DNA的CAGAC序列結(jié)合，后者則與轉(zhuǎn)錄輔激活蛋白或輔阻遏物相互作用。這兩個(gè)功能域之間存在一個(gè)富含脯氨酸的連接區(qū)，含有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，屬于Smads的負(fù)調(diào)控區(qū)。Smads介導(dǎo)由胞膜受體轉(zhuǎn)導(dǎo)入胞核內(nèi)的TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，是細(xì)胞內(nèi)TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

體內(nèi)和體外研究［14］顯示，R-Smads和Smad4介導(dǎo)TGF-β誘導(dǎo)的EMT反應(yīng)中的受體的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。需要注意的是不同的Smad分子具有不同的作用。例如，特異性地去除Smad3的角化細(xì)胞，產(chǎn)生自發(fā)性的鱗狀細(xì)胞癌；另外，對(duì)化學(xué)性刺激誘發(fā)的皮膚腫瘤，去除Smad3后產(chǎn)生抑制腫瘤的保護(hù)作用，后者進(jìn)一步確定Smad3介導(dǎo)了眾多的致瘤信號(hào)傳遞［15］。與之相反，角化細(xì)胞中去除Smad2，在化學(xué)刺激后，加速細(xì)胞的癌變［15］；上述產(chǎn)生的Smad2-表達(dá)陰性的鱗狀癌細(xì)胞具有EMT眾多標(biāo)志的病態(tài)分化的特性，E-cadherin的表達(dá)受到抑制［15］。對(duì)于小鼠的皮膚，Smad2保護(hù)上皮細(xì)胞避免EMT。這些研究表明，對(duì)于皮膚細(xì)胞，Smad3誘導(dǎo)或促進(jìn)EMT而Smad2則抑制EMT或維持上皮特征。

與上述的Smad2抗EMT的保護(hù)作用相一致，在人類腎上皮細(xì)胞中，使Smad2表達(dá)沉默或SARA（一種細(xì)胞內(nèi)的接頭蛋白，能夠促進(jìn)Smad2連接到TGF-βRⅠ和促進(jìn)磷酸化過(guò)程）沉默，促進(jìn)EMT的發(fā)生［16］。SARA的丟失，通過(guò)泛素連接酶Smurf2和蛋白體的降解，促進(jìn)Smad2的泛素化。WWP2連接酶也能調(diào)節(jié)R-Smad水平，影響EMT反應(yīng)［17］。另有研究［18］顯示，纖維化肺臟上皮細(xì)胞中的EMT依賴于TGF-β受體與integrin α3β1受體之間的相互作用，使磷酸化Smad2-磷酸化β-catenin-轉(zhuǎn)錄復(fù)合因子活化，在體內(nèi)和體外產(chǎn)生促EMT作用。

核Smad復(fù)合物的生物學(xué)效應(yīng)受到蛋白激酶的影響。JNK1有多種同型異構(gòu)體，在TGF-β引起的EMT反應(yīng)中，產(chǎn)生不同的影響。JNK2似乎對(duì)TGF-β誘導(dǎo)的EMT有抑制作用，如缺乏JNK2的細(xì)胞對(duì)TGF-β刺激，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的EMT反應(yīng)［3］；JNK1則顯示出促進(jìn)EMT的效應(yīng)，如抑制JNK1的表達(dá)能夠顯著減輕多種刺激劑誘導(dǎo)的肺氣管上皮細(xì)胞的EMT反應(yīng)［19］。JNK1似乎對(duì)帶有AP-1家族成員的Smad轉(zhuǎn)錄復(fù)合物（Jun／Fos）具有催化作用，該復(fù)合物作用的目標(biāo)基因具有重要的促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲以及EMT的作用［20］。另外，TGF-β-誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白-1（metastasis-associated protein 1，MTA-1）表達(dá)，MTA-1與AP-1復(fù)合物相互協(xié)作，引起FosB的轉(zhuǎn)錄［21］。FosB與HDAC2形成復(fù)合物抑制多種乳腺細(xì)胞表達(dá)E-cadherin，介導(dǎo)了EMT過(guò)程。

除了蛋白激酶，特異性的sumo-E3連接酶PIAS1也能調(diào)節(jié)TGF-β誘導(dǎo)的EMT反應(yīng)。TGF-β下調(diào)PIAS1并且減少核抑制蛋白SnoN（一個(gè)已知的Smad輔助因子）的sumo化修飾［22］。Sumoylation的不足打破了原有的平衡，最終使SnoN降解，導(dǎo)致TGF-β誘導(dǎo)的Smad復(fù)合物能夠產(chǎn)生EMT過(guò)程所必需的基因調(diào)節(jié)作用。與之相反，E3泛素連接酶TIF1γ使Smad4泛素化，導(dǎo)致核Smad復(fù)合物的破壞，因此產(chǎn)生拮抗TGF-β誘導(dǎo)的EMT的作用［23］。

在肺腺癌A549細(xì)胞中，Smad3與HDAC6的相互作用進(jìn)一步表明Smad3在TGF-β誘導(dǎo)的EMT中具有促進(jìn)作用［24］。用藥物抑制劑或siMRA抑制HDAC6或Smad3均會(huì)產(chǎn)生抑制EMT反應(yīng)的效應(yīng)。HDAC6使微管中的微管蛋白脫去α-乙酰基，對(duì)細(xì)胞的遷移產(chǎn)生某種影響，但是，是否HDAC6-Smad3共調(diào)節(jié)也影響微管的運(yùn)動(dòng)或影響EMT的其他表現(xiàn)，這些尚不明確。在A549細(xì)胞的EMT過(guò)程中，TGF-β能夠下調(diào)適配器蛋白胰島素受體底物1（adaptor protein insulin receptor substrate 1，IRS1）［25］。IRS1的過(guò)度表達(dá)阻斷EMT反應(yīng)，而用RNAi清除IRS1卻能顯著促進(jìn)EMT反應(yīng)，RNAi的作用與提高TGF-β誘導(dǎo)Snail1和Snail2的表達(dá)并最終下調(diào)E-cadherin的表達(dá)有關(guān)。其詳細(xì)的分子機(jī)制可能包括某種磷酸酶磷酸化IRS1或某種其他的降解機(jī)制，或者同時(shí)涉及這兩個(gè)機(jī)制［3］。

4.2 非-Smad的介導(dǎo)TGF-β誘導(dǎo)的EMT的路徑

在上皮細(xì)胞中，TFG-β通過(guò)磷酸化adaptor protein Par6形成了一條信號(hào)通路，該通路將TGF-β受體直接與蛋白質(zhì)的翻譯后修飾和調(diào)節(jié)聯(lián)系在一起［26］。磷酸化的Par6募集泛素連接酶Smurf1，該酶降解小GTPase RhoA，導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白微絲結(jié)構(gòu)的變化，破壞了細(xì)胞間正常的緊密的連接。

受體連接的泛素連接酶TRAF6介導(dǎo)lysine63-依賴的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β激活激酶1（TGF-beta-activated kinase 1，TAK1）的多泛素化反應(yīng)。TRAF6的酶促反應(yīng)，使MAP-激酶-激酶磷酸化并被激活，隨后激活p38MAP激酶和JNK MAP激酶［4］。和TGF-βRⅡ-Par6通路類似，該信號(hào)通路也不依賴Smads，參與乳腺上皮細(xì)胞的EMT反應(yīng)［27］。然而，TGFβ受體-TRAF6-TAK1復(fù)合物，除了通過(guò)MAP激酶途徑還可能通過(guò)其他的效應(yīng)器途徑，介導(dǎo)了促進(jìn)EMT的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。例如在初始的間皮細(xì)胞里，p38MAP激酶通過(guò)抑制TAK1活性和抑制其下游的效應(yīng)器——即核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）。NF-κB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，其活化對(duì)于TGF-β誘導(dǎo)的EMT過(guò)程產(chǎn)生重要的影響［28］。TRAF6不僅泛素化和激活TGF-β信號(hào)下游的TAK1，而且也泛素化直接與之連接的TGF-βRⅠ［5］。該泛素化促進(jìn)TGF-βRⅠ細(xì)胞外受體區(qū)（ICD）的裂解，該區(qū)包括全部的激酶決定區(qū)，隨后促進(jìn)裂解后的ICD區(qū)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核。在核內(nèi)，TGF-βRⅠICD通過(guò)與共激活因子p-300以及包含眾多基因的染色質(zhì)結(jié)合，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄過(guò)程，這些基因?qū)MT和腫瘤入侵有促進(jìn)作用，如Snail基因［5］。TGF-βRⅠICD與核的Smad復(fù)合物共同作用于靶基因，調(diào)節(jié)TGF-β誘導(dǎo)的EMT反應(yīng)。

上述研究結(jié)果表明：TGF-β借助于Smad依賴性或非Smad依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)或抑制EMT過(guò)程關(guān)鍵基因的表達(dá)；細(xì)胞外及細(xì)胞膜的多種因子則對(duì)上述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。提示TGF-β誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的EMT過(guò)程涉及一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。對(duì)其中某些關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的有效干預(yù)可能為抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷徙提供新的治療方法。

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R 735.2；R 730.231

1000－1492（2015）

2014－07－23接收

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81302921）；河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院臨床研究支持項(xiàng)目（編號(hào)：2013KJ12）

1河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，2河南省病毒性疾病中醫(yī)藥防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450000

任周新，男，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師；余海濱，男，副主任醫(yī)師，副教授，責(zé)任作者，E-mail：yhbzzz＠163.com