王 芳，金 銳，李 磊，程豐偉，羅 欣，張勝權(quán)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

TLR7激動(dòng)劑Gardiquimod上調(diào)BxPC-3細(xì)胞中IL-15 mRNA表達(dá)

王 芳，金 銳，李 磊，程豐偉，羅 欣，張勝權(quán)

目的研究TLR7在胰腺癌BxPC-3細(xì)胞中表達(dá)，并探討TLR7激動(dòng)劑激活TLR7后細(xì)胞因子白介素15（IL-15）的表達(dá)。方法通過(guò)Western blot和Real-time PCR分析TLR7在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平；BxPC-3細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同時(shí)間點(diǎn)Gardiquimod（3 μg／ml）的處理后，Real-time PCR分析TLR7激活后IL-15 mRNA水平表達(dá)變化；Western blot分析Gardiquimod刺激細(xì)胞后，磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶（PI3K-AKT）信號(hào)通路的變化。結(jié)果Western blot和Real-time PCR結(jié)果顯示：與外周血單核細(xì)胞（PBMC）相比，TLR7在BxPC-3中弱表達(dá)；Real-time PCR分析顯示：Gardiquimod處理細(xì)胞后能刺激細(xì)胞中IL-15的表達(dá)；TLR7激動(dòng)劑能夠激活PI3K-AKT信號(hào)通路。結(jié)論 Gardiquimod激活TLR7后能夠上調(diào)IL-15的表達(dá)，并且其激活與PI3KAKT信號(hào)途徑相關(guān)。

TLR7；Gardiquimod；IL-15；PI3K-AKT；BxPC-3

Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是一類識(shí)別病原相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP）的模式識(shí)別受體（pattern-recognition receptor，PRR）［1］。TLRs廣泛分布于體內(nèi)不同免疫細(xì)胞表面，如TLR1能在單核細(xì)胞、T、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞等多種細(xì)胞中表達(dá)，TLR3只能夠特異性表達(dá)于樹(shù)突狀細(xì)胞［2］。TLRs的生物學(xué)功能主要包括激活固有免疫和參與適應(yīng)性免疫的應(yīng)答的啟動(dòng)［3］。同樣，TLR7在腫瘤的免疫治療中也發(fā)揮著十分重要的作用［4］。而磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶（phosphatidylinositol-3-kinase-protein serine threonine kinase，PI3K-AKT）信號(hào)通路與TLRs受體也有密切聯(lián)系，作為聯(lián)系細(xì)胞外信號(hào)分子與細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子之間的橋梁，在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡等方面起著重要的調(diào)節(jié)作用［5］。Ha et al［6］研究顯示，TLR2配體可通過(guò)PI3K-AKT信號(hào)通路保護(hù)心臟進(jìn)而緩解動(dòng)脈缺血／再灌注損傷。同時(shí)，PI3KAKT在細(xì)胞功能調(diào)節(jié)如防御和免疫方面也發(fā)揮重要作用［7］。白介素-15（interleukin-15，IL-15）是一種細(xì)胞因子，源于T細(xì)胞，能夠在體內(nèi)T、B淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞中表達(dá)，其生物學(xué)功能廣泛，能誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖、NK細(xì)胞分化等［8］。Shenoy et al［9］研究顯示IL-15能夠通過(guò)PI3K-AKT和JAK-STAT等信號(hào)通路誘導(dǎo)和抑制凋亡，從而對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)。在眾多腫瘤中，胰腺癌是一種高度惡性的腫瘤，與其高侵襲性、轉(zhuǎn)移性、耐藥性有關(guān)［10］。因此，腺癌的治療目前仍然是醫(yī)學(xué)界的難題。該研究旨在對(duì)TLR7與胰腺癌的關(guān)系以及TLR7配體Gardiquimod激活TLR7后對(duì)信號(hào)通路PI3K-AKT和下游細(xì)胞因子IL-15表達(dá)進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑胰腺癌BxPC-3細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，Gardiguimod購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，TLR7、βactin和PI3K-AKT抗體購(gòu)自美國(guó)Cell signaling公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR，RT-PCR）試劑均購(gòu)自日本TaKaRa公司，引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 引物登陸NCBI網(wǎng)站檢索人GAPDH、IL-15基因序列，Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，見(jiàn)表1。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)從液氮復(fù)蘇胰腺癌BxPC-3細(xì)胞株，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)于含10%FBS的1640培養(yǎng)液。細(xì)胞長(zhǎng)到70%～80%時(shí)，以4×104／ml的密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板。實(shí)驗(yàn)前1 d換無(wú)血清培養(yǎng)液，用Gardiquimod（3 μg／ml）在不同時(shí)間點(diǎn)（0.2、0.5、1.0、3.0、6.0、12.0、24.0 h）刺激BxPC-3細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，以不做任何處理的細(xì)胞作空白對(duì)照組；并另設(shè)外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）對(duì)照，不做任何處理的細(xì)胞作陽(yáng)性對(duì)照組。

1.4 RT-PCR檢測(cè)IL-15 mRNA的表達(dá)水平用TRIzol提取BxPC-3細(xì)胞中總RNA，以逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成方法合成cDNA。以cDNA為模板，加入特異性引物（表1）配成RT-PCR體系。具體如下：2× SYBR Premix Ex TaqⅡ10 μl、ROX DYEⅡ0.4 μl、上下游引物各0.4 μl、cDNA 2 μl、lddH2O 6.8 μl，總體積20 μl?？傮w系在AB 7500熒光定量分析儀上按程序運(yùn)行，以GAPDH為內(nèi)參。最后用相對(duì)定量分析法分析BxPC-3組與PBMC組。

1.5 Western blot分析TLR7的表達(dá)及其激活的信號(hào)通路經(jīng)過(guò)不同時(shí)間點(diǎn)Gardiquimod刺激后，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞提取24孔板中的總蛋白。配制12%SDS-丙烯酰胺凝膠，將蛋白與5×loading buffer混合后上樣，濃縮膠中恒壓60 V，分離膠加至120 V，待電泳完成，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上（恒流150 mA，3 h）。用5%脫脂牛奶將膜封閉2 h后用TBST洗膜3次，每次10 min，一抗以工作濃度1∶500，4℃孵育過(guò)夜，加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗（TLR7為兔抗1∶10 000；β-actin為鼠抗1∶12 000；p-AKT為兔抗1∶14 000）。孵育2 h，用ECL發(fā)光劑壓膠片發(fā)光、顯影。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用±s表示。組間計(jì)量資料采用成組設(shè)計(jì)的方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 TLR7在BxPC-3細(xì)胞中表達(dá)從BxPC-3及PBMC中提取mRNA和總蛋白，以PBMC作陽(yáng)性對(duì)照組。Western blot和RT-PCR結(jié)果顯示：與陽(yáng)性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中TLR-7表達(dá)，但較弱（F＝2 015）。見(jiàn)圖1。

2.2 Gardiquimod刺激BxPC-3細(xì)胞能夠上調(diào)IL-15的表達(dá) IL-15表達(dá)具有波動(dòng)性，IL-15-V1，3的表達(dá)呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，在12.0 h時(shí)達(dá)峰值，約是空白對(duì)照組的4倍，之后下降；IL-15-V2也有上升趨勢(shì)，在3.0 h出現(xiàn)峰值，約是空白對(duì)照組的2.3倍。（FIL-15-V1，3＝1 836；FIL-15-V2＝4 580）。見(jiàn)圖2。

2.3 Gardiquimod激活BxPC-3細(xì)胞中PI3KAKT信號(hào)通路與空白對(duì)照組相比，加Gardiquimod刺激的細(xì)胞中p-AKT在0～3.0 h表達(dá)升高，并在3.0 h達(dá)到峰值，以后略微下降，呈明顯的劑量依賴性（F＝388.745）。見(jiàn)圖3。

3 討論

Gardiquimod是一種咪唑喹啉類小分子化合物，是咪喹莫特的衍生物，作為T(mén)LR7的配體，能夠激活胞內(nèi)區(qū)Toll／IL-1受體同源區(qū)（TIR），通過(guò)下游髓樣分化因子88（MyD88）信號(hào)通路，激活信號(hào)蛋白核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和PI3K等，從而誘導(dǎo)細(xì)胞因子IL-6、IL-15等因子，干擾素IFN-γ合成，從而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)［11］。

實(shí)驗(yàn)表明，TLR7能夠在胰腺癌細(xì)胞中表達(dá)，盡管很弱。進(jìn)一步的研究［12］顯示TLR7的激活誘導(dǎo)下游細(xì)胞因子IL-15表達(dá)升高。IL-15組織分布極為廣泛，在骨骼肌和胎盤(pán)中IL-15 mRNA水平很高，也表達(dá)于淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、NK細(xì)胞等表面［13］。IL-15與IL-2氨基酸序列不同，但空間結(jié)構(gòu)相似，因此具有相似的生物學(xué)作用。主要有促進(jìn)T細(xì)胞增殖，促進(jìn)NK細(xì)胞胞毒活性產(chǎn)生CK，誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖產(chǎn)生抗體，激活單核／巨噬細(xì)胞等等。故IL-15是參與體內(nèi)免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞因子［9］。本實(shí)驗(yàn)中，TLR7激活后能夠上調(diào)IL-15的表達(dá)，進(jìn)一步誘導(dǎo)體內(nèi)免疫系統(tǒng)，對(duì)胰腺癌的發(fā)展起到一定的抑制作用。

程豐偉等［14］研究顯示，PI3K-AKT信號(hào)通路為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，與腫瘤細(xì)胞的增殖與存活、侵襲與轉(zhuǎn)移等行為密切相關(guān)。PI3K的異常與類脂磷酸激酶（PTEN）的負(fù)調(diào)節(jié)失活有關(guān)，AKT異常會(huì)導(dǎo)致下游血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的高表達(dá)，而VEGF是血管生長(zhǎng)、腫瘤增殖、遷移的關(guān)鍵。本研究結(jié)果顯示，PI3K-AKT信號(hào)通路被激活并在3.0 h出現(xiàn)了升高的峰值之后略微下降，說(shuō)明TLR7的激活對(duì)胰腺癌的增殖、遷移等具有一定的抑制作用。

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The agonist of TLR7 Gardiquimod up-regulates the expression of interleukin-15 in BxPC-3 cells

Wang Fang，Jin Rui，Li Lei，et al
（Dept of Biochemistry and Molecular Biology，Anhui Medical University，Hefei 230032）

ObjectiveTo investigate the expression of Toll-like receptor 7（TLR7）in pancreatic cancer BxPC-3 cells，and to explore the effect of TLR7 activation on the expression of interleukin-15（IL-15）.MethodsBxPC-3 cells were used to analyze the expression of TLR7 by Western blot and Real-time PCR.The cells were treated with Gardiquimod（3 μg／ml）at different times，the expression of IL-15 at mRNA level by Real-time PCR.Western blot was performed to analyze the phosphorylation level changes of phosphatidyl inositol kinase serine／threonine kinase （PI3K-AKT）protein in BxPC-3 cells stimulated by TLR7 ligand Gardiquimod.ResultsWestern blot and Realtime PCR results showed that compared with peripheral blood mononuclear cells （PBMC），TLR7 presented weak expression in BxPC-3 cells.Gardiquimod could increase the expression of IL-15 in BxPC-3 cells.TLR7 agonist could activate the PI3K-AKT signaling pathway.ConclusionGardiquimod can up-regulate the expression of IL-15 and this effect can be associated with PI3K-AKT signaling pathway.

TLR7；Gardiquimod；interleukin-15 ；PI3K-AKT；BxPC-3

R 34

A

1000－1492（2015）01－0001－04

2014－09－24接收

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81271748）

安徽醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，合肥230032

王 芳，女，碩士研究生；張勝權(quán)，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：sqz36＠yahoo.com