吳 燕，王 怡，江巧玲，周佳麗，周 青，汪 淵，朱華慶

同型半胱氨酸對內(nèi)皮細胞肌球蛋白輕鏈激酶表達的影響

吳 燕，王 怡，江巧玲，周佳麗，周 青，汪 淵，朱華慶

目的研究同型半胱氨酸（Hcy）對人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）運動能力以及肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）表達的影響。方法不同濃度的Hcy處理人臍靜脈內(nèi)皮細胞后，MTT法檢測Hcy對HUVEC增殖的影響，劃痕實驗檢測Hcy對細胞遷移的影響，免疫組化法及Western blot法檢測MLCK表達的變化。結(jié)果隨著濃度的升高，Hcy對HUVEC的增殖有顯著的抑制作用，對HUVEC的遷移有明顯的促進作用，免疫組化法及Western blot法結(jié)果顯示Hcy可以增強MLCK的表達。結(jié)論Hcy對HUVEC的遷移具有促進作用，可能是Hcy通過上調(diào)MLCK的表達所致。

同型半胱氨酸；動脈粥樣硬化；人臍靜脈內(nèi)皮細胞；肌球蛋白輕鏈激酶

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是大多數(shù)心腦血管疾病的重要病理基礎(chǔ)，給人類健康帶來極大的威脅，而其發(fā)病機制非常復雜，其中內(nèi)皮細胞損傷被認為是動脈粥樣硬化的始動環(huán)節(jié)［1－2］。同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是一種含巰基氨基酸，是人體內(nèi)甲硫氨酸代謝過程的中間產(chǎn)物，近年來，大量研究［3］證明同型半胱氨酸可以損傷內(nèi)皮細胞，是致AS的一個獨立危險因素。肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase，MLCK）是一種鈣調(diào)素依賴酶，能催化肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC）磷酸化，引起內(nèi)皮細胞收縮，細胞骨架重排，從而調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的通透性［4］。該研究通過采用同型半胱氨酸處理人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilicalvein endothelial cells，HUVEC），初步探討了Hcy對HUVEC增殖、遷移能力的影響以及在此過程中MLCK表達的變化，為Hcy致AS的發(fā)生和發(fā)展機制提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料HUVEC購于美國ATCC公司；胎牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；四甲基偶氮唑藍（MTT）、Hcy購于美國Sigma公司，MTT用PBS配制成5%母液，Hcy用純化水配制成200 mmol／L母液，分別過濾除菌，－20℃避光保存。BCA定量試劑盒、ECL顯色試劑盒均購于美國Pierce公司；免疫組化染色試劑盒、DAB試劑盒購于北京中杉金橋公司；鼠抗人β-actin、MLCK均購于美國Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人臍靜脈內(nèi)皮細胞，培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U／ml青霉素、100 μg／ml鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱。當細胞處于對數(shù)生長期時，用0.25%（含0.53 mmol／L EDTA）的胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 MTT法 取對數(shù)生長期的HUVEC，接種于96孔板中（3 000～4 000個／孔），邊緣孔用200 μl PBS填充。細胞貼壁后，吸去原培養(yǎng)液，每孔加入200 μl含不同濃度的Hcy（0.1、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mmol／L）培養(yǎng)液，每組4個復孔，設(shè)立細胞對照組，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。吸去原液，每孔加入200 μl新鮮DMEM培養(yǎng)液及20 μl MTT，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。小心棄去上清液，每孔加入100 μl DMSO，震蕩10 min溶解結(jié)晶后于570 nm測吸光度（optical density，OD）。抑制率（%）＝（對照孔OD570－試驗孔OD570）／對照孔OD570×100%。

1.2.3 細胞劃痕實驗 HUVEC用胰蛋白酶消化后吹打成單細胞懸液，將細胞懸液均勻接種于12孔板中，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞長滿后用滅菌白槍頭在12孔板底部畫出井字形，PBS洗3次，洗去劃下的漂浮細胞，加入培養(yǎng)液后在交叉線處拍照。拍照后換入含有不同濃度Hcy（0.1、0.5、1.0 mmol／L）的培養(yǎng)液，每12 h拍照一次，拍照前后均要換液。Quantity One軟件測量每組細胞劃痕邊界的距離，細胞相對遷移率（%）＝（藥物處理前的距離－藥物處理后的距離）／藥物處理前的距離。

1.2.4 免疫組化實驗 取處于對數(shù)生長期的HUVEC，胰酶消化后接種于含有滅菌圓形蓋玻片的6孔板中，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日細胞貼壁后分別加入含不同濃度Hcy（0.1、0.5、1.0 mmol／L）的培養(yǎng)液，并設(shè)立細胞對照組及陰性對照組（PBS代替一抗孵育）培養(yǎng)48 h。取出6孔板，多聚甲醛固定細胞1 h，PBS洗3遍，將蓋玻片取出置于載玻片上，吸干蓋玻片周圍PBS，山羊血清封閉10 min，加一抗4℃過夜。二抗孵育15 min，PBS洗3遍，加入鏈霉卵白素孵育15 min，PBS洗后DAB顯色。自來水沖洗后蘇木精復染，自來水返藍，分別經(jīng)95%乙醇、無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.5 Western blot 將細胞均勻接種于細胞培養(yǎng)瓶中，待細胞貼壁生長后用不同濃度Hcy（0.1、0.5、1.0 mmol／L）處理48 h。冰PBS洗滌細胞后，加入蛋白提取液（Tris-HCl，pH 7.14；150 mmol／L NaCl，1 mmol／L EDTA，1%Triton，0.1%SDS，5 mg／ml Leupeptin，1 mmol／L PMSF），冰上裂解30 min，用細胞刮輕輕將細胞刮下置－80℃及4℃冰箱反復凍融2～3次。14 000 r／min、4℃離心30 min后吸取上清液進行BCA定量，將所有樣本調(diào)整為相同濃度并加入4×蛋白上樣緩沖液后煮沸，－80℃保存?zhèn)溆谩Ｅ渲?0%的凝膠，加樣后恒壓進行SDSPAGE電泳，電泳結(jié)束后恒流將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，3%～5%的脫脂牛奶室溫封閉2 h，PBS洗3次后置于一抗［MLCK（1∶500）或β-actin（1∶1 000）］中孵育過夜。加入HRP標記的二抗室溫孵育2 h，PBS洗3遍，在暗室中將等比例混合后的ECL試劑A液和B液均勻涂于膜上，覆蓋X線片曝光，顯影，定影。片子掃描后，用Quantity One軟件對其進行灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計學處理采用SPSS 16.0軟件進行分析，數(shù)據(jù)用±s表示。組間計量資料采用成組設(shè)計的方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 Hcy對HUVEC增殖的影響 MTT結(jié)果顯示Hcy能明顯抑制HUVEC在體外的增殖，并且抑制效果隨Hcy濃度的升高而增強，提示Hcy抑制HUVEC的增殖呈明顯的劑量依賴性（F＝13.866），見表1。

表1 不同濃度Hcy對HUVEC增殖的影響（n＝4，±s）

與細胞對照組比較：*P＜0.05

組別OD570值抑制率（%）細胞對照1.07±0.08－Hcy（mmol／L）0.11.00±0.0812.85*0.40.92±0.1029.27*0.60.83±0.0346.59*0.80.81±0.0846.70*1.00.77±0.0558.00*2.00.75±0.0262.07*

2.2 Hcy對HUVEC遷移的影響 HUVEC在加藥處理24 h和36 h后，Hcy組劃痕處的細胞明顯比細胞對照組多，且隨著藥物濃度的升高劃痕間隙越來越小，說明Hcy可以明顯促進HUVEC的遷移，且隨著藥物濃度的升高遷移效果越明顯（F＝56.61），見圖1。

2.3 細胞免疫組織化學法檢測MLCK的表達免疫組織化學結(jié)果顯示細胞對照組僅有極少量細胞著色且著色很淺；0.1 mmol／L Hcy處理細胞后棕黃色的MLCK表達量增強；0.5 mmol／L Hcy處理后可見細胞胞質(zhì)大量著色，且著色更深；1.0 mmol／L Hcy組染色細胞陽性表達最強，胞質(zhì)呈深棕黃色，見圖2。

2.4 Western blot檢測MLCK的表達不同濃度的Hcy作用于HUVEC 48 h后，結(jié)果顯示與細胞對照組相比Hcy處理后的細胞MLCK表達顯著增強，且隨著Hcy濃度的升高，細胞中MLCK的表達量逐漸加強（F＝62.276），見圖3。

3 討論

在人體內(nèi)，Hcy主要是甲硫氨酸脫甲基后的產(chǎn)物。Hcy有兩種代謝途徑，一方面可以通過轉(zhuǎn)硫作用生成半胱氨酸和α-酮丁酸，另一方面可以發(fā)生甲基化，重新形成甲硫氨酸，以保持體內(nèi)Hcy的平衡。與Hcy體內(nèi)合成和代謝相關(guān)的酶、葉酸、維生素B12等的缺乏都可能引起高同型半胱氨酸血癥［5］。AS是由多種因素共同參與的一種疾病，包括高血壓、高血脂、糖尿病、吸煙等，而高同型半胱氨酸血癥是導致AS的一個重要因素，目前其機制尚未完全明確。

血管內(nèi)皮細胞是附著于血管壁的單層表皮細胞，是血液和組織液之間的轉(zhuǎn)運屏障，能合成和分泌多種活性物質(zhì)，保證血管正常的收縮和舒張，使循環(huán)血液保持流動狀態(tài)，防止血栓形成。AS與內(nèi)皮細胞之間具有密切的聯(lián)系，AS的產(chǎn)生始于內(nèi)皮細胞的損傷。有研究［6－7］表明Hcy可以通過巰基發(fā)生自身氧化，產(chǎn)生的過氧化氫、超陰離子和羥自由基等活性氧誘導氧化應(yīng)激反應(yīng)，導致內(nèi)皮細胞的直接損傷，同時，釋放的大量炎癥因子會破壞血管內(nèi)皮，引起內(nèi)皮功能紊亂，進一步加劇AS的發(fā)展。該研究采用體外培養(yǎng)HUVEC，經(jīng)不同濃度Hcy處理后，MTT結(jié)果顯示與細胞對照組相比較，Hcy組細胞的增殖受到明顯抑制，且抑制效果呈濃度依賴性。

近年來研究［8］顯示MLCK在調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞收縮以及血管內(nèi)皮屏障功能中發(fā)揮著重大作用，是MLC磷酸化的重要調(diào)節(jié)蛋白。MLC磷酸化水平與骨架收縮活動直接相關(guān)，MLCK表達增加可以上調(diào)MLC磷酸化水平，導致內(nèi)皮細胞收縮加劇，通透性增加，細胞形態(tài)和功能完整性遭到破壞，脂質(zhì)更容易發(fā)生浸潤［9］。該研究Western blot以及免疫組化結(jié)果顯示，與細胞對照組相比，Hcy處理組細胞中MLCK的表達量顯著上升，且隨著藥物濃度的升高而增加，提示Hcy可以上調(diào)MLCK的表達。MLC的磷酸化水平與細胞遷移也是密切相關(guān)的，MLCK誘導細胞周邊和前端MLC磷酸化，磷酸化的MLC加強肌球蛋白和肌動蛋白微絲的相互作用，增強細胞的運動能力，從而促進細胞的遷移［10］。劃痕實驗顯示Hcy處理HUVEC 24 h及36 h后，在顯微鏡下可以觀察到劃痕距離的縮短，且隨著藥物濃度的升高，劃痕距離的縮短更加顯著，從而提示Hcy可以促進HUVEC的遷移。

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The effect of homocysteine on the expression of MLCK in human umbilicalvein endothelial cells

Wu Yan，Wang Yi，Jiang Qiaoling，et al
（Dept of Biochemistry and Laboratory of Molecular Biology，Anhui Medical University，Dept of Key Laboratory，Gene Resource Utilization for Severe Disease of Anhui Province，Hefei 230032）

ObjectiveTo explore the effect of homocysteine（Hcy）on movement ability and expression of myosin light chain kinase（MLCK）in human umbilicalvein endothelial cells（HUVEC）.MethodsMTT assay was detected to measure the proliferation of HUVEC treated with different concentrations of homocysteine.The effect of Hcy on migration of HUVEC was measured by wound healing assay.The expression of MLCK was analyzed by immunohistochemistry and Western blot.ResultsWith the increase of concentration，Hcy could inhibit the proliferation of HUVEC and promote the migration of HUVEC remarkably.Immunohistochemistry and Western blot showed that Hcy could enhance the expression of MLCK significantly.ConclusionHcy can promote the migration of HUVEC，which may relate to the up-regulation of expression of MLCK

Hcy；atherosclerosis；HUVEC；MLCK

R 966；R 541.4；R 34

1000－1492（2015）01－0012－04

2014－09－11接收

國家自然科學基金（編號：81070232、81270372）

安徽醫(yī)科大學分子生物學實驗室、生物化學與分子生物學

教研室、安徽?。〔抗步ń逃恐匾z傳病基因資源利用重點實驗室，合肥 230032

吳 燕，女，碩士研究生；

朱華慶，男，教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：aydzhq＠126.com