吳繼軍，韓衛(wèi)星，劉 超，陳曉蓉，王 成，盧挪挪

p22-phox在P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化前后的變化

吳繼軍1，韓衛(wèi)星1，劉 超2，陳曉蓉2，王 成3，盧挪挪

目的探討P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化前后p22-phox水平的變化。方法貼壁培養(yǎng)P19細(xì)胞，取合適細(xì)胞株，應(yīng)用0.9%二甲基亞砜（DMSO）誘導(dǎo)培養(yǎng)，收集誘導(dǎo)不同時(shí)間的細(xì)胞，通過Western blot檢測(cè)其肌鈣蛋白I（cTnI）水平，以確定分化，并行Western blot檢測(cè)P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化前后細(xì)胞中p22-phox蛋白水平。結(jié)果①P19細(xì)胞經(jīng)0.9%DMSO誘導(dǎo)分化后，于第8天開始檢測(cè)到cTnI表達(dá)陽(yáng)性，后cTnI表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。②P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化后細(xì)胞內(nèi)p22-phox水平較分化前高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 p22-phox在P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化后表達(dá)增加，氧化應(yīng)激水平增高。

P19細(xì)胞；心肌細(xì)胞；細(xì)胞分化；氧化應(yīng)激；p22-phox

氧化應(yīng)激是指體內(nèi)生成的活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）水平和抗氧化系統(tǒng)水平失衡，ROS生產(chǎn)過多或（和）機(jī)體抗氧化能力減低，致使ROS清除不足，在體內(nèi)聚積，導(dǎo)致組織器官的氧化性損傷［1－3］。它是導(dǎo)致心血管疾病常見的一個(gè)中間者，然而其引起心血管危險(xiǎn)的發(fā)生又不同于其他常見的危險(xiǎn)因素，成為眾多危險(xiǎn)因素引起心血管疾病的一個(gè)共同途徑，對(duì)于氧化應(yīng)激標(biāo)志物的研究已成為目前研究的焦點(diǎn)［4］。尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶是由1個(gè)三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）酶結(jié)合蛋白R(shí)ac、2個(gè)膜亞基p22-phox、gp91-phox以及3個(gè)胞質(zhì)亞基p40-phox、p47-phox、p67-phox組成的復(fù)合體，是機(jī)體內(nèi)生成ROS的主要酶之一［5－6］。因此，細(xì)胞內(nèi)p22-phox的水平在一定程度上反映細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平。該研究通過檢測(cè)p22-phox水平來(lái)反映P19細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化前后氧化應(yīng)激水平的變化。

1 材料與方法

1.1 材料 P19細(xì)胞株由安徽醫(yī)科大學(xué)組胚學(xué)教研室組織工程干細(xì)胞研究所提供，胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、α-MEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hy-Clone公司，二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司，蛋白提取試劑盒購(gòu)自凱基公司，肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Chemicon公司，p22-phox單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 P19細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)和傳代 將水浴箱預(yù)熱至約37℃，從液氮中取出凍存的P19細(xì)胞，快速放入水浴箱中，不停搖晃，使其迅速融化。待凍存管內(nèi)冰晶完全融解后立即轉(zhuǎn)入5 ml離心管，加α-MEM完全培養(yǎng)液3 ml（含90%α-MEM、10%FBS、青霉素100 U／ml、鏈霉素100 U／ml），1 000 r／min離心5 min，吸去上清液，再次加入完全培養(yǎng)液2 ml，輕輕吹打、重懸細(xì)胞，待細(xì)胞懸液分布均勻后取適當(dāng)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入組織培養(yǎng)皿，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿底面約75%，棄去上清液，以無(wú)菌PBS洗2次，加胰酶1 ml，放入培養(yǎng)箱消化約5 min后取出，加入等量完全培養(yǎng)液吹勻，以一定密度傳代。

1.2.2 P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞誘導(dǎo) 將胰酶消化后的P19細(xì)胞以1×106個(gè)／ml的密度接種到10 cm細(xì)菌培養(yǎng)皿，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)液10 ml（含0.9%DMSO的完全培養(yǎng)液），懸浮培養(yǎng)。第3天用7 ml誘導(dǎo)培養(yǎng)液不完全換液。待第4天形成大量細(xì)胞聚集體，吸取適量該細(xì)胞聚集體轉(zhuǎn)入6 cm組織培養(yǎng)皿進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，后每2 d以完全培養(yǎng)液換液1次。

1.2.3 Western blot測(cè)定細(xì)胞中p22-phox及cTnI水平 蛋白提取試劑盒提取蛋白后以BCA法測(cè)定蛋白濃度，加入上樣緩沖液，100℃水浴5 min，置于冰上代用。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，12%濃縮膠以120 V電壓電泳，5%分離膠以150 V電壓電泳。后取出凝膠，以40 mA恒流低溫轉(zhuǎn)膜過

夜。取出PVDF膜，TBST洗膜3次，每次10 min，1%脫脂奶粉溶液封閉1 h，后分別加以p22-phox及cTnI一抗于4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，二抗孵育2 h，再以TBST洗膜3次，每次10 min，壓片曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，cTnI蛋白水平及分化前后細(xì)胞內(nèi)p22-phox蛋白水平的比較采用配對(duì)設(shè)計(jì)定量資料的t檢驗(yàn)，Western blot結(jié)果目的條帶應(yīng)用軟件Image J進(jìn)行灰度值計(jì)算，檢驗(yàn)水準(zhǔn)取P＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)觀察胰酶消化完接種好的未誘導(dǎo)分化的P19細(xì)胞大略呈圓形，胞體較小，分散均勻，約2 h可見細(xì)胞開始貼壁，呈扁平的不規(guī)則多邊形；第4天可見有大量胚胎樣小體形成，懸浮生長(zhǎng)，形態(tài)各異，大小不一，多數(shù)呈圓形，小體表面有囊狀突起；第8天可見細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，分布密集，多數(shù)呈梭狀。見圖1。

2.2 P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中cTnI檢測(cè)P19細(xì)胞經(jīng)過含0.9%DMSO的培養(yǎng)液誘導(dǎo)，cTnI于第8天呈現(xiàn)陽(yáng)性，第10天水平高于第8天，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝31.758，P＝0.000）；第12天水平高于第10天，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝12.394，P＝0.000）。見圖2。

2.3 P19細(xì)胞分化前后p22-phox水平的變化誘導(dǎo)分化第10天細(xì)胞內(nèi)的p22-phox水平明顯高于正常未分化的P19細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝3.261，P＝0.017）。見圖3。

3 討論

氧化反應(yīng)調(diào)節(jié)著正常機(jī)體內(nèi)的多種生理反應(yīng)，對(duì)于機(jī)體的平衡起著重要作用，調(diào)節(jié)的失衡可導(dǎo)致一系列不良影響。隨著機(jī)體各組織器官的發(fā)育、衰老，其氧化應(yīng)激水平也在不斷變化。氧化應(yīng)激損傷的嚴(yán)重性主要取決于分子靶標(biāo)、氧化應(yīng)激水平的高低以及氧化應(yīng)激的具體產(chǎn)生機(jī)制，其與心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病以及癌癥等諸多疾病的發(fā)生有著密切聯(lián)系［7］。心血管各種疾病與氧化應(yīng)激水平的關(guān)系尤為密切，如高血壓病、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管常見?。?－9］。氧化應(yīng)激的作用表現(xiàn)主要在于影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、遷移以及激活等方面，在機(jī)體某些病理?xiàng)l件下，ROS與組織炎癥、細(xì)胞增殖激活障礙和內(nèi)皮功能紊亂等方面有著密切聯(lián)系。

P19細(xì)胞是目前試驗(yàn)中用來(lái)研究干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化較為常用的細(xì)胞之一，本研究表明其向心肌細(xì)胞分化后p22-phox蛋白表達(dá)增加，表明心肌細(xì)胞在其分化過程中氧化應(yīng)激水平升高。氧化應(yīng)激在干細(xì)胞生長(zhǎng)分化的過程中發(fā)揮著重要作用，細(xì)胞內(nèi)的低水平ROS對(duì)于保持其未分化狀態(tài)以及維持自我更新極為重要，而高水平ROS的生成將會(huì)導(dǎo)致干細(xì)胞的分化、衰老乃至凋亡［10］。本研究結(jié)果也證實(shí)了細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的增高是P19細(xì)胞產(chǎn)生分化的一個(gè)重要因素。氧化應(yīng)激水平升高使干細(xì)胞產(chǎn)生分化，但同時(shí)高水平氧化應(yīng)激也導(dǎo)致其分化后降低或喪失了自我更新修復(fù)能力，引起細(xì)胞、組織的衰老和凋亡。心肌細(xì)胞內(nèi)高水平的氧化應(yīng)激與心肌組織的多種疾病如心衰、心肌梗死等有著重要聯(lián)系［11－12］。在心肌疾病治療的一些傳統(tǒng)藥物中，如β受體阻滯劑、AT1受體拮抗藥以及血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑等都對(duì)NADPH氧化酶的活性有著一定的抑制作用。因此，抗氧化劑的研究和使用在心血管疾病的治療方面顯得很重要，然而抗氧化藥物的使用仍然停留在傳統(tǒng)治療藥物中。雖然目前對(duì)于抗氧化劑在心血管疾病的應(yīng)用有一定報(bào)道，但抗氧化劑尚未在臨床中作為心血管疾病的常規(guī)用藥，其臨床療效也有待評(píng)價(jià)。

本研究局限于基礎(chǔ)研究，缺少動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)酥吝M(jìn)一步臨床研究，未能進(jìn)一步研究心肌細(xì)胞內(nèi)高水平氧化應(yīng)激狀態(tài)對(duì)心肌組織乃至整個(gè)心臟的具體影響。

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The changes of the expression of p22-phox before and after P19 cells differentiating into cardiac myocytes

Wu Jijun1，Han Weixing1，Liu Chao2，et al
（1Dept of Cardiovascular Medicine，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022；2Dept of Tissue Engineering Stem Cell Institute of Histology and Embryology，Anhui Medical University，Hefei 230032）

ObjectiveTo investigate the change of the expression of p22-phox before and after P19 cells differenti-ating to cardiac myocytes.MethodsAppropriate P19 cells were chosen which were cultured in vitro with 0.9% dimethyl sulfoxide（DMSO），then the induced cells were collected at different times.Western blot of cardiac troponin I（cTnI）was used to identify cell differentiation，and detect the level of p22-phox before and after the differentiation.Results①On the 8th day cTnI was detected positive in P19 cells which were cultured with 0.9%DMSO，then the expression of cTnI was increased，with statistical significance（P＜0.05）.②The expression of p22-phox in differentiated P19 cells was higher than that in undifferentiated P19 cells，with statistical significance（P＜0.05）.ConclusionThe expression of p22-phox increases during the differentiation of P19 cells to cardiac myocytes，and the level of oxidative stress increases.

P19 cells；cardiac myocytes；cell differentiation；oxidative stress；p22-phox

R 331

1000－1492（2015）01－0009－04

2014－09－21接收

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81070210）

1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，合肥 230022

安徽醫(yī)科大學(xué)2組胚學(xué)教研室組織工程干細(xì)胞研究所、3診斷學(xué)教研室，合肥 230032

吳繼軍，男，碩士研究生；

韓衛(wèi)星，女，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：hwx5712＠aliyun.com