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NF-κB沉默抑制鼻咽癌5-8F細胞增殖

2015-12-16 19:25潘紅杰范才文易世江劉建翔王建紅
關(guān)鍵詞:抑制率空白對照鼻咽癌

潘紅杰,范才文,易世江,李 璐,劉建翔,王建紅,羅 琴,向 秋

NF-κB沉默抑制鼻咽癌5-8F細胞增殖

潘紅杰1,范才文1,易世江2,李 璐1,劉建翔1,王建紅1,羅 琴1,向 秋

目的探討核因子-κB(NF-κB)沉默對鼻咽癌5-8F細胞的增殖抑制作用。方法構(gòu)建NF-κB p65沉默重組質(zhì)粒表達載體pGenesil-1.2-NF-κB和陰性對照重組質(zhì)粒載體pGenesil-1.2-HK,應(yīng)用轉(zhuǎn)染試劑將重組質(zhì)粒表達載體轉(zhuǎn)染人鼻咽癌5-8F細胞,采用Western blot法檢測NF-κB p65的表達,采用MTT及流式細胞儀分析細胞增殖和細胞周期。結(jié)果NF-κB p65沉默抑制鼻咽癌5-8F細胞增殖,抑制率為(58.43±1.24)%,與對照組細胞抑制率(0)和陰性對照組細胞抑制率(17.89±4.13)%比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。NF-κB沉默組S期細胞為(42.27±0.39)%,與空白對照組(30.83±1.36)%和陰性對照組(34.88±0.85)%比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 NF-κB p65沉默抑制鼻咽癌5-8F細胞增殖,其可能是通過S期細胞阻滯起作用。

NF-κB;鼻咽癌;siRNA

核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)是Rel/NF-κB家族中的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。煙草、飲食和環(huán)境等多種因素能激活NF-κB[1]。研究[2]顯示,在淋巴瘤、前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌及卵巢癌等組織中均發(fā)現(xiàn)活化的NF-κB。沈斌等[3]研究發(fā)現(xiàn),鼻咽癌中NF-κB p65高表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期和不良預(yù)后有關(guān)。何曉松等[4]發(fā)現(xiàn)表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)下調(diào)NF-κB p65表達后,鼻咽癌移植瘤對放療的敏感性增強。抑制NF-κB活性,阻止腫瘤細胞增殖,誘導(dǎo)其凋亡。該研究選取NF-κB基因作為研究靶點,探討NF-κB p65基因沉默對鼻咽癌5-8F細胞生物學(xué)行為的影響,為NF-κB在鼻咽癌中的作用和功能研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑鼻咽癌5-8F細胞系和大腸桿菌JM109均由桂林醫(yī)學(xué)院科學(xué)實驗中心保種;質(zhì)粒表達載體pGenesil-1.2購自武漢淅瑪生物技術(shù)有限公司;高純度質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技有限公司;新生牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司;1640培養(yǎng)基購自Gibco公司;轉(zhuǎn)染試劑Effectene Transfection Reagent購自Qiagen公司;DMSO、MTT購自美國Sigma公司;鼠抗人NF-κB p65一抗購自Bioworld公司;小鼠抗人GAPDH一抗、辣根過氧化物酶山羊抗小鼠IgG二抗和BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;PVDF膜購自Millipore公司;ECL發(fā)光液購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 NF-κB特異性SiRNA質(zhì)粒表達載體的構(gòu)建

根據(jù)GenBank中人NF-κB p65的表達序列,設(shè)計、合成2條NF-κB特異性干擾序列,構(gòu)建NF-κB特異性沉默重組質(zhì)粒表達載體(pGenesil-1.2-NF-κB),正義鏈:5’-ATGGACAGCACATGCGCTGACTGATAGCCTGCGGGAAAGAGTGATCTC-3’;反義鏈:5’-CCC AAGCTTAAAAAGCAGGCTATCAGTCAGCGCATGGA CAGCACAT-3’。正義鏈:5’-AATCTCTTGAATTT ACGTTTCTCCTCAATCCGGGTGTTTCGTCCTTTC-3’;反義鏈:5’-GCGGATCCAAAAACGGATTGAGGAGA AACGTAAATCTCTTGAATT-3’。

同時設(shè)計1條陰性對照序列(HK),構(gòu)建陰性對照重組質(zhì)粒表達載體(pGenesil-1.2-HK),該序列與人的基因序列無同源性。正義鏈:5’-CCTCGACTTCATAAGGCGCATGCTTCAAGACGGCATGCGCCTTA TGAAGTCTTTTTTG-3’,反義鏈:5’-AGCTCAAAA AAGACTTCATAAGGCGCATGCCGTCTTGAAGCATGC GCCTTATGAAGTC-3’,將合成的干擾序列正義鏈和反義鏈退火,合成雙鏈DNA干擾片段,將干擾DNA片段亞克隆到pGenesil-1.2質(zhì)粒表達載體上,構(gòu)建重組NF-κB p65特異性抑制的質(zhì)粒表達載體pGenesil-1.2-NF-κB和重組陰性表達質(zhì)粒載體pGenesil-1.2-HK。

1.3 實驗分組及細胞轉(zhuǎn)染

1.3.1 實驗分組 實驗設(shè)空白對照組(未轉(zhuǎn)染載體的5-8F細胞)、陰性對照組(轉(zhuǎn)入pGenesil-1.2-HK質(zhì)粒表達載體的5-8F細胞)、實驗組(轉(zhuǎn)入pGenesil-1.2-NF-κB質(zhì)粒表達載體的5-8F細胞)。

1.3.2 細胞轉(zhuǎn)染 人鼻咽癌5-8F細胞采用RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%小牛血清,100 U/ml青霉素,100 μg/ml鏈霉素)培養(yǎng),0.25%胰酶消化細胞,將細胞接種于6孔板,接種密度為5×104/ml,每孔2 ml。細胞融合達60%~80%時,應(yīng)用Effectene Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑將構(gòu)建好的pGenesil-1.2-NF-κB和pGenesil-1.2-HK重組質(zhì)粒表達載體轉(zhuǎn)入鼻咽癌5-8F細胞,重組質(zhì)粒終濃度為0.25 μg/ml,然后于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。由于pGenesil-1.2載體表達綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP),轉(zhuǎn)染48 h后,于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞轉(zhuǎn)染效果。

1.4 Western blot法檢測NF-κB p65表達細胞轉(zhuǎn)染48 h后,去上清液,細胞用適量通用蛋白裂解液裂解,置冰上15 min,收集細胞裂解液,4℃、12 000 r/min離心30 min,收集上清液。采用BCA法測定總蛋白濃度。蛋白上樣后,采用100 V進行10%SDS-PAGE電泳分離,恒流260 mA,濕轉(zhuǎn)1.5 h將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉1 h,加入NF-κB p65一抗(1:500),70 r/min,2 h;用TBST洗4次,每次8 min,加入辣根過氧化物酶山羊抗小鼠IgG二抗,70 r/min,1.5 h,TBST洗4次,每次8 min,采用ECL發(fā)光試劑進行發(fā)光,然后進行圖像分析。同樣操作檢測GAPDH表達。

1.5 MTT法檢測細胞增殖0.25%胰酶消化細胞,調(diào)整細胞密度至2.5×104/ml,接種于96孔板,每孔接種5 000個。每組設(shè)3個復(fù)孔,細胞轉(zhuǎn)染48 h后,每孔加入MTT(5 mg/ml)20 μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。然后吸去上清液,每孔加入200 μl DMSO,振蕩10~15 min使結(jié)晶充分溶解,用酶標儀(490 nm波長)測定各孔的吸光度值(OD值)。計算細胞生長抑制率(IR)=[1-(實驗組OD值/對照組OD值)]× 100%。

1.6 流式細胞儀檢測細胞周期細胞轉(zhuǎn)染48 h后,PBS洗滌細胞3次,0.25%胰蛋白酶消化,收集細胞,1 000 r/min離心5 min,PBS洗滌2次,加70%預(yù)冷的乙醇溶液,-20℃固定過夜,1 000 r/min離心10 min,棄去乙醇,PBS洗滌2次,加入400 μl RNase A,37℃水浴30 min,加入PI染液,避光染色30 min,200~300目篩網(wǎng)過濾,采用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量數(shù)據(jù)以±s示。多組間均數(shù)比較采用(One-Way ANOVA)完全隨機的單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 重組表達質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染細胞判別重組pGenesil-1.2-HK、pGenesil-1.2-NF-κB質(zhì)粒表達載體帶有GFP,轉(zhuǎn)入細胞后,在倒置熒光顯微鏡下觀察呈現(xiàn)綠色熒光。見圖1。

2.2 pGenesil-1.2-NF-κB轉(zhuǎn)染抑制5-8F細胞NF-κB p65表達pGenesil-1.2-NF-κB轉(zhuǎn)染鼻咽癌5-8F細胞,NF-κB p65蛋白表達抑制,與對照組和陰性對照組比較,蛋白表達抑制明顯。見圖2。

2.3 NF-κB沉默對5-8F細胞增殖的影響NF-κB沉默抑制5-8F細胞增殖,抑制率為(58.43± 1.24)%,與空白對照組抑制率(0)和陰性對照組抑制率(17.89±4.13)%比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=1 971.46,P<0.05)。

2.4 NF-κB沉默對5-8F細胞周期的影響NF-κB沉默,5-8F細胞呈現(xiàn)S期阻滯,S期細胞為(42.27± 0.39)%與對照組(30.83±1.36)%和陰性對照組(34.88±0.85)%比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表1、圖3。

表1 流式細胞儀分析細胞周期(48 h)(%,n=3,±s)

與陰性對照組、空白對照組比較:*P<0.05

組別G1期F值G2期F值S期F值空白對照59.37±1.309.80±0.6330.83±1.36陰性對照56.13±1.30 33.83 9.00±0.46 39.34 34.88±0.85 110.97實驗52.14±0.365.59±0.7342.27±0.39*

3 討論

鼻咽癌是一種好發(fā)于鼻咽黏膜的惡性腫瘤。由于鼻咽癌發(fā)病十分隱匿,早期癥狀和體征不明顯,缺乏有效的早期診斷方法,絕大多數(shù)病例在就診時已屬中晚期,治療效果仍不佳,Ⅳ期鼻咽癌患者5年生存率為30%~50%[5]。深入研究鼻咽癌發(fā)病的分子機制,尋找新的治療方法是提高鼻咽癌整體療效的關(guān)鍵。siRNA技術(shù)是將一段與目的基因同源的雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)導(dǎo)入細胞,使mRNA發(fā)生特異性的降解,從而實現(xiàn)序列特異性沉默[6]。方法簡單易行、快速、有效、序列特異性強等優(yōu)點,并且導(dǎo)入多種dsRNA可以同時敲除多個基因,細胞轉(zhuǎn)染后幾天就可觀察到靶向基因沉默后的生物學(xué)現(xiàn)象。該研究所用的pGenesil-1.2載體帶有GFP,在倒置熒光顯微鏡下,通過觀察細胞綠色熒光蛋白表達情況,并分析細胞的轉(zhuǎn)染效率,5-8F細胞轉(zhuǎn)染效率為70%~80%。

NF-κB作為一類核轉(zhuǎn)錄因子,多以P50/p65二聚體的形式存在[7]。當(dāng)細胞在非刺激狀態(tài)下,NF-κB與它的抑制物IκB結(jié)合,并以一種靜息的形式存在于細胞質(zhì),當(dāng)細胞受到損傷等刺激后,IκB降解,活化的NF-κB釋放并轉(zhuǎn)移至細胞核,調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄[8]。許多癌癥患者的癌組織中均發(fā)現(xiàn)活化的NF-κB,如白血病、淋巴瘤、前列腺癌、乳腺癌、肝癌等[9]。資料顯示,在腫瘤發(fā)展的后期階段,使用IκB的超級抑制物進行誘導(dǎo),抑制NF-κB的活化,導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的肝細胞發(fā)生細胞凋亡,進而阻滯肝細胞癌的進展[10]。該研究通過構(gòu)建NF-κB p65沉默重組質(zhì)粒表達載體pGenesil-1.2-NF-κB,觀察其轉(zhuǎn)染鼻咽癌細胞后的生物學(xué)作用。Western blot檢測表明:pGenesil-1.2-NF-κB質(zhì)粒表達載體轉(zhuǎn)染抑制5-8F細胞NF-κB p65表達,與空白對照組和陰性對照組比較,NF-κB p65蛋白表達明顯下降。說明NF-κB p65 siRNA能抑制5-8F中NF-κB p65蛋白的表達。干擾表達載體轉(zhuǎn)染細胞48 h,實驗組細胞增殖抑制率為(58.43±1.24)%,明顯高于空白對照組抑制率(0)和陰性對照組抑制率(17.89±4.13)%。NF-κB質(zhì)粒表達干擾載體轉(zhuǎn)染,抑制5-8F細胞增殖,呈現(xiàn)S期阻滯。作者構(gòu)建的NF-κB特異性干擾質(zhì)粒表達載體能沉默NF-κB基因,抑制細胞增殖,為鼻咽癌的靶向治療提供了實驗基礎(chǔ)。

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NF-κB silencing inhibits the proliferation of nasopharyngeal carcinoma 5-8F cell

Pan Hongjie1,F(xiàn)an Caiwen1,Yi Shijiang2,et al
(1Dept of Pathology and Pathophysiology,Guilin Medical College,Guilin 541004;2Dept of Otorhinolaryngology,The Affiliated Hospital of Guilin Medical College,Guilin 541001)

ObjectiveTo evaluate the inhibition effects of nuclear factor-κB(NF-κB)silencing in the nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells.MethodsConstructing the NF-κB SiRNA expression vector pGenesil-1.2-NF-κB and emptor pGenesil-1.2-HK,and then they were transfected into nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells.Western blot was used to detect expression of NF-κB p65 protein.MTT and flow cytometry were used to evaluate the proliferation inhibition and the cell cycle arrest in 5-8F cells respectively.ResultsNF-κB p65 silencing could inhibit the proliferation of nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells and the inhibition rate was(58.43±1.24)%,0%in the control group and(17.89±4.13)%in the empty vector control group,and the difference was statistically significant(P<0.05).The cell number of S phase was(42.27±0.39)%in NF-κB silencing group,(30.83±1.36)%in the control group and(34.88±0.85)%in the empty vector control group,and the difference was statistically significant(P<0.05).ConclusionThe NF-κB p65 knockdown decrease cell proliferation in nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells,maybe due to cell cycle arresting in S phase.

nuclear factor-κB;nasopharyngeal cancer;siRNA

R 739.6

1000-1492(2015)01-0016-04

2014-09-27接收

國家自然科學(xué)基金(編號:81260344);廣西研究生教育創(chuàng)新項目(編號:YCSZ2012110);廣西高等學(xué)校優(yōu)秀人才資助計劃項目;廣西自然科學(xué)基金(編號:2013GXNSFAA019228);桂林市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目(編號:20130120-19)

1桂林醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室,桂林 5410042桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,桂林 541001

潘紅杰,女,碩士研究生;向 秋,男,教授,碩士生導(dǎo)師,責(zé)任作者,E-mail:guilin996@163.com

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