孟慧芝，孫 濤，岳志芹，王文斌

（1.山東出入境檢驗檢疫局，山東青島 266000；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，山西太谷 030801）

基于血凝素裂解位點的DNA條形碼在A型流感病毒分型中的應(yīng)用

孟慧芝1，2，孫 濤1，岳志芹1，王文斌2

（1.山東出入境檢驗檢疫局，山東青島 266000；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，山西太谷 030801）

為了建立一種快速鑒別AIV的HA亞型的RT-PCR方法，本研究探討了流感病毒血凝素裂解位點基因作為DNA條形碼對A型流感病毒進(jìn)行亞型鑒定的可行性。通過生物信息學(xué)方法對16種A型流感病毒的血凝素基因全長進(jìn)行比對，在HA裂解位點的兩端高度保守區(qū)設(shè)計一對DNA條形碼引物，RT-PCR擴(kuò)增獲得約170bp的核苷酸片段。利用MEGA5.0軟件構(gòu)建N-J系統(tǒng)樹并計算亞型間及亞型內(nèi)平均遺傳距離。結(jié)果顯示，不同A型流感病毒裂解位點氨基酸具有單系性，每一亞型可分別形成各自獨立的分支。不同亞型間平均遺傳距離為0.277，相同亞型內(nèi)平均遺傳距離0.032。研究表明，利用DNA 條形碼技術(shù)可在A型流感病毒分型方面進(jìn)行有效的分子分類鑒定。

A型流感病毒；血凝素（HA）；DNA條形碼；亞型鑒定

根據(jù)表面糖蛋白血凝素（hemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）的抗原性差異，A型流感病毒可分為18種HA亞型和11種NA亞型[1-2]。Alexander[3]在對16%野生水禽原始泄殖腔樣品檢測時發(fā)現(xiàn)，A型流感病毒存在種群的準(zhǔn)種，存在兩到五個不同血凝素亞型混合感染，流感病毒變異快、宿主范圍廣，每年暴發(fā)的流感差異也表明流感在不同宿主間交叉?zhèn)鞑ビ宇l繁[4]，給病毒的全面準(zhǔn)確檢測帶來了極大的挑戰(zhàn)。

DNA 條形碼技術(shù)是近年來發(fā)展最迅速的學(xué)科之一[5]，它通過使用一段標(biāo)準(zhǔn) DNA片段，可對物種或型別進(jìn)行快速、準(zhǔn)確地鑒定。其工作的核心是

尋找適合的條形碼序列，一方面足夠保守能夠利用通用引物進(jìn)行大范圍擴(kuò)增，另一方面足夠變異能夠區(qū)分密切相關(guān)的物種或亞型[6]。

Lee[7]等人曾用coI基因鑒別出了含禽流感病毒的26種野生鳥類，為研究候鳥流感流行病學(xué)的規(guī)律和宿主種群生態(tài)學(xué)提供依據(jù)。但對病毒亞型本身的條碼技術(shù)開發(fā)尚未見相應(yīng)報道，因此本研究擬嘗試開發(fā)更加廣譜、便捷的通用流感病毒監(jiān)測技術(shù)用以監(jiān)測流感病毒。

1 材料和方法

1.1 毒株及載體

豬流感H1N1，馬流感H3N8，禽流感H2N9、H4N1、H5N1、H7N2、H9N2、H13N6、H16N3病毒核酸樣本由本實驗室保存；H6N5、H8N4、H10N8、H11N6、H12N5、H14N5、H15N8病毒核酸樣本由吉林省出入境檢驗檢疫局惠贈（具體毒株信息見表1）；16份毒株的HA亞型采用常規(guī)HI抗體血清反應(yīng)進(jìn)行確認(rèn)；DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞及pMD-18T克隆載體為Takara公司產(chǎn)品。

表1 本研究所用的A型流感病毒株序列信息

1.2 分子生物學(xué)試劑

Rneasy Mini Kit為QIAGen公 司 產(chǎn) 品；1 st strand cDNA Synthesis Kit cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、EX-Taq聚合酶、Solution Ⅰ連接酶、Agarose Gel DNA Extration Kit試劑盒、Plasmid Purifi cation Kit試劑盒均為Takara公司產(chǎn)品。

1.3 基因組提取及反轉(zhuǎn)錄

按QIAGen RNA提取試劑盒操作步驟提取RNA，每份病毒RNA樣品溶解于50μL的Rnasefree ddH2O，1 2000 r/min離心2 min，立即開始反轉(zhuǎn)錄，避免RNA降解。以U12 5'-agcaaaagcagg-3'為引物[8]，參照Takara公司1 st strand cDNA Synthesis Kit cDNA試劑盒使用說明加入試劑，RT反應(yīng)條件為：30℃10min，42℃40 min，70 ℃15min，-20 ℃保存。

1.4 引物設(shè)計與PCR擴(kuò)增

在NCBI流感病毒庫中，批量下載16種亞型的HA的全長序列，每個亞型50條（除H16），同一區(qū)域同一年代只選一個代表株，通過MEGA5.0軟件的Align程序比對所有HA亞型全長基因，尋找流感病毒HA的標(biāo)志序列，設(shè)計DNA條碼引物并送invitrogen公司合成。上游引物：GGRRRATGCCCCARRTAYRT，下游引物：CGTA GTCCGAACATTGAGTTBYKATGNYKRWADCCR TACCA。因擴(kuò)增產(chǎn)物G+C含量百分比不同，退火溫度會有差異，故PCR反應(yīng)采用touch-down程序：94 ℃2 min，｛94 ℃ 30 s，53 ℃30 s每個循環(huán)遞減1 ℃直到45 ℃；68 ℃ 45 s｝8個循環(huán)。｛94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，68 ℃ 45 s｝30個循環(huán)，68 ℃10 min。-20 ℃保存。

1.5 連接與轉(zhuǎn)化

PCR產(chǎn)物的回收按Agarose Gel DNA Purifi cation Kit 說明書進(jìn)行。將各自膠回收的PCR產(chǎn)物與pMD-18T載體1∶3比例16℃過夜連接后，取10μL加入200μL的感受態(tài)細(xì)胞懸液，42 ℃熱激1.5 min，冰上迅速冷卻，加入1 mL不含Amp LB液體培養(yǎng)基混勻，37 ℃振蕩培養(yǎng)1 h，取50μL菌液涂布于含氨芐的LB培養(yǎng)基上，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取生長狀況良好的單個菌落，再接種于含氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)。

劉勰《文心雕龍》中，標(biāo)“隱秀”一格，“是以文之英蕤，有秀有隱。隱也者，文外之重旨者也;秀也者，篇中之獨拔者也。隱以復(fù)意為工，秀以卓絕為巧”?，故所謂“隱秀感”，有兩層含義:其一，顯與隱的縱深關(guān)系，“秀”為顯，“隱”為“秀”的渾茫背景，筆者曾提出“生動在渾茫的背景里”，恰為此義;其二，奇與正的橫向關(guān)系，“秀”為奇，“隱”為正，整體之“隱”，襯托獨拔之“秀”。此原理中，“隱”接通無、渾茫的模糊，“隱”與“秀”平衡的分寸，皆是幽微玄妙，全憑感悟而得，因此獨擅此道的中國古典藝術(shù)批評，深富“隱秀感”。

1.6 測序及比對

為了評估擴(kuò)增產(chǎn)物的準(zhǔn)確性，經(jīng)鑒定為陽性菌落挑克隆培養(yǎng)菌液送寶生物測序，BLAST搜索比對，驗證所擴(kuò)增片段與已知HA各亞型的同源性和

準(zhǔn)確性。

1.7 系統(tǒng)進(jìn)化分析與遺傳距離計算

將測定的序列與GenBank中參考序列在MEGA5.0的CLAST中比對，除去兩條引物之外的序列，基于鄰接法（neighbor-joining method）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并且計算遺傳距離。運算次數(shù)為1 000，核酸替換模型為采用國際提倡的K-2P，K-2P距離與P距離相比考慮了轉(zhuǎn)換和顛換的替代率，是在變異很小時區(qū)分物種的最佳模型也是生物條形碼聯(lián)盟推薦使用的距離計算模型。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR結(jié)果

16種不同亞型的毒株RT-PCR均能擴(kuò)增出164～176 bp的目的片段，經(jīng)1%凝膠電泳，與預(yù)期大小相符（圖1）。

圖1 16株不同實驗株HA裂解位點RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

代表16個不同亞型的16個流感病毒測試樣品，經(jīng)BLAST搜索結(jié)果證實基于HA裂解位點的DNA條形碼所識別亞型與全長測序一致。

2.3 16株毒株的裂解位點氨基酸分析結(jié)果（圖2）

裂解位點的氨基酸翻譯分析顯示：H5N1有明顯的AGAAAAAAGCGA插入，翻譯蛋白為RKKR。裂解位點內(nèi)發(fā)現(xiàn)有連續(xù)多個堿性氨基酸，為高致病性AIV的分子特征。原病毒經(jīng)哈爾濱獸醫(yī)研究所國家禽流感參考實驗室檢測，病毒靜脈接種致病指數(shù)（IVPI）鑒定結(jié)果為2.6，符合OIE規(guī)定的靜脈致病的1.2以上的強(qiáng)毒特征，其他測試毒株均為低致病性毒株。

圖2 16株實驗株HA裂解位點氨基酸位點分析結(jié)果

2.4 HA0分子進(jìn)化樹分析結(jié)果

選擇與每個HA結(jié)合的不同NA亞型代表株構(gòu)建N-J進(jìn)化樹，本實驗所用毒株前面均加三角號，由圖3、圖4可知，所有A型流感病毒的HA裂解位點處核苷酸序列均有一個共同的祖先，H1、H2、H3、H4、H5、H6、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H16、H17、H18均能形成各自獨立的分支。但對于H7和H15亞型，由于親緣關(guān)系較近，種間差異較小，種內(nèi)和種間的遺傳變異存在重疊。而對于氨基酸序列而言，每個DNA條形碼擴(kuò)增所得的氨基酸序列，均能在不同HA亞型的個體間形成單系，并能幫助準(zhǔn)確識別亞型多樣性。

2.5 遺傳距離計算

由于基于所選區(qū)域核酸序列選擇K-2P遺傳距離仍然無法區(qū)分H7和H15，兩者之間親密度很高，所以選用蛋白序列來計算遺傳距離，采用MEGA5.0 中的Distance 模塊，Variance Estimation Method設(shè)置為Bootstrap method，1 000次，氨基酸替換模型為P-distance。所得裂解位點的蛋白遺傳距離，H1-H16亞型內(nèi)的遺傳距離最大值分別為：0.121、0.085、0.155、0.068、0.136、0.119、0.121、0.068、0.186、0.083、0.068、0.102、0.085、0.034、0.033、0.051，H1、H5、H7、H9遺傳距離變化范圍較大，可能是這些亞型宿主范圍廣，遺傳變異復(fù)雜，多個分支并存所致[9-10]。而H4、H14、H15僅在野生鳥類分離到變化幅度較小。H1-H16亞型內(nèi)的平均遺傳距離分別為：0.038、0.026、0.046、0.015、0.054、0.038、0.049、0.024、0.060、0.041、0.020、0.033、0.025、0.011、0.014、0.020。亞型內(nèi)遺傳距離平均

值為0.032，16種不同亞型間平均遺傳距離為0.277。

圖3 16種不同A型流感亞型裂解位點核酸序列比對圖

圖4 16種不同A型流感亞型裂解位點氨基酸序列比對圖

3 討論

本研究通過對不同宿主、地域的16種A型流感病毒的HA0裂解位點序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)裂解位點處氨基酸序列可作為區(qū)分各亞型的DNA條碼，比傳統(tǒng)方法更具敏感性和特異性。Hebet[5]曾提出利用條形碼序列有效鑒別的關(guān)鍵點是種間的遺傳距離必須大于種內(nèi)，且距離差異大約為10倍。本研究中的型間平均遺傳距離為0.277，高于型內(nèi)平均遺傳距離0.032。分析系統(tǒng)樹顯示，各亞型均能獨立形成單系。

目前，實驗室廣泛推廣的流感檢測方法是基于M基因或NP基因進(jìn)行的TaqMan實時熒光PCR檢測方法[11-12]，但常規(guī)診斷存在對H5、H7以及其他亞型的RT-PCR檢測逃避[13]。實時熒光定量RTPCR實驗對HA亞型特異性鑒定不完整現(xiàn)象，不能完全鑒定16種亞型。而通過PCR和進(jìn)一步的測序程序是全面確定樣本中HA亞型的有力證據(jù)。Hoffman等曾設(shè)計引物[8]采用全基因擴(kuò)增進(jìn)行流感鑒定，但需要大量優(yōu)化，產(chǎn)物得率較低且雜帶較多，不適于實際的常規(guī)監(jiān)測或診斷[14]?；蛐酒夹g(shù)[15]則需專業(yè)設(shè)備和人員，難以推廣；本文利用DNA條形碼技術(shù)思路，采用傳統(tǒng)RT-PCR檢測方法，優(yōu)選touch-down程序可以快速判定有無流感病毒，并能同時測定A型流感病毒的亞型及致病型，是一種更簡單，快速的流感分型診斷程序。

HA0裂解位點的氨基酸序列是AIV致病力的分子基礎(chǔ)，直接影響病毒致病力的高低[16-17]。通常情況下，高致病性禽流感病毒在HA0裂解位點處具有多個精氨酸和賴氨酸，并有明顯的插入或替代[18]，可被多種蛋白酶裂解[19]。從高致病性禽流感流行歷史來看，隨著病毒的不斷擴(kuò)散和對宿主適應(yīng)性的增強(qiáng)，病毒的毒力可通過未知的機(jī)制發(fā)生改變而對禽類的致病力增強(qiáng)，高致病力毒株均由低致病性病毒的前體發(fā)生突變導(dǎo)致[20-21]。因此，本文利用DNA條形碼技術(shù)對流感病毒各亞型的裂解位點進(jìn)行分析，可為及時處理傳染性材料的風(fēng)險提供有效手段[22]。

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（責(zé)任編輯：胡藕祥）

Application of DNA Barcoding Based on Hemagglutinin Cleavage Site for Infl uenza A Virus Sub-typing

Meng Huizhi1，2，Sun Tao1，Yue Zhiqin1，Wang Wenbin2
（1.Shandong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Qingdao，Shandong 266000；2.Shanxi Agricultural University，Taigu，Shanxi 030801）

The feasibility of the hemagglutinin cleavage sites used as DNA barcoding to subtype influenza A virus was explored in the study. According to the alignment of the hemagglutinin gene of 16 subtypes of infl uenza A virus by bioinformatics means，a pair of primers were designed on both terminals of highly conserved of hemagglutinin cleavage site.170bp products were obtained by RT-PCR. Then phylogenetic tree was constructed and the average intratype variation and inter-type divergence were calculated with MEGA5.0 software. The phylogenetic tree revealed that amino acid composition of cleavage site was of monophyly in each subtype. The average genetic distance of inter-type was 0.277，and intra-type genetic distance was 0.032. It was concluded that the hemagglutinin DNA barcoding can be used for subtyping infl uenza A virus effectively.

infl uenza A virus；hemagglutinin（HA）；DNA barcoding technology；subtype

S852.65

A

1005-944X（2015）07-0055-07

國家科技支撐計劃（2012BAK11B00）

孫 濤