楊新建 ， 段素云 ， 肖海峻 ， 田 璐， 王偉青 ， 羅紅霞 *

（1.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，北京房山 102442；2.農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京海淀 100081；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所基因工程研究室，北京海淀 100081）

花生餅（粕）是脫殼花生經(jīng)壓榨或浸提取油后的副產(chǎn)物，其營養(yǎng)豐富，粗蛋白質(zhì)含量比豆粕大約高出3%（Hwang等，2010）；多糖含量高達(dá)32.5%；代謝能水平在所有餅粕類飼料中最高；并含有Mg、K、Ca、Fe、Na、Zn、P、Cu、Mn 等多種礦物質(zhì)元素。目前，用動(dòng)植物蛋白制備多肽已成為了研究熱點(diǎn)，這種多肽被認(rèn)為具有良好的理化性質(zhì)和水合性質(zhì)，其溶解度增加，黏度降低，凝膠性降低，發(fā)泡性降低，無過敏反應(yīng)，消化吸收性好（劉大川和周俊梅，2008；Byun，2001；Wahb，1998），并且具有抗氧化特性，能夠清除體內(nèi)自由基，達(dá)到延長細(xì)胞壽命的作用（劉大川，2013；Sarmadi和 Ismail，2010）。本研究以花生餅（粕）作為基質(zhì)，采用固態(tài)發(fā)酵技術(shù)，以枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、黑曲霉、米曲霉、產(chǎn)朊假絲酵母、釀酒酵母、植物乳酸桿菌為備選菌株，花生多肽產(chǎn)量為考察指標(biāo)，篩選獲得多肽產(chǎn)量高、穩(wěn)定的發(fā)酵菌株。旨在為今后優(yōu)化發(fā)酵工藝，提高多肽產(chǎn)量、品質(zhì)及活性研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 候選菌種 芽孢桿菌：枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌；霉菌：黑曲霉、米曲霉；酵母：產(chǎn)朊假絲酵母、釀酒酵母；乳酸菌：植物乳酸桿菌。上述菌種均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所基因工程研究室保存。

1.1.2 花生粕（餅） 試驗(yàn)用花生粕（餅）分別購自山東魯花集團(tuán)有限公司、天津宇順國際貿(mào)易有限公司、北京鶴來科技有限公司、萊州市三元花生油加工廠，粉碎過40目篩備用。

1.1.3 培養(yǎng)基

1.1.3.1 活化培養(yǎng)基 霉菌、酵母培養(yǎng)基：馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）。芽孢桿菌培養(yǎng)基：LB固體培養(yǎng)基。乳酸菌培養(yǎng)基：MRS固體培養(yǎng)基。

1.1.3.2 擴(kuò)大培養(yǎng)基 活化培養(yǎng)基（液體）。

1.1.3.3 固體發(fā)酵培養(yǎng)基 滅菌后的基質(zhì)（90%花生粕和 10%麩皮）和水按 1∶1（w/w）的比例混合，自然pH。

1.1.4 試劑 牛血清白蛋白、葡萄糖、硫酸銅（CuSO4·5H2O）、酒石酸鉀鈉（NaKC4H4O6·4H2O）、氫氧化鈉、碘化鉀、三氯乙酸（TCA）、石油醚（沸程60～90℃）、3，5-二硝基水楊酸、重蒸酚 （結(jié)晶酚）、亞硫酸鈉等均為分析純。

1.1.5 設(shè)備 全自動(dòng)凱氏定氮儀 （型號：KDY-9830，品牌：KETUO）、紫外可見分光光度計(jì)（T6，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）、索氏提取器（SXT-06、上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司）、電熱恒溫水浴鍋等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花生粕基本成分測定 粗蛋白質(zhì)測定采用凱氏定氮法（GB/T 5009·5-2010）；粗脂肪測定按GB/T 5009·6-2003 進(jìn)行；水分測定按 GB/T5009·3-2010進(jìn)行；總糖測定采用DNS法。

1.2.2 菌種活化與擴(kuò)培 芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌活化與擴(kuò)培方法：保藏菌種劃線（或涂布）相應(yīng)固體平板，在適宜條件下培養(yǎng)一定時(shí)間后，挑取單菌落于相應(yīng)液體培養(yǎng)基中，根據(jù)其生長曲線，適宜條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期末，備用。

霉菌活化與擴(kuò)培方法：保藏的斜面菌種轉(zhuǎn)接于PDA斜面培養(yǎng)基上，30℃恒溫箱中培養(yǎng)3 d，長滿大量黑色（黑曲霉）或黃綠色（米曲霉）孢子，即為活化的斜面種子。 用無菌移液管吸取5 mL無菌水加至斜面上，用接種環(huán)輕輕刮下孢子，裝入含有玻璃珠的三角瓶中，蓋好塞子振蕩數(shù)分鐘，用血球計(jì)數(shù)板測定孢子懸液的濃度，并進(jìn)行適當(dāng)稀釋后備用。

1.2.3 各菌種固態(tài)發(fā)酵花生粕試驗(yàn) （1）13.5 g花生粕+1.5 g麩皮放入250 mL三角瓶中，121℃、20 min，自然冷卻并打散；（2）量取 11.2 mL 無菌水（考慮花生粕本身含水量）放入50 mL三角瓶中；并按照10%接種量（3 mL，霉菌為107個(gè)/mL的孢子懸液），接種各培養(yǎng)至對數(shù)生長期末的菌液，充分混勻；（3）將（2）中混勻好的溶液，均勻的接種到（1）中（多點(diǎn)接種），并用滅菌的玻棒打散成團(tuán)花生粕。每組三個(gè)重復(fù)，根據(jù)各菌種生長溫度培養(yǎng)48 h，每12 h翻料一次。對照：在不接種菌種的情況下，所有過程同樣品處理。

1.2.4 多肽含量測定 多肽測定參照史軍（2007）的方法進(jìn)行。

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：準(zhǔn)確稱取經(jīng)真空干燥的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)——牛血清白蛋白，用雙蒸水配制成10 mg/mL的溶液（可用1 mg牛血清白蛋白/mL在280 nm處的吸光度為0.66來校正）。放置過夜以助溶。

雙縮脲試劑：稱取0.75 g硫酸銅、3 g酒石酸鉀鈉、0.5 g碘化鉀，依次溶解于250 mL水中，攪拌下加入150 mL 10%氫氧化鈉溶液，用冷卻的通過煮沸逐出所溶解二氧化碳的蒸餾水稀釋定容至500 mL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：取小試管22支，分為兩組，分別編號0～10，按表1所示順序加入各試劑，在漩渦器上輕輕振動(dòng)混勻，于37℃水浴下反應(yīng)30 min后，用未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對照液，540 nm處測定吸光度（A）值。并取兩組測定的平均值。以溶液中蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，A540為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線（R2≥0.9990才可用）。

表1 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線具體參數(shù)

1.2.4.2 發(fā)酵樣品處理及多肽含量測定 發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵物50℃烘干，粉碎，過40目篩，取0.25 g（每個(gè)發(fā)酵樣品取2個(gè)平行），置于10 mL潔凈離心管中，加入8 mL 10%的三氯乙酸，混勻并室溫振蕩 30 min（200 r/min），然后 5000 r/min離心20 min，取上清液1 mL（記錄上清液總體積，每個(gè)樣品做2個(gè)平行），加雙縮脲試劑4 mL，于37℃水浴下反應(yīng)30 min，在540 nm處測定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算上清液中多肽含量（mg/mL）。然后再根據(jù)上清液總體積以及取樣品量計(jì)算出發(fā)酵產(chǎn)物中多肽含量/（mg/g）。

未發(fā)酵樣品：90%花生粕+10%麩皮與水按照質(zhì)量比1∶1混合后，處理同上。

1.2.5 SDS-PAGE檢測花生粕發(fā)酵前后蛋白質(zhì)分子量分布情況 分別取發(fā)酵前與發(fā)酵后的粉碎花生粕 （40目）各1.0 g，用8 mL 0.03 mol/L Tris-HCL緩沖液（pH 8.0）浸提1 h以上，然后于4℃、3000 r/min離心5 min，取上清液，再于4℃、10000 r/min離心5 min。SDS-PAGE電泳的分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%，以溴酚藍(lán)作為前沿指示劑。電泳時(shí)，取樣品0.5 mL，加入0.5 mL的上樣緩沖液，混勻后在100℃沸水浴3～5 min，再于10000 r/min離心30 s。上樣量為7 μL，樣品在濃縮膠時(shí)電壓為40 V，待溴酚藍(lán)前沿進(jìn)入分離膠后增至80 V繼續(xù)電泳，待溴酚藍(lán)距離下緣僅有0.5～1.0 cm時(shí)結(jié)束電泳。膠片經(jīng)染色和脫色后，進(jìn)行拍照。

1.2.6 備選菌株產(chǎn)多肽穩(wěn)定性試驗(yàn) 對發(fā)酵產(chǎn)多肽較多的米曲霉、地衣芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母進(jìn)行3個(gè)批次的發(fā)酵試驗(yàn)（每個(gè)批次2個(gè)重復(fù)），并測定其多肽含量，驗(yàn)證各備選菌種產(chǎn)多肽的穩(wěn)定性。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。P＞0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著，P＜0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著，P＜0.01為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同來源花生粕（餅）基本成分測定及樣品選擇 根據(jù)試驗(yàn)需求，分別收集了4個(gè)不同廠家的花生粕（餅），并對其營養(yǎng)成分的含量進(jìn)行了測定。測定結(jié)果見表2。

根據(jù)表2結(jié)果可知，不同來源的花生粕（餅）均含有較高含量的蛋白質(zhì)及總糖，但以來至山東魯花的樣品含量較高；而四個(gè)樣品的粗脂肪以及水分含量均較低。并且在粗脂肪含量方面，花生粕顯著低于花生餅（P=0.000＜0.01）。

表2 不同廠家花生粕（餅）營養(yǎng)成分含量%

2.2 多肽含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線 根據(jù)1.2.4所述方法，測定標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)在540 nm處吸光度 ，結(jié)果見表3。

表3 各濃度標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)在540 nm處吸收值

根據(jù)表3數(shù)據(jù)（平均值）利用Excel制作散點(diǎn)圖，計(jì)算出斜率、截距并獲得其公式，以供后面計(jì)算所用（圖 1）。

圖1 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 各菌種固態(tài)發(fā)酵結(jié)果 根據(jù)1.2.3及1.2.4中方法，測得7株供試菌發(fā)酵花生粕產(chǎn)多肽結(jié)果如圖2所示。

根據(jù)上述結(jié)果，米曲霉產(chǎn)多肽量最高，為（149.20±14.69）mg/g，產(chǎn)朊假絲酵母、地衣芽孢桿菌次之。同時(shí)，為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，對各菌種發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行多肽提取，進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果見圖3。

圖2 不同菌種作用花生粕產(chǎn)多肽情況

圖3 不同菌種發(fā)酵樣品電泳圖

圖3結(jié)果顯示，產(chǎn)朊假絲酵母、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、米曲霉、釀酒酵母對花生蛋白粕均有一定的降解作用（與對照相比，大分子蛋白被不同程度降解），但以米曲霉為最好，產(chǎn)朊假絲酵母、地衣芽孢桿菌次之，與含量測定結(jié)果吻合。

2.4 備選菌種發(fā)酵制備多肽穩(wěn)定性試驗(yàn) 采用1.2.4中方法，對備選的米曲霉、產(chǎn)朊假絲酵母和地衣芽孢桿菌產(chǎn)多肽穩(wěn)定性進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖4、圖5所示。

圖4 產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵花生粕制備花生多肽穩(wěn)定性試驗(yàn)

圖5 地衣芽孢桿菌發(fā)酵花生粕制備花生多肽穩(wěn)定性試驗(yàn)

根據(jù)圖4和圖5的結(jié)果可知，首先，產(chǎn)朊假絲酵母三個(gè)批次發(fā)酵產(chǎn)物中多肽含量分別為（120.43±7.89）mg/g、（118.95±1.66）mg/g 和（110.39±1.17）mg/g（P ＞ 0.05），地衣芽孢桿菌三個(gè)批次發(fā)酵產(chǎn) 物 中 多 肽 含 量 分 別 為 （113.39±5.21）mg/g、（111.69±2.49）mg/g 和 （111.35±0.22）mg/g （P ＞0.05），產(chǎn)朊假絲酵母及地衣芽孢桿菌作用花生粕3個(gè)批次所產(chǎn)花生多肽平均值分別為 （116.59±5.42）mg/g、（112.14±1.09）mg/g， 結(jié)果差異不顯著（P＞0.05）；其次，借助 SPSS 19.0分別分析了產(chǎn)朊假絲酵母及地衣芽孢桿菌三個(gè)批次發(fā)酵結(jié)果的差異顯著性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)朊假絲酵母及地衣芽孢桿菌三個(gè)批次發(fā)酵結(jié)果均差異不顯著（P＞0.05），這說明就多肽的產(chǎn)量方面，產(chǎn)朊假絲酵母及地衣芽孢桿菌均可作為發(fā)酵菌種。但是，通過分析具體數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)朊假絲酵母和地衣芽孢桿菌三個(gè)批次發(fā)酵產(chǎn)物中多肽含量從均勻性上看，地衣芽孢桿菌更佳；同時(shí)，產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵產(chǎn)物氣味較地衣芽孢桿菌重（發(fā)酵味道更濃，中間夾雜一定的臭味），會(huì)影響發(fā)酵后花生粕作為飼料原料的適口性。而對于米曲霉，在試驗(yàn)過程中出現(xiàn)生長不佳甚至不生長的情況，與初篩結(jié)果有較大差異。

綜上，選擇地衣芽孢桿菌作為發(fā)酵菌種。

3 討論

3.1 基質(zhì)的選擇 本試驗(yàn)所用4個(gè)不同來源樣品粗蛋白質(zhì)含量均在43%以上，主要原因是花生粕是花生榨油后的副產(chǎn)物，大部分油脂被脫去，脂肪含量明顯減少，蛋白質(zhì)得到濃縮，因此花生粕（餅）作為一種高蛋白質(zhì)原料生產(chǎn)多肽有較好的優(yōu)勢。

在粗脂肪含量方面，花生餅顯著高于花生粕，這主要與花生餅/花生粕的生產(chǎn)工藝有關(guān)。脂肪作為一種營養(yǎng)物質(zhì)，可作為碳源和能源被很多微生物所利用，并可提供一定的生長因子，但是脂肪的降解不但需要有脂肪酶的存在，更需要比糖代謝更多的O2才能完全降解，不然大量的脂肪酸以及代謝中的有機(jī)酸的積累，會(huì)引起pH的顯著下降，導(dǎo)致微生物酶系統(tǒng)的作用以及微生物的正常生長代謝受到嚴(yán)重影響。因此當(dāng)花生粕（餅）作為微生物的作用基質(zhì)（培養(yǎng)基）時(shí)，尤其是在采用固態(tài)發(fā)酵形式的情況下，其粗脂肪含量不宜過高（王鏡巖等，2002）。

糖類是發(fā)酵培養(yǎng)基中應(yīng)用最為廣泛的一種碳源，是促進(jìn)微生物生長的一種速效碳源，因此花生粕（餅）中含有較高的總糖，有利于目標(biāo)微生物的生長繁殖及代謝產(chǎn)物（酶）的產(chǎn)生，進(jìn)而作用于基質(zhì)中的蛋白質(zhì)生成目標(biāo)產(chǎn)物（多肽）。

綜合所述，來自于山東魯花的樣品由于具有較高的蛋白質(zhì)和總糖含量，較低的脂肪含量，被選作為后續(xù)試驗(yàn)的樣品。

3.2 各菌種對花生粕基質(zhì)的作用效果 就粕類的發(fā)酵生產(chǎn)而言，菌種多采用以產(chǎn)蛋白酶、纖維素酶及糖化酶豐富的芽孢桿菌、霉菌等，并取得了較好的作用效果（明強(qiáng)強(qiáng)等，2014a；張友維，2012）。在本研究中，枯草芽孢桿菌并沒有表現(xiàn)出較佳的作用效果，究其原因可能是作為基質(zhì)的花生粕的碳氮比為7.5∶1，而適合枯草芽孢桿菌生長的碳氮比在 2∶1左右（葉云峰等，2011），同時(shí)采用的固態(tài)發(fā)酵方式而導(dǎo)致的通氣不暢，使其生長較差，其豐富的酶系未大量分泌，只是將大分子的花生蛋白進(jìn)行了初步降解，而降解成小肽（14 kD以下）的能力不足。

黑曲霉的作用效果與枯草芽孢桿菌類似，但比枯草芽孢桿菌更弱，尤其是產(chǎn)生小肽能力方面[（72.38±9.89）mg/g]，電泳圖譜顏色顯示更淺，并且其生長過程中產(chǎn)生大量黑色孢子，使發(fā)酵后花生粕顏色明顯變暗，嚴(yán)重影響產(chǎn)品外觀。

對于釀酒酵母，雖然含量測定 [（74.82±10.77）mg/g]及電泳圖譜均顯示其有大量的小肽產(chǎn)生，但是電泳圖譜同時(shí)顯示，花生粕大分子蛋白并未被大量降解，因此圖譜上顯示的小肽可能更多的是來至菌體產(chǎn)生的蛋白而不是降解所得。

植物乳酸桿菌由于需要厭氧的生長條件，在花生粕基質(zhì)中幾乎無生長，多肽產(chǎn)量也與對照相近 [（22.81±5.84）mg/g]。 而對于米曲霉 （鄧靜等，2008；孫春華等，2007）、產(chǎn)朊假絲酵母（何東東，2010）和地衣芽孢桿菌（胡尚勤和劉天貴，2000），由于其最適生長基質(zhì)C/N與花生粕較為相近，生長情況良好，并產(chǎn)生大量的蛋白酶、淀粉酶及纖維素酶等酶類，降解花生粕并產(chǎn)生大量多肽。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過測定不同來源的花生粕（餅）的基本成分，確定了具有較高的粗蛋白質(zhì)、總糖含量，較低的脂肪含量的樣品作為后續(xù)試驗(yàn)的樣品。然后采用固態(tài)發(fā)酵技術(shù)，以花生多肽產(chǎn)量為考察指標(biāo)，并通過SDS-PAGE試驗(yàn)及產(chǎn)多肽穩(wěn)定性試驗(yàn)，從枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、黑曲霉、米曲霉、產(chǎn)朊假絲酵母、釀酒酵母、植物乳酸桿菌等7株菌株中篩選出多肽產(chǎn)量高、穩(wěn)定的地衣芽孢桿菌為目標(biāo)發(fā)酵菌株。為后續(xù)優(yōu)化發(fā)酵工藝，提高多肽產(chǎn)量、品質(zhì)及活性打下了良好基礎(chǔ)。

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