侯慧敏，陳云，陳偉，母智深

（內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團）股份有限公司研發(fā)中心，內(nèi)蒙古呼和浩特011500）

0 引言

酵母β-葡聚糖是一種具有增強免疫力、抗腫瘤炎癥與降血脂膽固醇等諸多營養(yǎng)價值和生理功能[1]。這使得酵母β-葡聚糖在食品行業(yè)有了更為廣泛的應(yīng)用前景[2]。

本實驗主要對添加有酵母β-葡聚糖的牛奶中的酵母β-葡聚糖的回收方法進行了深入研究，并引用美國藥典FCC的葡聚糖原料檢測方法對回收得到的酵母β-葡聚糖質(zhì)量分數(shù)進行檢測，建立了了牛奶中酵母β-葡聚糖的檢測方法。該法精密度較高，重復(fù)性良好，解決了準確測定添加在牛奶中的酵母β-葡聚糖含量的難題。

1 實驗

1.1 試劑與設(shè)備

酵母β-葡聚糖（純度≥70%），添加有0.06%的酵母β-葡聚糖的牛奶樣品，溶壁酶（也可使用相同品質(zhì)的其他產(chǎn)品），1，6-葡聚糖酶溶液，拋光酶混合溶液（E-EXBGL 200 U/mL，200 U/bottle），葡糖氧化酶/過氧化物酶緩沖液（Megazyme，200 U/bottle），葡聚糖氧化酶/過氧化物酶試劑（GOPOD溶液），堿性蛋白酶（酶活2.4 U/g），中性蛋白酶（酶活0.8 U/g）。

himac CR212GⅡ冷凍離心機，Xs204天平，恒溫水浴鍋，渦旋振蕩器，紫外分光光度計，冷凍干燥機，水浴搖床。離心機（轉(zhuǎn)速6 000 r/min），50 mL尖底離心管，0.45 μm 微孔水相濾膜，天平（感量 0.1 g，1 mg，0.1 mg）。

1.2 牛奶中酵母β-葡聚糖的檢測方法

1.2.1 蛋白酶解法

a、稱取25 g液態(tài)乳，置于50 mL尖底離心管中，加入堿性蛋白酶0.048 U和中性蛋白酶0.016 U，充分振蕩混合后于約50℃水浴加熱2～3個小時，得到水解液；

b、將水解液振蕩混合均勻后，于6 000 r/min離心，去掉上清液，保留沉淀物及上層脂肪；

c、向步驟b得到的沉淀物和上層脂肪中加入的去離子水，振蕩混合均勻后，于6 000 r/min離心，去掉上清液及上層脂肪，保留沉淀；

d、將步驟c中得到的沉淀用水清洗一至兩次，得到提取物；用水清洗的方法為：加入去離子水，振蕩混合均勻后，于6 000 r/min離心，去掉上清液，保留沉淀；

e、將步驟d得到的提取物冷凍干燥，冷凍干燥，得到干燥提取物。

回收得到的葡聚糖沉淀參考美國藥典FCC的葡聚糖原料檢測方法對回收的酵母β-葡聚糖經(jīng)過酶解轉(zhuǎn)換為葡萄糖溶液[3]。

1.2.2 葡萄糖檢測

（1）標準曲線的制備。葡萄糖梯度溶液為0，0.05，0.125，0.25，0.5 g/L（均為質(zhì)量濃度），溶劑是水；繪制標準曲線。

（2）GOPOD法檢測[4]。向上述得到的待測液和葡萄糖梯度溶液中分別加入3 mL GOPOD溶液，40℃水浴中保持20 min；最后冷卻至室溫并在510 nm下測定吸光值，測定采用分光光度計，其中紫外吸收波長為510 nm,檢測器為Super Emulsion TSM-09，購自太陽化學(xué)株式會社。根據(jù)葡萄糖梯度溶液對應(yīng)的吸光值繪制標準曲線，并根據(jù)標準曲線斜率計算出待測液中葡萄糖的含量，具體計算公式為

C=（ABSX-ABSS）/slop，

式中：ABSX為待測液對應(yīng)的吸光值；ABSS為空白對照樣對應(yīng)的吸光值；slop為標準曲線斜率；C為待測液中葡萄糖的質(zhì)量濃度，g/L。

（3）計算待測液態(tài)乳中酵母β-葡聚糖的質(zhì)量分數(shù)

X=100%×C/｛[（WTs/F1）（F2/F3）]/A｝，

式中：X為待測液態(tài)乳中酵母β-葡聚糖的質(zhì)量分數(shù)，mg/100 g；C為比色皿中葡萄糖質(zhì)量濃度，g/L；WTs=樣品質(zhì)量，mg；F1=試管中細胞酶酶解時的體積，2.6 mL；F2=在（1，6）葡聚糖酶解過程是轉(zhuǎn)移至新試管中的樣品，0.130 mL；F3=β-葡聚糖酶、葡聚糖苷酶酶解時的總體積，0.845 mL；A為待測液稀釋系數(shù)。

2 結(jié)果分析

葡萄糖的標準曲線方程為y=1.088x+0.019，R2=0.99。三種成品蛋白酶前處理方法得到的葡聚糖質(zhì)量分數(shù)檢測結(jié)果為0.31087，0.3035，0.2991 mg/g，平均值為0.3045 mg/g，相對標準偏差RSD為5.1%。

由上述可以看出，蛋白酶處理的樣品葡聚糖回收率較高，質(zhì)量分數(shù)達到了產(chǎn)品要求的檢出量0.30 mg/g，并且偏差也較小。從實驗可以分析得出，使用蛋白酶處理樣品更適合作為提取葡聚糖的前處理方法，但是此方法還需進一步優(yōu)化。

3 蛋白酶解條件優(yōu)化

基于實驗的結(jié)果，試選用堿性蛋白酶和中性蛋白酶共同作用水解牛奶蛋白。堿性蛋白酶和中性蛋白酶是使用較多的蛋白酶，單酶水解能力有限，水解度不高，采用雙酶協(xié)同水解可在較短時間內(nèi)獲得較高水解度，生成相對分子量較小的多肽。在蛋白質(zhì)的酶催化水解中，蛋白質(zhì)的水解度是衡量蛋白質(zhì)水解程度的一個重要指標。采用pH-state法研究了中性蛋白酶/堿性蛋白酶復(fù)合酶的用量和酶解時間對佑益牛奶蛋白水解度的影響?？疾炝?.02%，0.05%，0.1%，0.15%與0.2%中性/堿性蛋白酶添加量，酶解6 h的蛋白水解率，結(jié)果顯示0.1%的中性/堿性復(fù)合蛋白酶用量為最佳?？疾?.1%中性/堿性蛋白酶用量，酶解0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，6.0 h的牛奶水解度，結(jié)果表明，酶解最佳時長為3 h。

通過上述研究，確定了新養(yǎng)道佑益牛奶中酵母葡聚糖檢測的最佳條件：以堿性蛋白酶0.048 U和中性蛋白酶0.016 U；確定了最佳水解條件：水解溫度為55℃，水解時間3 h。

4 結(jié)果與討論

4.1 精密度實驗

按照優(yōu)化后的蛋白酶解方法進行精密度驗證實驗。制得6份平行試樣溶液，測得葡聚糖質(zhì)量分數(shù)為0.3336，0.3322，0.3273，0.3298，0.3304，0.3417 mg/g；RSD為1.5%。

由此可以看出，經(jīng)優(yōu)化后的蛋白酶解法的葡聚糖回收率得到了提高，相對標準偏差RSD為1.5%，說明檢測結(jié)果穩(wěn)定很好。

4.2 回收率

將牛奶樣品制作為添加量為0.06%的70%，100%，130%的酵母β-葡聚糖牛奶。每個添加質(zhì)量重復(fù)3次實驗，結(jié)果如表1所示。

通過對不同添加量的葡聚糖牛奶經(jīng)過回收率測定驗證后發(fā)現(xiàn)，檢測到的回收率都很高，并在添加量較多的牛奶中葡聚糖回收率更高。通過此驗證，發(fā)現(xiàn)該方法的檢測穩(wěn)定性較高，RSD值均≤5%。

4.3 日間重現(xiàn)性

對樣品進行了日間重復(fù)性的驗證實驗，結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，檢測方法的重復(fù)性較高，結(jié)果較穩(wěn)定。

表1 牛奶中葡聚糖加標回收率（n=6）

表2 日間重現(xiàn)性實驗

5 結(jié)論

本文建立的酶解法測定牛奶中酵母β-葡聚糖質(zhì)量分數(shù)的檢測方法，其前處理方法更簡單，回收率較高，結(jié)果重復(fù)性好。用該方法檢測到的含量值達到了產(chǎn)品要求的檢出量30 mg/100 g。檢測精密度和穩(wěn)定性高，均能滿足檢驗要求，適用于作為牛奶中酵母β-葡聚糖質(zhì)量分數(shù)的測定方法。

[1]KOGAN G.（1-3，1-6）D-Glucans of yeasts and fungi and their biological activity[J].Studies in Natural Products Chemistry，2000（23）：107-152.

[2]MAGNELLI P，CIPOLLO J F，ABEIJON C.A refined method for the determination of saccharomyces cerecisiae cell wall composition and beta-1，6-glucan fine structure[J].Analytical Biochemistry，2002，301（1）：136-150.

[3]Glucan Enzymatic Method（GEMTM）Third Supplement，F(xiàn)CC7：1687-1689.

[4]MARIA J M,AIDA S,XENIA B,et al.Adaptation of the standard enzymatic protocol（Megazyme method）to microplaque format for β-（1,3）（1,4）-d-glucan determination in cereal based samples with a wide range of β-glucan content[J].Journal of Cereal Science,2014,59（2）：224-227

[5]陳少峰，望忠福.高效液相色譜法測定酵母β-葡聚糖[J].食品科技，2009（7）：278-280

[6]李江林,謝愛英,劉勁文.酵母葡聚糖在低脂牛奶中的應(yīng)用研究[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2012，32（7）：7-8.