池海波，李燁

（江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122）

0 引言

乳桿菌類(lèi)乳酸菌是益生菌的重要類(lèi)群，能通過(guò)生物拮抗和免疫調(diào)節(jié)作用抑制病原菌在機(jī)體內(nèi)定植、繁殖以及致病能力。羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）天然存在于人體和動(dòng)物體腸道內(nèi)，具有抑制病原菌、調(diào)節(jié)機(jī)體腸道微生物菌群的平衡、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等生理活性和保健功能[1]，是國(guó)際上公認(rèn)的新型益生乳酸菌，具有很高的理論研究和應(yīng)用價(jià)值。

為了深入探究羅伊氏乳桿菌的抑菌和免疫調(diào)節(jié)性能，本文以L.reuteri ATCC53608為研究對(duì)象，3株分離自發(fā)酵乳制品的益生乳酸桿菌為比對(duì)，研究并比較了羅伊氏乳桿菌不同培養(yǎng)的上清液對(duì)單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、阪崎克羅諾桿菌、大腸桿菌4種指示菌的體外抑菌性能，以小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7為細(xì)胞模型，研究羅伊氏乳桿菌對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)性能，為羅伊氏乳桿菌益生性能的的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

1.1.1 供試菌株和細(xì)胞

羅伊氏乳桿菌ATCC53608（Lactobacillus reuteri ATCC53608）、嗜酸乳桿菌 237（Lactobacillus acidophilus 237）、嗜酸乳桿菌234（Lactobacillus acidophilus 234）、植物乳桿菌 233（Lactobacillus plantarum 233）、大腸桿菌（Escherichia coli W3110）、金黃色葡萄球菌ATCC25923（Staphylococcus aureus ATCC25923）、阪崎克羅諾桿菌BAA-894（Cronobacter sakazakii BAA-894）、單增李斯特菌CMCC54005（Listeria monocytogenes CMCC54005）均為本實(shí)驗(yàn)室保存，其中嗜酸乳桿菌237、嗜酸乳桿菌234、植物乳桿菌233分離自發(fā)酵乳制品，小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 培養(yǎng)基

羅伊氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌的培養(yǎng)基為MRS，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、阪崎克羅諾桿菌、單增李斯特菌培養(yǎng)基為L(zhǎng)B，小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7培養(yǎng)液為DMEM（Gibco BRL,USA），并添加10%胎牛血清（Hyclone Logan,UT,USA）、青霉素（100 U/mL）和鏈霉素（100 μg/mL）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)器材

牛津杯內(nèi)徑（6.0±0.1）mm,外徑（7.8±0.1）mm,高（10.0±0.1）mm ；Delta 320 pH 計(jì)，GHP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱，MLS-3750高溫滅菌鍋，THZ-C-1全溫振蕩器，ST-16R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，Elx800酶標(biāo)儀。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌MRS培養(yǎng)的無(wú)菌上清液的制備和處理

將4種乳酸桿菌分別以體積分?jǐn)?shù)為1%的接種量轉(zhuǎn)接于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24 h后10 000 r/min離心10 min，收集上清，過(guò)濾除菌后測(cè)上清液pH，將上清液分為3組，一組為上清原液，第二組上清液進(jìn)行加熱煮沸15 min處理，第三組上清液用濃度為4 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH值至7.0，各組上清液4℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 羅伊氏乳桿菌甘油發(fā)酵的無(wú)菌上清液的制備和處理

將羅伊氏乳桿菌以體積分?jǐn)?shù)為1%的接種量轉(zhuǎn)接于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24 h，10 000 r/min下離心10 min，上清過(guò)濾備用并收集菌體，用0.05 mol/L的磷酸鉀緩沖液（pH=7.2）洗滌菌體兩次，洗滌后的菌體用磷酸鉀緩沖液制成菌懸液（菌體濃度1.0×108mL-1），再加入等體積的濃度為0.4 mol/L的甘油，37℃靜置培養(yǎng)2～6 h。分別在培養(yǎng)2 h和6 h時(shí)離心收集上清，過(guò)濾除菌后，一部分上清液4℃貯存?zhèn)溆?，另一部分上清液進(jìn)行加熱煮沸15 min處理后4℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 指示菌菌懸液的制備

將4種指示菌分別轉(zhuǎn)接于LB培養(yǎng)液，37℃振蕩培養(yǎng)18 h，用無(wú)菌生理鹽水將菌液濃度稀釋至OD600=1.0，待涂布用。

1.2.4 抑菌試驗(yàn)

采用牛津杯法[2]。將制備好的指示菌菌懸液100 μL均勻涂布于LB平板,待平板表面自然干燥后,立即將滅菌牛津杯放置在平板上,取200 μL待測(cè)液加入牛津杯中，37℃培養(yǎng)18 h，每個(gè)樣品做3個(gè)平行，測(cè)量抑菌圈直徑（mm），拍照。

1.2.5 細(xì)胞免疫反應(yīng)實(shí)驗(yàn)

小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7用DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，并添加體積分?jǐn)?shù)為10%熱滅活（56℃，30 min）胎牛血清、青霉素（100 U/mL）、鏈霉素（100 μg/mL），于CO2培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)[3]。采用0.25%胰酶消化細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，將200 μL細(xì)胞懸液接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1.0×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)12 h后更換新鮮培養(yǎng)液，同時(shí)加入終質(zhì)量濃度1 mg/L LPS（E.coli，sigma-Aldrich）和不同終濃度（5×106，5×107，5×108mL-1）的羅伊氏乳桿菌菌液，24 h后取細(xì)胞培養(yǎng)上清液離心，去除殘余細(xì)胞，采用ELISA試劑盒（eBioscience,USA）測(cè)定細(xì)胞上清液中白細(xì)胞介素-6（IL-6）濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 無(wú)菌上清液的抑菌作用

已經(jīng)報(bào)道羅伊氏乳桿菌具有廣譜的抑菌性能[4]，羅伊氏乳桿菌拮抗病原菌的機(jī)制之一是能厭氧代謝甘油產(chǎn)非蛋白類(lèi)的廣譜抗菌物質(zhì)——羅伊氏菌素（Reuterin）[5]，Reuterin化學(xué)本質(zhì)是在甘油脫水酶和輔酶維生素B12的作用下[6]，甘油脫水代謝的產(chǎn)物3-羥基丙醛（3-HPA）的單體、3-羥基丙醛的水合物和3-羥基丙醛的環(huán)化二聚體的混合體系[7-8]。

本研究著重考察了在無(wú)添加甘油、用MRS培養(yǎng)的條件下和在甘油中發(fā)酵的條件下，羅伊氏乳桿菌ATCC53608對(duì)大腸桿菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、阪崎克羅諾桿菌4種指示菌的抑制性能以及其抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生和作用特性。

乳酸桿菌用MRS培養(yǎng)的無(wú)菌上清液對(duì)4種指示菌的抑菌作用如圖1所示。

圖1 4種乳酸桿菌MRS培養(yǎng)的無(wú)菌上清原液對(duì)指示菌的抑菌作用

由圖1可以看出，對(duì)羅伊氏乳桿菌MRS培養(yǎng)的無(wú)菌上清液最敏感的指示菌是大腸桿菌，最不敏感的是金黃色葡萄球菌。與其它乳酸菌比較，羅伊氏乳桿菌MRS培養(yǎng)的無(wú)菌上清原液對(duì)4種指示菌的抑制效果，相似于嗜酸乳桿菌234及嗜酸乳桿菌237，但次于植物乳桿菌233。

2.2 pH值對(duì)上清液抑菌作用的影響

本研究中測(cè)得的4種乳酸菌的上清原液的pH值分別是：植物乳桿菌233為2.5，嗜酸乳桿菌234為3，嗜酸乳桿菌237為3.5，羅伊氏乳桿菌為3.5，將上清原液的pH值調(diào)至7.0后，4種乳酸菌在4種指示菌的平板上均沒(méi)有了抑菌現(xiàn)象，圖2顯示了上清原液的pH調(diào)至中性后對(duì)金黃色葡萄球菌的作用結(jié)果。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明在MRS培養(yǎng)的乳酸桿菌上清液中，酸是主要的抑菌成分。

圖2中，（a）為上清原液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈；（b）為pH值調(diào)至7.0的上清原液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈；233為植物乳桿菌；234為嗜酸乳桿菌；237為嗜酸乳桿菌；LR為羅伊氏乳桿菌ATCC53608。

圖2 pH值對(duì)4種乳酸桿菌MRS培養(yǎng)的上清液抑菌作用的影響

2.3 加熱處理對(duì)上清液抑菌作用的影響

對(duì)部分羅伊氏乳桿菌MRS培養(yǎng)的上清原液進(jìn)行了加熱煮沸處理，比較加熱處理前后上清原液對(duì)致病菌的抑菌作用。

表1 羅伊氏乳桿菌MRS培養(yǎng)上清加熱煮沸處理前后的抑菌圈直徑 mm

由表1可以看出，加熱后抑菌圈的直徑下降并不明顯，說(shuō)明羅伊氏乳桿菌MRS培養(yǎng)的上清液中的抑菌組分有較好的熱穩(wěn)定性，排除大分子蛋白質(zhì)作為抑菌物質(zhì)的可能。

2.4 羅伊氏乳桿菌在甘油中發(fā)酵的上清液的抑菌作用

羅伊氏乳桿菌的益生功能與代謝甘油產(chǎn)羅伊氏菌素密切有關(guān)，基于羅伊氏菌素合成代謝的途徑，采用兩次發(fā)酵處理法考察了羅伊氏乳桿菌ATCC53608產(chǎn)生羅伊氏菌素及其抑菌的性能。首先用MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)菌體，離心并過(guò)濾獲得一次發(fā)酵上清液，菌體洗滌后添加甘油靜置培養(yǎng)2～6 h，離心并過(guò)濾獲得二次發(fā)酵上清液，分別考察了二次發(fā)酵2 h和6 h后的抑菌性能，同時(shí)也考察了對(duì)甘油二次發(fā)酵的上清液進(jìn)行加熱煮沸處理后的抑菌性能變化，結(jié)果如圖3所示。

圖3 羅伊氏乳桿菌在甘油中發(fā)酵的上清液的抑菌作用

由圖3可以得出，羅伊氏乳桿菌添加甘油二次發(fā)酵的上清液，無(wú)論是原液還是加熱煮沸處理液，對(duì)4種指示菌的的抑菌性能較一次發(fā)酵上清液都有明顯提高，特別對(duì)革蘭氏陽(yáng)性指示菌金黃色葡萄球菌，二次發(fā)酵2 h的上清原液抑菌圈直徑提高40 mm。比較加熱處理前、后的抑菌性變化，可見(jiàn)添加甘油二次發(fā)酵液經(jīng)過(guò)加熱煮沸處理后，對(duì)4種指示菌抑菌圈直徑比二次發(fā)酵原液都有明顯增加。其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究，推測(cè)可能與羅伊氏菌素是一個(gè)以3-羥基丙醛單體為轉(zhuǎn)換中心的復(fù)雜的動(dòng)態(tài)混合體系、其成分包括3-羥基丙醛、3-羥基丙醛水合物及3-羥基丙醛的二聚體有關(guān)，經(jīng)過(guò)加熱處理，其本身的混合體系成分或比例發(fā)生了改變，導(dǎo)致其抑菌性增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示了二次發(fā)酵2 h的上清液抑菌能力好于6 h的發(fā)酵上清液，即甘油發(fā)酵液隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，其抑菌性能下降，推測(cè)可能也是與混合體系成分發(fā)生了改變有關(guān)。

2.5 羅伊氏乳桿菌對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)的影響

乳酸菌對(duì)非特異性免疫的調(diào)節(jié)主要是通過(guò)影響單核巨噬細(xì)胞的免疫功能而實(shí)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)外的研究表明，乳酸菌可抑制細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子[9-10]。革蘭氏陰性細(xì)菌外膜成分脂多糖（LPS）又稱(chēng)內(nèi)毒素，是非特異性免疫刺激劑，其類(lèi)脂A（lipid A）結(jié)構(gòu)能被免疫細(xì)胞（單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞）表面的病原體識(shí)別受體TLR4（Toll-like receptor 4）識(shí)別，激活胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，引發(fā)TNF-α，IL-1，IL-6等炎性細(xì)胞因子的釋放，過(guò)量的細(xì)胞因子會(huì)導(dǎo)致毒性效應(yīng)[11-12]。

本研究以LPS（1 μg/mL）作為免疫誘導(dǎo)劑，以巨噬細(xì)胞RAW264.7為細(xì)胞模型，考察了羅伊氏乳桿菌的免疫調(diào)節(jié)作用。在LPS刺激巨噬細(xì)胞RAW264.7的免疫反應(yīng)體系中同時(shí)加入羅伊氏乳桿菌菌液，誘導(dǎo)24 h后檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6質(zhì)量濃度，結(jié)果如圖4所示。

圖4 羅伊氏乳桿菌對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞合成IL-6的影響

圖4中，A為質(zhì)量濃度1 μg/mL的LPS誘導(dǎo)；B為質(zhì)量濃度1 μg/mL的LPS誘導(dǎo)，羅伊氏乳桿菌初始菌濃為106mL-1；C為質(zhì)量濃度1 μg/mL 的LPS誘導(dǎo)，羅伊氏乳桿菌初始菌濃為107mL-1；D為質(zhì)量濃度1 μg/mL的LPS誘導(dǎo)，羅伊氏乳桿菌初始菌濃為108mL-1。

由圖4可以看出，與對(duì)照組相比，與羅伊氏乳桿菌ATCC53608共孵育時(shí)，RAW264.7細(xì)胞的IL-6合成量明顯下降（IL-6量最低降為8 pg/mL），且隨著共培養(yǎng)體系中羅伊氏乳桿菌ATCC53608數(shù)量增多IL-6合成量下降越明顯，可見(jiàn)羅伊氏乳桿菌ATCC53608對(duì)LPS刺激的免疫反應(yīng)有較強(qiáng)的調(diào)節(jié)能力。

3 結(jié)論

利用甘油發(fā)酵是羅伊氏乳桿菌在體外呈現(xiàn)較強(qiáng)抑菌性能的重要條件，單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、阪崎克羅諾桿菌、大腸桿菌4種指示菌中，金黃色葡萄球菌對(duì)其抑菌成分最敏感，加熱處理甘油發(fā)酵上清液能夠增強(qiáng)抑菌效果，羅伊氏乳桿菌對(duì)LPS刺激的免疫反應(yīng)具有調(diào)節(jié)作用。由于羅伊氏菌素抑菌作用機(jī)制以及乳酸菌抑制炎性細(xì)胞因子的分子機(jī)理目前還沒(méi)有被闡明，所以本研究發(fā)現(xiàn)的一些實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象有待于今后深入探析。

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