李敏武莉劉臻曹定睿

舒芬太尼后處理對大鼠肝缺血再灌注腎損傷的影響

李敏①武莉①劉臻①曹定睿②

目的：研究舒芬太尼后處理對大鼠肝缺血再灌注腎損傷的影響。方法：將Wista大鼠54只隨機(jī)分為三組（n=18）：假手術(shù)組（S組），肝缺血再灌注組（I/R組），舒芬太尼后處理組（SP組）。分別于肝缺血1 h、再灌注2、4、6 h心臟穿刺采血2 mL，測定血清中胱抑素C（CysC）的含量，同時取大鼠腎組織后處死大鼠，觀察大鼠腎組織的病理學(xué)變化，用免疫組化法檢測Bcl-2及Bax蛋白的表達(dá)、Tunel法觀察腎細(xì)胞的凋亡指數(shù)（AI）。結(jié)果：I/R組和SP組與S組相比，CysC、Bax與Bcl-2蛋白的表達(dá)及AI升高。SP組與I/R組相比，CysC、AI、Bax表達(dá)下降，Bcl-2的表達(dá)升高。結(jié)論：舒芬太尼后處理對肝缺血再灌注所造成的腎損傷的保護(hù)作用可能與Bcl-2的表達(dá)上調(diào)和Bax的表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

肝缺血再灌注； 腎損傷； 舒芬太尼

近年來外傷導(dǎo)致的肝破裂成為較常見的急診手術(shù)，肝切除、肝移植等手術(shù)趨于增多，肝缺血再灌注損傷及遠(yuǎn)隔臟器的損傷逐漸引起大家的關(guān)注。遠(yuǎn)隔器官中腎臟的影響尤為重要，術(shù)后患者常見并發(fā)癥之一是腎功能不全，甚至可引起腎衰[1-2]。舒芬太尼預(yù)處理對肝缺血再灌注引起的損傷的保護(hù)作用以及肝缺血再灌注引起的腎損傷已經(jīng)在動物實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)[3-4]，但舒芬太尼后處理對肝缺血再灌注后腎臟的影響還未見報道，本研究旨在探討舒芬太尼后處理對大鼠肝缺血再灌注腎損傷的影響及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 200～220 g的健康雄性Wistar大鼠54只，由山西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供；舒芬太尼由宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司提供；TUNEL試劑由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供；Bcl-2、Bax抗體由武漢博士德生物工程有限公司提供，圖像分析系統(tǒng)由aperio公司提供。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 將健康雄性Wistar大鼠54只隨機(jī)分為三組：假手術(shù)組（S組），肝缺血再灌注組（I/R組），舒芬太尼后處理組（SP組），每組18只。S組：行假手術(shù)，只開腹及暴露左、中肝葉及肝蒂，但不阻斷肝葉血流，1 h后關(guān)腹，于關(guān)腹前5 min給予0.9%生理鹽水1 mL，以關(guān)腹時間點(diǎn)為起始點(diǎn)，分別于2、

4、6 ｈ后采血和取腎組織標(biāo)本。I/R組：阻斷血流1 h后取下血管夾關(guān)腹，余同S組。SP組：于開放血管夾前5 min給予舒芬太尼1 mL（2 μg/kg稀釋到1 mL），余同S組。

1.2.2 肝缺血再灌注模型的建立 70%的肝缺血再灌注（I/R）模型的制備：實(shí)驗(yàn)動物禁食12 h，自由飲水，20%烏拉坦按l mg/kg經(jīng)腹腔注射麻醉，后將動物仰臥固定于操作臺上，消毒鋪巾后于上腹正中做切口，逐層切開各層組織，露出肝臟組織，依次解剖至第一肝門部、左、中葉之肝蒂，用無損傷血管夾夾閉供應(yīng)肝左、中葉的門靜脈和肝動脈，但不阻斷肝右葉的血流，造成約70%的肝臟缺血，以防發(fā)生門靜脈胃腸道淤血，阻斷血流后肝葉呈暗紅色改變，阻斷血流60 min后取下血管夾，恢復(fù)肝葉血供，此時肝葉轉(zhuǎn)變?yōu)轷r紅色，開放血管夾前5 min經(jīng)大鼠尾靜脈給予S組、I/R組0.9%生理鹽水1 mL，SP組給予舒芬太尼1 mL（2 μg/kg稀釋到1 mL）。在手術(shù)過程中，在動物腹腔內(nèi)滴加溫?zé)嵘睇}水（37 ℃）1 mL以維持體內(nèi)環(huán)境平衡，恢復(fù)灌注后將傷口縫合并用紗布覆蓋[5]。

1.2.3 取材 每組分別于再灌注2、4、6 h取腎組織放置于10%中性甲醛溶液中固定，同時從心臟采血2 mL。

1.3 監(jiān)測指標(biāo)

1.3.1 胱抑素C（CysC）含量的測定 心臟穿刺采血2 mL，以3000 r /min，4 ℃，離心10 min，取適量上清液，測定血清中CysC的含量。

1.3.2 腎組織的病理形態(tài)學(xué)觀察 將甲醛中固定的腎組織常規(guī)石蠟包埋、切片、HE（蘇木素一伊紅，hematoxylin and eosin）染色，光鏡下觀察。

1.3.3 Bcl-2、Bax蛋白的測定 按照購買的試劑的說明書進(jìn)行染色，用圖像分析系統(tǒng)對切片進(jìn)行分析計(jì)算吸光度值（A）。

1.3.4 Tunel法測定腎細(xì)胞的凋亡指數(shù)（AI） 脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）每張TUNEL陽性切片隨機(jī)選取5個陽性細(xì)胞數(shù)（細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者）最多的高倍視野（×400），計(jì)算500個細(xì)胞中陽性細(xì)胞所占的百分比即為AI。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以（±s）表示，不同組間比較采用單因素方差分析，若結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則繼續(xù)采用SNK檢驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步比較，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色腎組織的病理形態(tài)學(xué)觀察 S組腎組織結(jié)構(gòu)正常，I/R組腎小管上皮細(xì)胞變性壞死，腎間質(zhì)充血水腫炎細(xì)胞浸潤，腎小管管腔狹窄，SP組病變介于兩組之間。

2.2 各組大鼠腎組織Bcl2、Bax蛋白的表達(dá)、Bcl2/ Bax、AI及血漿CysC的變化 與假手術(shù)組比較，再灌注組和SP組腎組織Bcl-2蛋白A值、Bax蛋白A值、Bcl-2/Bax比值、AI值、CysC含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與再灌注組比較，SP組腎組織Bcl-2蛋白A值、Bax蛋白A值、Bcl-2/Bax比值、AI值、CysC含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。且在同一再灌注時間時：假手術(shù)組、I/R組、SP組的Bcl-2蛋白A值依次升高，并以SP組再灌注6 h時最高，假手術(shù)組、SP組、I/R組的Bax蛋白A值、AI值、CysC含量依次升高，并以I/R組再灌注6 h時最高，I/R組、假手術(shù)組、SP組的Bcl-2/Bax比值依次升高，并以SP組再灌注6 h時最高，見表1。

表1 三組不同時相腎組織Bcl-2蛋白、Bax蛋白及其比值、AI及CysC的比較（±s）

表1 三組不同時相腎組織Bcl-2蛋白、Bax蛋白及其比值、AI及CysC的比較（±s）

*與假手術(shù)組同時間點(diǎn)比較，P＜0.05；△與I/R組同時間點(diǎn)比較，P＜0.05

組別Bcl-2BaxBcl-2/BaxCysC（mg/L）AI（%）假手術(shù)組（n=18）2 h0.2120±0.00770.2110±0.01961.0100±0.08000.17±0.081.67±0.22 4 h0.2177±0.02330.2168±0.01641.0050±0.08310.18±0.101.72±0.15 6 h0.2193±0.00800.2322±0.00900.9467±0.04890.23±0.051.77±0.16 I/R組（n=18）2 h 0.2638±0.0072*0.3245±0.0056*0.8133±0.0280*0.70±0.09*23.32±1.43*4 h 0.2717±0.0210*0.3468±0.0040*0.7833±0.0596*0.72±0.12*29.22±0.63*6 h 0.2867±0.0074*0.3908±0.0060*0.7333±0.0175*0.73±0.12*36.32±1.55*SP組（n=18）2 h 0.2685±0.0024*△0.2398±0.0101*△1.1217±0.0467*△0.52±0.15*△16.67±1.02*△4 h 0.2802±0.0029*△0.2418±0.0048*△1.1583±0.0293*△0.53±0.16*△24.95±0.72*△6 h 0.2975±0.0047*△0.2473±0.0045*△1.2033±0.0301*△0.55±0.14*△31.10±1.09*△

3 討論

缺血再灌注引起的損傷其主要改變是細(xì)胞凋亡。凋亡是活體內(nèi)個別細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡的表現(xiàn)形式，是由體內(nèi)外因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而導(dǎo)致的細(xì)胞主動性死亡方式。細(xì)胞凋亡受多種基因和蛋白的調(diào)控，而Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡的過程中發(fā)揮著至關(guān)

重要的作用，Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡而Bax促進(jìn)細(xì)胞凋亡[6-8]。Bax與Bcl-2兩者的比例是決定細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵，Bax與Bcl-2形成異二聚體抑制細(xì)胞凋亡而Bax與Bax形成同二聚體促進(jìn)細(xì)胞凋亡，有人提出Bcl-2/ Bax比率是調(diào)控細(xì)胞死亡的“可變電阻器”（rheostat）或啟動細(xì)胞凋亡的“分子開關(guān)”[9]。

腎是體內(nèi)清除CysC的唯一器官，CysC的分子量是13 000，CysC經(jīng)腎小球自由濾過但其在近曲小管被重吸收且無腎小管的分泌，CysC在有核細(xì)胞中以恒定的速率產(chǎn)生并被釋放到血液中，并且不受年齡、體重、性別等因素的干擾。因此，CysC是理想的評估GFR的標(biāo)志物，其靈敏性和特異性都非常高。輕微的腎小球損傷血中CysC的含量即可升高且隨損傷的加重而逐漸升高，CysC被公認(rèn)為評價腎功能損傷的早期指標(biāo)之一，對其早期診斷和治療都有重要價值[10-11]。

舒芬太尼（Sufentanil）是臨床上常用的阿片類鎮(zhèn)痛藥，是一類強(qiáng)效的高選擇性激動μ受體的阿片類鎮(zhèn)痛藥，其鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)，脂溶性強(qiáng)，起效迅速，分布容積小，術(shù)后很少出現(xiàn)蓄積現(xiàn)象，術(shù)后不良反應(yīng)發(fā)生率低，其毒性小安全范圍大且使用后血流動力學(xué)較穩(wěn)定[12-15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與S組相比，I/R組與SP組CysC、Bax與Bcl-2蛋白的表達(dá)及AI升高。與I/R組相比，SP組CysC、AI、Bax表達(dá)下降，Bcl-2的表達(dá)升高，說明肝缺血再灌注可引起腎損傷，且舒芬太尼對肝缺血再灌注引起的腎損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制Bax的表達(dá)及提高Bcl-2的表達(dá)有關(guān)，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

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Effects of Sufentanil Post-conditioning on Renal Injury Induced by Hepatic Ischemia-reperfusion in Rats/

LI Min，WU Li，LIU Zhen，et al.//Medical Innovation of China，2015，12（08）：013-015

Objective：To investigate the effects of Sufentanil post-conditioning on renal injury induced by hepatic ischemia-reperfusion in rats.Method：Fifty-four Wista rats were randomly allocated into three groups（n=18）：Sham operation group（S group），hepatic ischemia-reperfusion group（I/R group） and Sufentanil post-conditioning group（SP group）.The rats were killed at the same time to obtain the renal tissue and take blood from the heart after hepatic ischemia 1 hour reperfusion for 2，4 and 6 hours，then tested cystatinC（CysC），observed the pathological changes in renal tissue，detected the expression of Bcl-2 and Bax proteins in kindy by immunohistochemistry and the apoptosis index（AI）of the renal cells was observed by Tunel method.Result：Compared with the S group，CysC，AI and the expression of Bcl-2 and Bax proteins incresed in I/R group and SP group.Compared with the I/R group，CysC，AI and the expression of Bax protein decresed but the expression of Bcl-2 protein incresed in SP group.Conclusion：The protective effects of Sufentanil post-conditioning on renal injury induced by hepatic ischemia-reperfusion in rats may be related to the decresed expression of Bax protein and the incresed expression of Bcl-2 protein.

Hepatic ischemia-reperfusion； Renal injury； Sufentanil

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.08.005

2014-11-17） （本文編輯：陳丹云）

①山西醫(yī)科大學(xué) 山西 太原 030001

②山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院

曹定睿

First-author’s address：Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China