劉 茜 余榮嬌 張 凱 洪 燕 劉向國

（安徽中醫(yī)藥大學(xué) 組胚生物學(xué)教研室，合肥230008）

精原干細(xì)胞（spermatogonial stem cells，SSCs）是生長于生精小管上皮近基底膜區(qū)域的雄性生殖干細(xì)胞，是精子發(fā)生的起始細(xì)胞，它既能自我增殖，又能分化成為精母細(xì)胞，從而維持體內(nèi)精子數(shù)量的恒定，對維持機(jī)體的繁殖能力起重要作用。SSCs是雄性動物中唯一能將遺傳信息傳遞給后代的干細(xì)胞，具有很強(qiáng)的可塑性，但人們對其中許多發(fā)育和調(diào)控機(jī)制并不太了解。文獻(xiàn)報道干細(xì)胞因子 （stem cell factor，SCF）［1］和維生素 A（VA）［2］對小鼠精原干細(xì)胞體外增殖發(fā)揮一定的作用，但兩種因素之間有無交互作用尚無相關(guān)研究報道，筆者采用析因設(shè)計，對兩者之間作用進(jìn)行了研究，報道如下：

1 材料和方法

1．1 材料1．1．1 酶和試劑 DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、非必需氨基酸、B-巰基乙醇、丙酮酸鈉購自GIBCO BRL公司，膠原酶IV、胰蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、全反式維甲酸（all transretinoic acid，RA）、噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）購自SIGMA公司，Percoll為Pharmacia公司產(chǎn)品，L（＋）谷氨酰胺購自中國醫(yī)藥公司；C-KIT受體試劑盒，SCF（stem cell factor）購自Invitrogen公司。

1．1．2 實驗動物 7～8日齡的雄性昆明小白鼠，安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

1．2 方法

1．2．1 分離純化小鼠精原干細(xì)胞 采用一步酶消化法［3］，將離散的生精小管小段用含1%雙抗的PBS漂洗2遍后移入離心管中，加入中性蛋白酶H，37℃消化20～30min，期間不時震蕩離心管或用移液槍反復(fù)吹吸；待消化液中出現(xiàn)白色絮狀漂浮物時收集消化液800r／min離心3min，去上清液后用DMEM洗滌1次，用mSSCs培養(yǎng)液重懸；將懸液用200目尼龍篩過濾，收集濾液，將其接種至含小鼠成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的培養(yǎng)皿中。

1．2．2 精原干細(xì)胞培養(yǎng) 將細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，按照RA濃度（1g／L、2g／L和4g／L）和SCF濃度（20ng／ml、30ng／ml和40ng／ml）全面組合，實驗共分9組，每組設(shè)3個重復(fù)，置于34℃、5%CO2、100%濕度條件下培養(yǎng)。待24h細(xì)胞貼壁后，除對照組外，各組分別加入事先配置好的不同生長因子和維甲酸的培養(yǎng)液。每隔8～12h觀察細(xì)胞的存活及分裂增殖情況。在加入生長因子72h后對各組進(jìn)行MTT檢測。

1．2．3 MTT檢測 0．25%胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，以103～104個每孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中；37℃、5%CO2及100%濕度條件下培養(yǎng)3～5d后，每孔加入MTT溶液（5mg／ml）20uL，37℃孵育4h，終止培養(yǎng)，棄上清。每孔加入150μl DMSO，振蕩10min。選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔的光吸收值，記錄結(jié)果。

1．2．4 增殖的細(xì)胞作組織學(xué)染色行C-KIT受體鑒定。

1．3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 21．0進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料采用（±s）表示，采用析因設(shè)計方差分析，檢驗水準(zhǔn)取α＝0．05。

2 結(jié)果

2．1 培養(yǎng)24h后和72h后C-KIT受體檢測結(jié)果

HE染色見增殖的精原干細(xì)胞為圓形，細(xì)胞大小均勻，胞體較小、核大而圓著色深，胞質(zhì)淺染、核／質(zhì)比高；而背景的基質(zhì)細(xì)胞呈梭形，胞質(zhì)著色相對較淺，見圖1；C-KIT受體顯示培養(yǎng)72h后的精原干細(xì)胞膜染成深黃褐色，胞質(zhì)和細(xì)胞核不作色，背景基質(zhì)細(xì)胞為陰性，見圖2。

2．2 析因設(shè)計結(jié)果

2．2．1 SCF與RA主效應(yīng)各水平組比較 固定RA因素影響，SCF各組OD值結(jié)果見表1；固定SCF影響，RA各組OD值結(jié)果見表2，圖形展示見圖3。

表1 SCF不同水平組OD值比較

表2 RA不同水平組OD值比較

2．3．2 兩因素分析結(jié)果 SCF與RA各三水平全面組合，共9組，每組設(shè)置重復(fù)次數(shù)為3次，培養(yǎng)72h后，檢測各培養(yǎng)樣品的吸光度（OD）值，獲得結(jié)果見表3。采用析因設(shè)計的方差分析進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)檢驗，方差齊性檢驗，F(xiàn)＝1．801，P＝0．143＞0．05，符合方差齊性。析因設(shè)計方差分析，SCF檢驗對應(yīng)F＝80．508，P＜0．01，RA檢驗結(jié)果F＝22．355，P＜0．01，SCF＊RA 交互作用檢驗F＝3．865，P＝0．019＜0．05，具體結(jié)果見表4。

圖3 SCF（a）與RA（b）主效應(yīng)OD值比較

圖4 SCF與RA交互作用圖

表3 SCF與RA9種組合3次重復(fù)吸光度值（±s，n＝3）

表3 SCF與RA9種組合3次重復(fù)吸光度值（±s，n＝3）

RA（g／L）1 2 4 SCF（ng／ml） 20 0．49±0．05 0．63±0．06 0．57±0．02 30 0．65±0．04 0．72±0．06 0．81±0．05 40 0．75±0．08 0．96±0．02 0．85±0．04

表4 SCF與RA析因設(shè)計ANOVA分析結(jié)果

3 討論

精子發(fā)生是一個以精原干細(xì)胞（SSCs）為基礎(chǔ)的復(fù)雜而高度有序的過程。精原干細(xì)胞具有永生化和多能化潛能，是精子形成的前體細(xì)胞，其自我更新和起始分化之間的平衡則是維持個體正常生育能力的關(guān)鍵。精原干細(xì)胞在睪丸等微環(huán)境中具有增殖與分化的能力，其終生擴(kuò)增能力為雄性精子細(xì)胞源源不斷產(chǎn)生所必需，對其增殖調(diào)控機(jī)制的研究成為研究男性不育途徑之一。

眾多文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)SSCs中，添加GDNF和 SCF［1］、維生素 A［2］、黃芪注射液［4］、枸杞多糖［5-6］、GDNF和 LIF［7］等，均可以促進(jìn)精原干細(xì)胞的增殖。然而上述研究均在單因素研究的基礎(chǔ)之上，沒有考慮因素之間的交互作用。本研究選擇SCF和VA為研究因素，兩因素各設(shè)置3個水平，全面組合分成9組，采用析因設(shè)計方法分析兩種因素之間是否存在交互影響。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)固定RA因素，SCF低、中、高三組吸光度值分別為0．563±0．023，0．724±0．016和0．852±0．021，三組之間比較，相互間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）；當(dāng)固定SCF因素，RA低、中和高三組吸光度值分別為0．626±0．026，0．770±0．019和0．743±0．023，中、高劑量組吸光度值高于低劑量組（P＜0．01），中高劑量組間無差異（P＞0．05）。結(jié)果再次證實SCF和RA均具有精原干細(xì)胞的體外增值作用。析因設(shè)計方差分析發(fā)現(xiàn)，SCF與RA之間交互作用分析，F(xiàn)＝3．865，P＝0．019＜0．05，顯示兩種因素之間存在交互影響作用，兩者濃度之間最佳組合為SCF高劑量與RA中劑量組。

SCF是一種作用廣泛的多肽生長因子細(xì)胞因子，為c-kit受體的配體［8］。SCF促進(jìn)小鼠SSCs分裂增殖的機(jī)制，可能是由于SCF彌補(bǔ)了體外環(huán)境中SCF的不足，SCF與小鼠SSCs膜上的c-k it酪氨酸激酶受體發(fā)生特異性結(jié)合，誘導(dǎo)該受體自動磷酸化，從而有利于其干細(xì)胞狀態(tài)的維持和自增殖能力的調(diào)節(jié)。KIT配體是由支持細(xì)胞分泌的，KIT受體則存在于A型精原干細(xì)胞上，在B型及初級精母細(xì)胞為低水平表達(dá)，在精子細(xì)胞中不表達(dá)，因此C-KIT受體可作為A型精原干細(xì)胞的標(biāo)志物，但該受體并不是精原干細(xì)胞特有的標(biāo)志物，在其它干細(xì)胞中也有表達(dá)，故也常作為干細(xì)胞的一個常見的輔助檢測指標(biāo)。本研究在飼養(yǎng)層上增殖呈鏈狀、團(tuán)狀的細(xì)胞的胞膜染色為陽性，胞質(zhì)和胞核為陰性，這不僅提示C-KIT受體可作為檢測精原干細(xì)胞的一個重要指標(biāo)，同時也提示該受體在精原干細(xì)胞上是一種膜受體，該受體在體外培養(yǎng)過程中可能與外源性的配體SCF結(jié)合發(fā)揮調(diào)節(jié)作用［9］。維生素A參與胚胎的正常發(fā)育，并維持機(jī)體多種生理活動。目前關(guān)于維生素A對人類雄性生殖系統(tǒng)影響的研究尚比較匾乏，通過對嚙齒動物維生素A缺乏或過多癥的研究，表明維生素A對雄性生殖系統(tǒng)的發(fā)育和正常維持是必需的［10］。

精原干細(xì)胞體外增值影響因素較多，其機(jī)制也異常復(fù)雜，研究因素往往不是單一作用于受試對象，各因素之間或多或少都會相互影響，傳統(tǒng)的單一因素設(shè)計的實驗只能解決單一因素的作用，當(dāng)其他因素發(fā)生變化時，其作用大小甚至方向均可能發(fā)生變化。本次研究采用3×3析因設(shè)計，研究了SCF與RA之間的交互作用，比以往的單一因素研究在實驗設(shè)計上更加科學(xué)，然而因為影響SSCs增殖的影響因素很多，要充分研究它們之間的影響，尋求最佳的干預(yù)因素的組合，有待采進(jìn)一步采用更為復(fù)雜的多因素實驗設(shè)計如正交設(shè)計與均勻設(shè)計進(jìn)行研究。

［1］ 畢聰明，王珅，周鐵忠，等．GDNF和SCF促進(jìn)小鼠精原干細(xì)胞增殖與分化的研究［J］．遼寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2009，03：193-195，289．

［2］ 胡建新，孫兆林，何堅，等．維生素A對體外培養(yǎng)小鼠精原干細(xì)胞生長增殖的影響［J］．中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，10：1791-1794．

［3］ 宋銳，曹鴻國，陶勇，等．一種簡便的小鼠精原干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法［J］．中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報，2010，02：285-290．

［4］ 余榮嬌，洪燕，劉茜，等．黃芪注射液對大鼠精原干細(xì)胞增殖作用的影響［J］．江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010，02：67-69．

［5］ 劉慧蓮．枸杞多糖對小鼠精原干細(xì)胞增殖作用的影響［J］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，03：1490-1492．

［6］ 馬良宏，邱志軍，閆圣男，等．枸杞多糖對精原干細(xì)胞體外增殖的影響［J］．中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，23：4277-4281．

［7］ 索麗娟，胡建宏，王鵬，等．GDNF和LIF對小鼠精原干細(xì)胞體外增殖的影響［J］．西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2012，04：1-7．

［8］ Copeland NC，Gibert DJ，Cho BC，et al．Mast cell growth factor maps near the steel locus on mouse chromosome 10and is deleted in a number of steel alleles［J］．Cell，1990；63：175-183．

［9］ 徐富翠，吳紹華，郭勇，等．小鼠精原干細(xì)胞生物學(xué)特征的研究［J］．瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2006，03：191-195．

［10］ Uvera G，Rouiler-Fabre V，Pairalllt C，et al．Regulation and perturbation of testicular functions by vitamin A［J］．Reporduction，2002，124：173-180．