于春，于基成，張春紅，劉秋，陳嬌

1(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)，110866)2(大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連，116600)

菊粉是由多個(gè)D-果糖分子通過(guò)β-2，1果糖糖苷鍵連接而成的多聚果糖，末端有1個(gè)葡萄糖殘基以α-2，1糖苷鍵與之相連，呈直鏈結(jié)構(gòu)，聚合度為2～60［1］。菊粉酶又稱果聚糖酶(β-2，1-D-果聚糖水解酶)，其催化水解菊粉中β-2，1呋喃果糖苷鍵，酶解產(chǎn)物為低聚果糖和果糖，在工業(yè)上有重要的應(yīng)用價(jià)值［2］。直接利用粗酶液來(lái)生產(chǎn)低聚果糖或果糖時(shí)，常常由于菊粉酶性質(zhì)不穩(wěn)定或酶活力較低而影響低聚果糖或果糖產(chǎn)率。此外，菊粉酶粗酶液在使用過(guò)程中還常存在易變質(zhì)和不易保存等問(wèn)題［3-6］。針對(duì)這些問(wèn)題，研究者通常采用酶的固定化來(lái)解決。但是在酶的固定化過(guò)程中，由于一些雜蛋白的存在而影響酶的活力和酶的固定化效果［7-8］。因此，研究菊粉酶的分離純化并獲得較高純度的菊粉酶，對(duì)進(jìn)一步了解其酶學(xué)性質(zhì)和研究其固定化方法具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)以從分離自鴨綠江濱海濕地環(huán)境中的1株產(chǎn)酶活性高、穩(wěn)定性好的灰平鏈霉菌S.griseoplanus S501為研究對(duì)象，采用固態(tài)發(fā)酵法制備菊粉酶粗酶液，結(jié)合不同的分離純化方法獲得純酶組分，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

菊粉(大連佐源集團(tuán)公司提供);灰平鏈霉菌S.griseoplanus S501(CGMCC No.8185)由大連民族大學(xué)功能微生物項(xiàng)目組保藏;所用試劑均為分析純。

1.2 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基

麩皮:833.33 g/L，營(yíng)養(yǎng)液:KNO30.83 g/L，NaCl 0.42 g/L，MgSO4·7H2O 0.42 g/L，K2HPO4·3H2O 0.42 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.009 g/L，去離子水1 L，pH值自然。

1.3 粗酶液的制備

菌株S501經(jīng)固態(tài)發(fā)酵后，按1∶5(g∶mL，以發(fā)酵基質(zhì)干重計(jì))加入去離子水，振蕩提取1 h，4℃ 8 000 r/min離心20 min，上清液即為粗酶液。

1.4 菊粉酶活力的測(cè)定

［9］方法測(cè)定。

1.5 菊粉酶的分離純化

1.5.1 硫酸銨分級(jí)沉淀

將粗酶液置于冰水浴中，在磁力攪拌下，緩緩加入硫酸銨至質(zhì)量濃度為200 g/L，4℃靜置3～5 h，8 000 r/min離心20 min，除雜蛋白。上清液再添加硫酸銨至濃度為900 g/L，4℃ 8 000 r/min離心20 min，沉淀用0.1 mol/L pH5.6的醋酸緩沖液溶解，4℃對(duì)去離子水透析，每12 h換透析液1次，共6次。透析后，冷凍干燥即為粗酶。

1.5.2 Sephadex G-75凝膠層析

將1.5.1中制得粗酶采用Sephadex G-75凝膠層析柱(2.0 cm×30.0 cm)分離。上樣量2.0 mL，洗脫液為0.02 mol/L pH5.6的醋酸緩沖液，流速0.2 mL/min，監(jiān)測(cè)波長(zhǎng)280 nm，每30 min收集1管洗脫液。測(cè)定各管收集液活性，將具有酶活性峰洗脫液收集備用。

1.5.3 DEAE-Sepharose CL-6B離子交換色譜

將1.5.2收集到的具有酶活性的收集液采用DEAE-Sepharose CL-6B離子交換色譜柱(2.0 cm×40.0 cm)分離。上樣量2.0 mL，采用0.0～0.5 mol/L NaCl和0.02 mol/L pH5.6的醋酸緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，監(jiān)測(cè)波長(zhǎng)280 nm，每管收集5.0 mL。同時(shí)測(cè)定其活力，收集具有酶活性峰洗脫液備用。

1.5.4 菊粉酶蛋白純度和分子量測(cè)定

采用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測(cè)定分離獲得酶的純度和分子量。分離膠和濃縮膠濃度分別為15%和5%。

1.6 菊粉酶酶學(xué)性質(zhì)研究

1.6.1 菊粉酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性

最適溫度測(cè)定:以20 g/L菊粉溶液為底物，定量加入酶液，分別在 20、30、40、50、60、70、80 ℃下反應(yīng)30 min后測(cè)定酶活。以最高酶活性組為100%，以相對(duì)酶活考察菊粉酶的最適溫度。

熱穩(wěn)定性測(cè)定:酶液在不同溫度下預(yù)保溫1 h后，迅速冷卻到室溫后，分別測(cè)定殘余酶的相對(duì)活力，以未經(jīng)保溫處理的酶液活性為100%。計(jì)算其相對(duì)酶活。

1.6.2 菊粉酶的最適pH值及酸堿穩(wěn)定性

最適pH值測(cè)定:分別以pH 3.8～5.8的0.2 mol/L的醋酸緩沖溶液配制2%的菊粉底物溶液，定量加入酶液，50℃下反應(yīng)30 min后測(cè)定酶活，計(jì)算相對(duì)酶活。

酸堿穩(wěn)定性測(cè)定:采用不同pH值緩沖溶液定量稀釋酶液，4℃放置過(guò)夜，測(cè)定其殘余酶的相對(duì)酶活。

1.6.3 底物濃度對(duì)菊粉酶活力的影響

用0.2 mol/L pH5.0的醋酸緩沖液分別配制濃度為20、40、60、80 和100 g/L 的菊粉溶液，定量加入酶液，50℃下反應(yīng)30 min后，測(cè)定酶活，計(jì)算相對(duì)酶活。

1.6.4 金屬離子對(duì)菊粉酶活力的影響

用0.2 mol/L pH5.0的醋酸緩沖液分別配制5.0 mmol/L 的 Ba2+、Cu2+、Zn2+、K+、I-、Mg2+、Al3+、Ca2+、Li+、Ag+、Fe2+、Fe3+溶液，以 40 g/L 的菊粉溶液為底物，定量加入酶液，50℃下反應(yīng)30 min后測(cè)定酶活，以未加金屬離子的底物溶液為空白，考察金屬離子對(duì)菊粉酶活力的影響。

1.6.5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)菊粉酶活力的影響

以4%的菊粉溶液為底物，定量加入酶液，50℃下分別反應(yīng) 5、10、15、20、25 和 30 min 后，測(cè)定其的酶活，以酶解產(chǎn)物還原糖含量對(duì)反應(yīng)時(shí)間作圖。

1.6.6 菊粉酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定

分別以不同濃度的菊粉溶液為底物，定量加入酶液，50 ℃下，分別反應(yīng) 5、10、15、20、25 和 30 min，計(jì)算底物濃度［s］和反應(yīng)速度［v］，以 1/v對(duì) 1/［s］作圖，求算以菊粉為底物時(shí)菊粉酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率vmax。

2 結(jié)果與討論

2.1 菊粉酶的分離純化

2.1.1 硫酸銨分級(jí)沉淀

由表1可以看出，粗酶液經(jīng)不同飽和度的硫酸銨沉淀后，其上清液相對(duì)酶活性差異顯著。隨著硫酸銨飽和度的增加，上清液相對(duì)酶活性逐漸減低，當(dāng)硫酸銨飽和度達(dá)到900 g/L時(shí)，上清液殘余酶活性為9.43%，說(shuō)明超過(guò)90%的酶通過(guò)沉淀被分離;而當(dāng)硫酸銨飽和度為200 g/L時(shí)，其上清液相對(duì)酶活性為92.35%，則表明大部分具有活性的菊粉酶仍留在上清液中。因此，菊粉酶粗提純時(shí)先采用飽和度為200 g/L硫酸銨進(jìn)行沉淀去除雜蛋白后，將上清液中硫酸銨飽和度調(diào)至900 g/L，沉淀后可得粗酶。

表1 不同濃度硫酸銨沉淀后上清液相對(duì)酶活(n=3)Table 1 The relative enzyme activity of supernatant after precipitated by different concentrations of ammonium sulfate(n=3)

2.1.2 Sephadex G-75凝膠層析

由洗脫曲線(圖1)可見(jiàn)，硫酸銨分級(jí)沉淀分離的粗酶經(jīng)Sephadex G-75葡聚糖凝膠層析分離后，共獲得5個(gè)組分。收集各個(gè)組分并測(cè)定其酶活性發(fā)現(xiàn)，其中1號(hào)和2號(hào)峰具有酶活性，活性分別為57.5 U/mg和254.9 U/mg，合并二者酶液作為下一步離子交換色譜法分離和電泳實(shí)驗(yàn)樣品。

圖1 菊粉酶的Sephadex G-75葡聚糖凝膠柱層析圖Fig.1 Gel filtration chromatography of inulinase on Sephadex G-75 column

2.1.3 粗酶液的DEAE-Sepharose CL-6B離子交換色譜分離

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，菊粉酶的等電點(diǎn)一般為4.0～5.0［10-18］，因此，選用陰離子交換柱對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的純化。由圖2可以看出，經(jīng)DEAE-Sepharose CL-6B離子交換色譜分離后，共獲得3個(gè)組分。雖然組分2和組分3并沒(méi)有完全分離，但經(jīng)活性測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，這2個(gè)組分峰收集液無(wú)酶活性。而組分1則具有較強(qiáng)的外切菊粉酶活性，活性達(dá)到483 U/mg，因此，收集組分1峰濃縮備用。

圖2 菊粉酶的DEAE-Sepharose CL-6B離子交換色譜層析圖Fig.2 Ion exchange chromatography of inulinase on DEAE-Sepharose CL-6B

2.1.4 不同純化方法獲得酶組分的酶活和比酶活測(cè)定

菌株S501產(chǎn)外切菊粉酶的分離純化結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，發(fā)酵液經(jīng)過(guò)硫酸銨沉淀、Sephadex G-75凝膠柱、DEAE-Sepharose CL-6B離子柱分離純化后，比酶活和純化倍數(shù)逐漸增加。3種方法獲得酶組分活性和純化倍數(shù)分別為27.48、46.11、249.5 U/mg和 1.15、1.93、10.42。

表2 菌株S501產(chǎn)外切菊粉酶的分離純化結(jié)果(n=3)Table 2 Summary of inulinase purification(n=3)

2.1.5 菊粉酶純度和分子量測(cè)定

采用SDS-PAGE分別測(cè)定了粗酶液和硫酸銨分級(jí)沉淀法、Sephadex G-75凝膠層析法、DEAE-Sepharose CL-6B離子交換色譜法分離后的粗酶純度和分子量。由圖3可見(jiàn)，未經(jīng)處理粗酶液約有10個(gè)條帶，經(jīng)Sephadex G-75分離獲得5條組分帶，而經(jīng)DEAESepharose CL-6B離子交換色譜柱分離后的酶液僅有1條條帶，說(shuō)明采用DEAE-Sepharose CL-6B柱分離后已獲得純度較高的外切菊粉酶。經(jīng)計(jì)算其分子質(zhì)量約為23.442 kDa。與文獻(xiàn)報(bào)道比較，該酶的分子質(zhì)量較小，這可能與不同菌株所產(chǎn)的菊粉酶在分子結(jié)構(gòu)和組成方面存在差異有關(guān);另一方面，SDS-PAGE技術(shù)只能粗略估算蛋白分子量。

圖3 菊粉酶的SDS-PAGE電泳圖Fig.3 Electrophoretogram of SDS-PAGE of inulinase

2.2 菊粉酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 菊粉酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性

溫度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響非常復(fù)雜。溫度既影響到酶蛋白的構(gòu)象，參與酶促反應(yīng)功能團(tuán)的解離狀態(tài)，也影響酶與底物的親和力，酶-底物絡(luò)合物的分解;甚至還影響酶與激活劑、抑制劑的親和力等［19］。

由圖4可以看出，隨著反應(yīng)溫度的增加，菊粉酶的活性先增加后減小，在50℃時(shí)達(dá)到最高(464.0 U/mg)，說(shuō)明該菊粉酶的最適溫度為50℃。這一結(jié)果與張國(guó)青等人［20-24］報(bào)道結(jié)果相符合。而圖5結(jié)果進(jìn)一步證明，將菊粉酶在不同溫度下預(yù)保溫1 h，迅速冷卻至室溫，于50℃下反應(yīng)30 min后測(cè)定其酶活，其酶活力在50℃時(shí)達(dá)到最高。

圖4 溫度對(duì)菊粉酶活力的影響Fig.4 Effects of different temperature on inulinase activity

圖5 菊粉酶的熱穩(wěn)定性Fig.5 Effects of different temperature on inulinase stability

2.2.2 菊粉酶的最適pH值及酸堿熱穩(wěn)定性

最適pH是酶的一個(gè)很重要的特征，對(duì)酶的催化反應(yīng)速率影響很大，主要表現(xiàn)為:(1)通過(guò)影響酶的空間結(jié)構(gòu)來(lái)影響酶的穩(wěn)定性;(2)通過(guò)影響酶活性中心的催化基團(tuán)的解離來(lái)影響酶與底物的結(jié)合;(3)通過(guò)影響底物的解離來(lái)影響其與酶的結(jié)合。酶的最適pH與酶的種類、底物濃度及種類、緩沖液種類等條件有關(guān)，它并不是一個(gè)常數(shù)，會(huì)隨著反應(yīng)條件的變化而變化。因此，酶的最適pH只是在某一特定條件下的一個(gè)確定的數(shù)值。pH的穩(wěn)定性則是表明酶液在不同pH 下的耐受程度［25-26］。

由圖6可以看出，隨著體系pH值的增加菊粉酶的活性變化較為顯著，在pH5.0時(shí)酶活達(dá)到最高(448 U/mg)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果，研究中采用不同pH值的0.2 mol/L醋酸緩沖溶液配制同濃度酶液，室溫下放置1 h后，測(cè)定其殘余酶的相對(duì)活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該菊粉酶活性仍在pH=5.0時(shí)活性最高(圖7)，因此，說(shuō)明該菊粉酶的最適pH值為5.0。

圖6 不同pH值對(duì)菊粉酶活力的影響Fig.6 Effect ofdifferent pH on inulinase activity

圖7 菊粉酶的酸堿穩(wěn)定性Fig.7 Effects of different pH on inulinase stability

2.2.3 底物濃度對(duì)菊粉酶活力的影響

底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)具有顯著的影響。當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)，提高底物濃度可以提高反應(yīng)速度;但當(dāng)?shù)孜餄舛容^高時(shí)，底物濃度進(jìn)一步提高，反應(yīng)速度的增加變得緩慢甚至不再增加。由圖8可以看出，隨著底物濃度的增加，菊粉酶活力先增加后趨于平穩(wěn)，說(shuō)明當(dāng)酶濃度一定時(shí)，繼續(xù)增加底物濃度對(duì)產(chǎn)物影響不顯著。也進(jìn)一步說(shuō)明在酶促反應(yīng)中酶濃度與底物濃度互相影響的關(guān)系。因此，研究中將菊粉酶的最適底物濃度設(shè)定為40 g/L。

2.2.4 金屬離子對(duì)菊粉酶活力的影響

金屬離子主要影響酶活性中心部位，從而影響酶的反應(yīng)速率。金屬離子對(duì)酶活性的影響表現(xiàn)為一為活化或激活作用，一為抑制作用［27］。圖9結(jié)果表明，Mg2+、I-、Li+、Fe3+、Al3+、K+對(duì)該菊粉酶有很強(qiáng)的抑制作用，Cu2+、Ca2+、Ag+對(duì)該菊粉酶活性起促進(jìn)作用，而Fe2+、Ba2+對(duì)該菊粉酶活性影響很小。

圖8 底物(菊粉)濃度對(duì)菊粉酶活力的影響Fig.8 Effect of inulin concentration on inulinase stability

圖9 金屬離子對(duì)菊粉酶活力的影響Fig.9 Effect of various metallic ions on inulinase activity

2.2.5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)菊粉酶活力的影響

由圖10可見(jiàn)，菊粉酶在0～30 min反應(yīng)時(shí)間與生成物濃度呈線性關(guān)系，此反應(yīng)速度是恒定的。因此，前30 min內(nèi)所測(cè)的反應(yīng)速度可以認(rèn)為是酶的初反應(yīng)速度。所以，確定測(cè)定該酶活性的最適反應(yīng)時(shí)間為30 min。

圖10 反應(yīng)時(shí)間對(duì)菊粉酶活力的影響Fig.10 Effect ofreaction time on inulinase activity

2.2.6 菊粉酶的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)是研究酶反應(yīng)速度規(guī)律以及各種因素對(duì)酶反應(yīng)速度影響的科學(xué)。研究酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)規(guī)律對(duì)于基礎(chǔ)研究及生產(chǎn)應(yīng)用都有十分重要的意義。酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)關(guān)系式，一般用米氏方程來(lái)表示。米氏方程中的Km是一個(gè)特征常數(shù)，它部分地描述了酶反應(yīng)性質(zhì)、反應(yīng)條件對(duì)酶反應(yīng)速度的影響。Km值越大，說(shuō)明酶與底物的親和力越小;反之，可認(rèn)為酶與底物的親和力越大［28］。根據(jù)圖11，由擬合直線的斜率和縱截距之比可求得米氏常數(shù)(Km)，菊粉酶催化底物菊粉的酶促反應(yīng)的米氏常數(shù)Km=3.83 mg/mL，最大反應(yīng)速度(vmax)為4.64 mg/(mL·min)。

圖11 菊粉酶的Lineweave-Burk雙倒數(shù)曲線Fig.11 Lineweave-Burk double reciprocal curve of inulinase

3 結(jié)論

灰平鏈霉菌S.griseoplanus S501固態(tài)發(fā)酵液經(jīng)采用硫酸銨分級(jí)沉淀、Sephadex G-7和DEAE-Sepharose CL-6B柱分離，獲得單組分菊粉酶，純化倍數(shù)為10.42倍，酶比活性249.5 U/mg蛋白。采用 SDSPAGE測(cè)定該菊粉酶組分的相對(duì)分子質(zhì)量為23.442 kDa。酶學(xué)性質(zhì)研究表明，該菊粉酶最適反應(yīng)溫度和pH值分別為50℃和5.0。金屬離子Mg2+、I-、Li+、Fe3+、Al3+、K+對(duì)該菊粉酶有很強(qiáng)的抑制作用，Cu2+、Ca2+、Ag+對(duì)該菊粉酶活性起促進(jìn)作用。以菊粉為底物時(shí)，該菊粉酶的Km為3.83 mg/mL，vmax為4.64 mg/(mL·min)，表現(xiàn)為與菊粉底物具有較強(qiáng)的親和力。

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