劉莉，王法松，李燕軍，謝希賢，陳寧

1(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津，300457)2(天津市氨基酸高效綠色制造工程實(shí)驗(yàn)室，天津，300457)

3(代謝控制發(fā)酵技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津，300457)

利巴韋林(Ribavirin)是一種高效廣譜的核苷類抗病毒藥物，被應(yīng)用于治療多種病毒感染如小鐵腺病毒肺炎、病毒性肝炎、呼吸道合胞病毒感染等［1］。發(fā)酵法是利用核苷生產(chǎn)菌自身產(chǎn)生前體物鳥(niǎo)苷和嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)，向培養(yǎng)基中添加1，2，4-三氮唑-3-羧甲酰胺(TCA)合成利巴韋林(見(jiàn)圖1)。目前，對(duì)發(fā)酵法合成利巴韋林的研究主要集中于菌種選育和發(fā)酵條件優(yōu)化，而培養(yǎng)基優(yōu)化也主要是考察無(wú)機(jī)鹽的作用，對(duì)于關(guān)鍵生長(zhǎng)因子的功能研究較少［2-4］。

磷酸核糖焦磷酸(PRPP)轉(zhuǎn)酰胺酶是嘌呤從頭合成途徑的關(guān)鍵酶，其活力的高低直接影響嘌呤合成途徑的通量［5］，是評(píng)價(jià)利巴韋林生產(chǎn)能力的指標(biāo)之一。PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶催化嘌呤合成途徑中PRPP轉(zhuǎn)化為1-氨基-5-磷酸核糖(PRA)，該酶受腺苷酸(AMP)、肌苷酸(IMP)及鳥(niǎo)苷酸(GMP)的阻遏，同時(shí)它還受到AMP系和GMP系中任一物質(zhì)的反饋?zhàn)瓒簦?］。如圖1所示，在 B.amyloliquefaciens TA208-LM 中 IMP、GMP被不斷利用，不會(huì)出現(xiàn)過(guò)度積累的現(xiàn)象，因此不會(huì)阻遏PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶的合成。本研究所用利巴韋林生產(chǎn)菌株B.amyloliquefaciens TA208-LM為腺嘌呤缺陷型菌株［7］，切斷了肌苷酸到腺苷琥珀酸的支路。但AMP可以通過(guò)補(bǔ)救途徑合成，指細(xì)胞利用培養(yǎng)基中的腺嘌呤在酶的作用下直接合成AMP［8］。腺嘌呤含量不足會(huì)影響菌體生長(zhǎng)，過(guò)多會(huì)轉(zhuǎn)化為大量的AMP，進(jìn)而阻遏PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶合成。因此腺嘌呤的用量是影響利巴韋林積累的關(guān)鍵因素［9-12］。

圖1 B.amyloliquefaciens TA208-LM中嘌呤核苷酸生物合成的反饋控制機(jī)制Fig.1 The feedback control mechanism of purine nucleotide biosynthesis in B.amyloliquefaciens TA208-LM

培養(yǎng)基中腺嘌呤主要來(lái)源于酵母抽提物，但酵母抽提物因不同廠家及產(chǎn)地質(zhì)量均有不同，利巴韋林產(chǎn)量很容易受到腺嘌呤供體酵母抽提物質(zhì)量的影響，很難保證發(fā)酵的穩(wěn)定性。本研究采用搖瓶發(fā)酵對(duì)腺嘌呤供體酵母抽提物種類和用量進(jìn)行確定，對(duì)發(fā)酵過(guò)程中所需腺嘌呤量進(jìn)行了優(yōu)化，并在發(fā)酵罐上研究了腺嘌呤限量供應(yīng)的作用，為今后利巴韋林生產(chǎn)提供一定指導(dǎo)意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

利巴韋林生產(chǎn)菌Bacillus amyloliquefaciens TA208-LM由天津科技大學(xué)代謝工程驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

活化斜面培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 1，蛋白胨10，牛肉膏 10，酵母膏 5，NaCl 2.5，瓊脂 20，pH 7.0～7.2。

種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 20，豆餅水解液 20，酵母粉 10，玉米漿 30，NaCl 2.5，MgSO4·7H2O 1，KH2PO41，味精 5，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖80，酵母粉 18，豆餅水解液 42，玉米漿 23，(NH4)2SO415，MgSO4·7H2O 8，K2HPO42.5，味精 15，MnSO40.006，F(xiàn)eSO40.012，無(wú)水 CaCl22.5，D-葡萄糖酸鈉 2，pH 7.0。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜Agilent 1200，美國(guó)安捷倫;7.5 L BioFlo 115自動(dòng)控制發(fā)酵罐，美國(guó)NBS公司。

1.3 磷酸核糖焦磷酸(PRPP)轉(zhuǎn)酰胺酶的活性檢測(cè):

粗酶液的制備、蛋白質(zhì)定量分析和PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶的活性測(cè)定參見(jiàn)文獻(xiàn)［13］。

1.4 游離和水解氨基酸樣品制備

取1 g酵母抽提物直接溶于去離子水中，13 000 r/min離心2 min，取1 mL上清液用于測(cè)定酵母抽提物中的游離氨基酸。

水解酵母抽提物采用安培管封管法，具體方法如下:稱取1 g的酵母抽提物于20 mL安培管中，加入10 mL 6 mol/L HCl，用液氮冷凍，待液體超過(guò)1/3凝固后，抽真空，熔化安培管使其密封;110℃水解22 h;水解完成后，冷卻后過(guò)濾;取適量濾液置于濃縮儀或旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，低于60℃，抽真空，蒸發(fā)至干;加入適量的去離子水溶解樣品，振蕩混勻，制得水解樣品。

1.5 發(fā)酵培養(yǎng)

搖瓶培養(yǎng):將B.amyloliquefaciens TA208-LM菌株經(jīng)斜面活化后接種于裝液量為30 mL的種子培養(yǎng)基中(500 mL搖瓶)，36℃培養(yǎng)10 h后以10%接種量接種于30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中(500 mL搖瓶)，每組3個(gè)平行。36℃培養(yǎng)，發(fā)酵周期為60 h，期間補(bǔ)加葡萄糖。每12 h添加20 g TCA，共添加3次。

7.5 L發(fā)酵罐培養(yǎng):將菌株經(jīng)斜面活化后接種于裝液量為4×100 mL的種子培養(yǎng)基中(1 L搖瓶)，36℃培養(yǎng)10 h后將種子培養(yǎng)基按10%接入7.5 L發(fā)酵罐中(裝液量為4 L)。發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)自動(dòng)流加氨水控制pH在7.0左右，培養(yǎng)溫度為36℃。當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖濃度降至一定值時(shí)，以設(shè)定脈沖速度將80%葡萄糖溶液流加至培養(yǎng)基中，以維持葡萄糖的濃度在菌體所需范圍內(nèi)。每12 h添加20 g TCA，共添加3次。

1.6 分析方法

1.6.1 菌體細(xì)胞生長(zhǎng)量(DCW)和葡萄糖消耗量的測(cè)定

發(fā)酵過(guò)程中，取適量發(fā)酵液稀釋后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定600 nm處的吸光度值。取10 mL發(fā)酵液，13 000 r/min離心10 min，用蒸餾水洗滌菌體3次，置于真空干燥箱中80℃干燥至恒重，用分析天平稱重。菌體生物量以干重(DCW)表示:1 OD600nm=0.245 g/L干菌體。葡萄糖濃度采用SBA-40C生物傳感儀測(cè)定。

1.6.2 高效液相色譜分析

高效液相色譜采用的離子柱Accurasil C18分別測(cè)定發(fā)酵液中利巴韋林、腺嘌呤含量以及酵母抽提物游離和水解樣品中氨基酸含量。以4%乙腈為流動(dòng)相，流速為1 mL/min，柱溫18.5℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為207 nm，測(cè)定發(fā)酵液上清液中的利巴韋林。以0.2 mol/L KH2PO4為流動(dòng)相，流速為1 mL/min，柱溫26℃，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm，測(cè)定發(fā)酵液上清液中的腺嘌呤。以乙腈與醋酸鈉溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，柱溫33℃，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm，用 2，4-二硝基氟苯柱前衍生測(cè)定游離和水解樣品的氨基酸含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同腺嘌呤供體對(duì)利巴韋林發(fā)酵的影響

由于實(shí)驗(yàn)所用的B.amyloliquefaciens TA208-LM是腺嘌呤缺陷型突變株，因此腺嘌呤是影響利巴韋林發(fā)酵的關(guān)鍵。在培養(yǎng)基中腺嘌呤的主要來(lái)源是酵母抽提物，實(shí)驗(yàn)分別選取3種酵母抽提物(Springer 2506、FM 888、LM 800)，添加量為 18 g/L，考察不同來(lái)源的酵母抽提物對(duì)利巴韋林發(fā)酵的影響。搖瓶發(fā)酵各參數(shù)見(jiàn)圖2，可見(jiàn)采用不同來(lái)源酵母抽提物發(fā)酵時(shí)菌體的生長(zhǎng)情況和產(chǎn)物積累量有明顯差異。由圖2 A菌體干重曲線可知，利用Springer 2506時(shí)菌體有一個(gè)較長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期，在60 h達(dá)到最大生物量13.72 g/L，而利用FM 888和LM 800酵母抽提物都有一個(gè)相對(duì)較短的對(duì)數(shù)期，36 h進(jìn)入穩(wěn)定期，發(fā)酵60 h達(dá)到其最大生物量10.98 g/L和11.68 g/L。另外，利用FM 888時(shí)發(fā)酵后期菌體有明顯衰退。分析3種酵母抽提物的氨基酸含量(見(jiàn)表1)和圖2 B葡萄糖消耗曲線可以看出Springer 2506所含氨基酸較其他2種高，消耗葡萄糖量最少。推測(cè)可能是其自身的氨基酸直接作為菌體生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而減少了葡萄糖的消耗。從圖2 C發(fā)酵過(guò)程中利巴韋林積累量曲線可知，利用Springer 2506發(fā)酵60 h，利巴韋林積累量達(dá)到7.72 g/L，而利用FM 888和LM 800發(fā)酵60 h時(shí)利巴韋林積累量?jī)H有5.13 g/L和6.44 g/L。結(jié)合圖2 D發(fā)酵過(guò)程中腺嘌呤含量變化，分析其與利巴韋林積累之間的聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵中后期3種酵母抽提物提供的腺嘌呤含量越低，利巴韋林的積累量也越低。通過(guò)圖2 D發(fā)現(xiàn)Springer 2506對(duì)腺嘌呤具有緩釋作用，腺嘌呤濃度既滿足了菌體的生長(zhǎng)需要，又不會(huì)在發(fā)酵中后期濃度過(guò)低，因此利巴韋林和菌體可大量積累。綜上所述，利用Springer 2506對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物積累最有利，確定Springer 2506作為利巴韋林發(fā)酵的腺嘌呤供體。

圖2 添加不同酵母抽提物利巴韋林搖瓶發(fā)酵的各參數(shù)比較Fig.2 Comparison of parameters in ribavirin shake-flask fermentation under different yeast extracts

表1 三種酵母抽提物中游離和水解氨基酸含量、游離腺嘌呤含量Table 1 Contents of amino acids and adenines in water solutions，and releasedamino acids in acid hydrolysates of three yeast extracts

2.2 Springer 2506濃度對(duì)利巴韋林發(fā)酵的影響

由于B.amyloliquefaciens TA208-LM是腺嘌呤缺陷型突變株，因此腺嘌呤的用量是影響利巴韋林發(fā)酵的關(guān)鍵因素?；谏蟼€(gè)實(shí)驗(yàn)確定Springer 2506是腺嘌呤的最佳供體，實(shí)驗(yàn)分別選取4個(gè)濃度(10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L)考察不同濃度的 Springer 2506對(duì)利巴韋林發(fā)酵的影響，搖瓶發(fā)酵各參數(shù)見(jiàn)圖3。由圖3可看出，不同濃度的Springer 2506發(fā)酵時(shí)菌體的生長(zhǎng)情況和產(chǎn)物積累量有明顯差異。從圖3 A菌體干重曲線和圖3 B葡萄糖消耗曲線可以看出隨著Springer 2506濃度的增加菌體生物量和耗糖也有明顯增加。從圖3 C發(fā)酵過(guò)程中利巴韋林積累曲線可以看出，Springer 2506濃度為15 g/L時(shí)，發(fā)酵過(guò)程利巴韋林積累量最高，達(dá)到8.94 g/L;當(dāng)濃度大于15 g/L時(shí)，利巴韋林積累量逐步降低。結(jié)合圖3 D發(fā)酵過(guò)程中腺嘌呤含量變化，分析其與利巴韋林積累之間的聯(lián)系，發(fā)酵中后期腺嘌呤含量過(guò)低或過(guò)高都會(huì)影響利巴韋林的積累量。推測(cè)出現(xiàn)上述現(xiàn)象的原因是Springer 2506在發(fā)酵過(guò)程中緩慢釋放腺嘌呤，導(dǎo)致后期腺嘌呤過(guò)量，加快菌體生長(zhǎng)，大量的葡萄糖流向EMP途徑，使得合成利巴韋林的代謝通量減弱。

圖3 添加不同濃度Springer 2506的利巴韋林搖瓶發(fā)酵各參數(shù)比較Fig.3 Comparison of parameters in ribavirin shake-flask fermentation under different concentrations of Springer 2506

磷酸核糖焦磷酸(PRPP)轉(zhuǎn)酰胺酶是嘌呤從頭合成途徑的關(guān)鍵酶，該酶活性的高低直接影響進(jìn)入核苷合成途徑的通量。對(duì)于B.amyloliquefaciens TA208-LM(見(jiàn)圖2)來(lái)說(shuō)，自身不能合成AMP，由于補(bǔ)救途徑的存在，腺嘌呤會(huì)轉(zhuǎn)化成AMP，進(jìn)而影響PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶活性，因此培養(yǎng)基中酵母抽提物所提供的腺嘌呤就成為影響PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶的關(guān)鍵。由圖4 A可以看出Springer 2506濃度為15 g/L下PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶活力最高，因此進(jìn)入核苷合成途徑的通量也就越大。圖4 B表明在添加15 g/L Springer 2506的發(fā)酵過(guò)程中PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶活性隨發(fā)酵時(shí)間而逐漸降低，而圖3 D所示在發(fā)酵36 h后腺嘌呤含量逐步升高。原因可能是發(fā)酵中后期腺嘌呤含量上升，除了導(dǎo)致上述代謝溢流外，同時(shí)降低了PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶活性，進(jìn)而影響利巴韋林的合成。綜上所述，在利巴韋林發(fā)酵過(guò)程中，控制Springer 2506濃度為15 g/L，可以避免高濃度的腺嘌呤對(duì)PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶的阻遏和代謝溢流，有利于利巴韋林的積累。

圖4 PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶活性比較Fig.4 Comparison of enzyme activities of PRPP amidotransferase

2.3 不同初始腺嘌呤濃度對(duì)利巴韋林積累的影響

酵母抽提物富含多種發(fā)酵所需的生長(zhǎng)因子，前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其在利巴韋林發(fā)酵過(guò)程中難以被取代。本研究使用的Springer 2506對(duì)腺嘌呤具有緩釋作用，導(dǎo)致發(fā)酵后期腺嘌呤濃度過(guò)高(圖3D)，影響了PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶活力。為了穩(wěn)定發(fā)酵過(guò)程中的腺嘌呤含量維持較高的PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶活力，既滿足菌體生長(zhǎng)又不會(huì)帶來(lái)過(guò)高腺嘌呤濃度，降低Springer 2506的初始濃度，額外添加腺嘌呤，研究不同初始腺嘌呤濃度對(duì)利巴韋林積累的影響。初始培養(yǎng)基中以1%Springer 2506為基礎(chǔ)，額外添加不同濃度的腺嘌呤，即培養(yǎng)基中初始腺嘌呤總量分別為39.97、43.37、47.95、61.36、67.04 mg/L，搖瓶發(fā)酵各參數(shù)見(jiàn)圖 5。

由圖5 A菌體干重曲線和圖5 B葡萄糖消耗曲線可知，隨著初始腺嘌呤含量的增加，生物量和耗糖也隨之增加。從圖5 C發(fā)酵過(guò)程中利巴韋林積累曲線可以看出，當(dāng)發(fā)酵液中初始腺嘌呤濃度為39.97～47.95 mg/L時(shí)，利巴韋林產(chǎn)量隨著腺嘌呤濃度的增加而增加;當(dāng)初始腺嘌呤濃度為47.95 mg/L時(shí)，發(fā)酵60 h時(shí)利巴韋林積累最高，達(dá)到8.14 g/L;但當(dāng)初始腺嘌呤濃度高于47.95 mg/L時(shí)，發(fā)酵60 h時(shí)利巴韋林積累量明顯降低。

圖5 不同初始腺嘌呤濃度下利巴韋林的搖瓶發(fā)酵各參數(shù)比較Fig.5 Comparison of parameters in ribavirin shake-flask fermentation under different initialconcentrations of adenine

結(jié)合圖5D發(fā)酵液中腺嘌呤的含量曲線和圖6A分析，發(fā)酵液中腺嘌呤含量對(duì)PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶有明顯影響，但比15 g/L Springer 2506下發(fā)酵液中腺嘌呤含量有明顯降低，PRPP酶活力也有所提高。結(jié)合圖5D和圖6B分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵中后期維持發(fā)酵液中腺嘌呤含量在40～50 mg/L有利于維持PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶活力。綜上所述，降低初始酵母抽提物濃度額外添加腺嘌呤，有利于發(fā)酵中后期腺嘌呤濃度維持在一個(gè)穩(wěn)定的范圍內(nèi)，保持PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶活力，進(jìn)而提高利巴韋林積累量。

圖6 PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶活性比較Fig.6 Comparison of enzyme activities of PRPP amidotransferase

2.4 Springer 2506分批補(bǔ)料發(fā)酵過(guò)程分析

前期工作中發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過(guò)程中較高的腺嘌呤含量有益于菌體生長(zhǎng)，較低的腺嘌呤含量有利于解除對(duì)關(guān)鍵酶PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶的阻遏作用，提高利巴韋林積累量。采用不同工藝條件進(jìn)行7.5 L分批補(bǔ)料發(fā)酵，發(fā)酵開(kāi)始時(shí)添加一定濃度的Springer 2506用于菌體生長(zhǎng)，發(fā)酵6 h開(kāi)始以1.5 g/(L·h)的速率流加不同濃度的Springer 2506，通過(guò)限制發(fā)酵液中腺嘌呤的含量，解除其對(duì)PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶的阻遏?？疾炝瞬煌桨笇?duì)利巴韋林發(fā)酵的影響。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2和圖7。

方案1:15 g/L的Springer 2506直接添加到培養(yǎng)基中，不流加;

方案2:7.5 g/L的Springer 2506為底物，流加7.5 g/L的Springer 2506;

方案3:3 g/L的Springer 2506為底物，流加12 g/L的 Springer 2506。

表2 Springer 2506不同添加方案下利巴韋林分批補(bǔ)料發(fā)酵過(guò)程參數(shù)比較Table 2 Comparison of parameters in fed-batch ribavirin fermentationunder different Springer 2506 feeding programs

圖7 不同Springer 2506添加方案下發(fā)酵過(guò)程菌體比生長(zhǎng)速率和利巴韋林比生產(chǎn)速率Fig.7 Kinetic parameters of ribavirin fermentation on specific growth rate and specific ribavirin production rate under different Springer 2506 feeding programs

結(jié)合表2和圖7可知，隨初始培養(yǎng)基中腺嘌呤供體Springer 2506濃度不同，菌體生物量及利巴韋林的積累量有明顯差異。方案1和方案2獲得的最大生物量差異不大，分別為6.71 g/L和6.31 g/L，但方案2中后期比生長(zhǎng)速率緩慢下降;方案2有較高的比生產(chǎn)速率，與方案1相比利巴韋林積累量高出11.29%。方案3獲得的最大生物量?jī)H有5.69 g/L，有較低的比生長(zhǎng)速率，與方案1相比利巴韋林積累量降低7.15%。在方案2下，腺嘌呤維持在合適濃度范圍，導(dǎo)致PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶活力較高，從而以較高的生產(chǎn)速率合成利巴韋林?？梢?jiàn)，適當(dāng)?shù)販p少初始Springer 2506的濃度，通過(guò)流加酵母抽提物，有利于提高利巴韋林的合成速率。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)搖瓶實(shí)驗(yàn)確定了Springer 2506是利巴韋林發(fā)酵的最佳腺嘌呤供體，用量在15 g/L時(shí)最有利于利巴韋林積累。在15 g/L Springer 2506的條件下，發(fā)酵中后期PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶活力顯著下降，說(shuō)明發(fā)酵液中腺嘌呤含量仍是過(guò)高。為了降低發(fā)酵過(guò)程中的腺嘌呤含量維持PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶活力，在既滿足菌體生長(zhǎng)又不會(huì)帶來(lái)過(guò)高腺嘌呤濃度的前提下降低Springer 2506的初始濃度，額外添加腺嘌呤，發(fā)現(xiàn)初始腺嘌呤總量為47.95 mg/L時(shí)，發(fā)酵液中腺嘌呤含量維持在40～50 mg/L，PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶活力最高，合成利巴韋林的量最大。在分析以上發(fā)酵過(guò)程曲線的基礎(chǔ)上，認(rèn)為控制腺嘌呤供體酵母抽提物的初始濃度、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)流加酵母抽提物，可能為有效的腺嘌呤供應(yīng)方式。采用以7.5 g/L Springer 2506為底物，流加7.5 g/L的Springer 2506的方式分批補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)利巴韋林，比一次性添加15 g/L的Springer 2506，利巴韋林的積累量提高11.29%。

1976年Ochiai等［14］首次提出發(fā)酵法，核苷生產(chǎn)菌自身產(chǎn)生前體物鳥(niǎo)苷和表達(dá)嘌呤核苷磷酸化酶，只向培養(yǎng)基中添加TCA，即可實(shí)現(xiàn)利巴韋林的合成。由于菌株自身的嘌呤核苷磷酸化酶活性低，利巴韋林產(chǎn)量?jī)H有0.28 g/L。2007年武改紅等［4］利用枯草芽孢桿菌TM903作為利巴韋林生產(chǎn)菌，優(yōu)化培養(yǎng)基成分、前體物TCA、培養(yǎng)溫度及pH等條件，發(fā)酵結(jié)束時(shí)利巴韋林僅有5 g/L。而本研究所用的菌株B.amyloliquefaciens TA208-LM能高效表達(dá)嘌呤磷酸化酶，彌補(bǔ)早期實(shí)驗(yàn)中嘌呤磷酸化酶活性不足的問(wèn)題。此外，經(jīng)本工藝優(yōu)化，利巴韋林積累量最高達(dá)到8.94 g/L。由此可見(jiàn)，采用腺嘌呤限量供應(yīng)的發(fā)酵工藝能夠顯著提高利巴韋林產(chǎn)量，為工業(yè)化生產(chǎn)利巴韋林的發(fā)酵過(guò)程控制提供借鑒。

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