郭金英，李彤輝，朱蓓茹，任國(guó)艷，崔國(guó)庭，李政軍，馮惠敏

(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng)，471023)

發(fā)菜(Nostoc flagelliforme)，又稱發(fā)狀念珠藻，屬藍(lán)菌門(mén)念珠藻目，廣泛分布于世界各地的干旱、半干旱地區(qū)。發(fā)菜營(yíng)養(yǎng)豐富，富含多糖、氨基酸和Mn、Fe、Ca、Cu、Sr等微量元素［1-2］，屬于藥食兩用植物［3］，且因其諧音寓意“發(fā)財(cái)”而備受我國(guó)沿海和東南亞地區(qū)居民的喜愛(ài)［4］，為我國(guó)出口外匯帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)效益。

野生發(fā)菜多貼于荒漠植物下方生長(zhǎng)，生長(zhǎng)緩慢，采摘時(shí)極易破壞地表植被，造成土壤沙漠化，對(duì)發(fā)菜的掠奪性采收嚴(yán)重破壞了荒漠草場(chǎng)的生態(tài)環(huán)境。為保護(hù)生態(tài)環(huán)境，我國(guó)政府于2000年將發(fā)菜列為國(guó)家一級(jí)野生保護(hù)植物，并頒布規(guī)定嚴(yán)禁發(fā)菜的采集和貿(mào)易。因此，將發(fā)菜藻體細(xì)胞從野生發(fā)菜中成功分離并實(shí)現(xiàn)人工培養(yǎng)得到了較多的關(guān)注。人工液體培養(yǎng)發(fā)菜是解決供應(yīng)矛盾的一個(gè)重要發(fā)展方向。

近年來(lái)，對(duì)發(fā)菜的人工培養(yǎng)進(jìn)行了較多的研究，有關(guān)研究人員以發(fā)菜細(xì)胞為培養(yǎng)材料，研究了培養(yǎng)基、溫度、營(yíng)養(yǎng)和光強(qiáng)等條件對(duì)發(fā)菜細(xì)胞生長(zhǎng)以及胞外多糖產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)發(fā)菜細(xì)胞在BG-11培養(yǎng)基中有最高生長(zhǎng)速率，適合發(fā)菜生長(zhǎng)［5］，而N、P和Ca2+缺乏會(huì)顯著降低液體培養(yǎng)發(fā)菜細(xì)胞的生長(zhǎng)速率，一定濃度(1～200 mg/L)的La(NO3)3能促進(jìn)發(fā)菜細(xì)胞的生長(zhǎng)，同時(shí)還能夠影響部分氨基酸的含量［6］。隨著培養(yǎng)溫度的增加，發(fā)菜細(xì)胞胞外多糖產(chǎn)量逐漸下降，不同光強(qiáng)對(duì)胞外多糖產(chǎn)量具有顯著影響，高光強(qiáng)和低光強(qiáng)下的多糖含量均較高［7-8］。

本實(shí)驗(yàn)用優(yōu)化后的BG-11培養(yǎng)基［5］進(jìn)行人工液體培養(yǎng)發(fā)菜細(xì)胞，通過(guò)高效液相色譜、ICP-OES等方法分別對(duì)人工液體培養(yǎng)發(fā)菜細(xì)胞與野生發(fā)菜中的蛋白質(zhì)、氨基酸、微量元素和多糖等營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行檢測(cè)比較。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)和處理

發(fā)菜采集于寧夏銀川賀蘭山東麓，河南科技大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室分離、純化、保存。發(fā)菜細(xì)胞經(jīng)活化后，收集細(xì)胞接種于優(yōu)化后新鮮無(wú)菌的含外源N的BG-11培養(yǎng)基中，放置在生化培養(yǎng)箱中在25℃和80 μmol/(m2·s)光照強(qiáng)度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，20 d后，4 000 r/min離心10 min，取上清液，備用。其余發(fā)菜培養(yǎng)液用4層紗布過(guò)濾得到藻體細(xì)胞，將發(fā)菜細(xì)胞放入80℃烘箱中烘干1 h后，多次稱量至恒重，在研缽中研磨成粉，過(guò)100目篩，得到發(fā)菜細(xì)胞粉，備用。

野生發(fā)菜:甘肅采集。將野生發(fā)菜反復(fù)清洗后80℃烘干1 h后研磨，繼續(xù)烘干30 min，多次稱量至恒重，得到野生發(fā)菜粉，備用。

1.2 試劑

Ca、Mg、Cu、Zn、Fe、Sr、Se(1 000 μg/mL)標(biāo)準(zhǔn)存儲(chǔ)溶液國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心。

1.3 儀器

1260高效液相色譜，美國(guó)安捷倫科技有限公司;MARS6型微波消解儀，美國(guó)CEM公司;700系列ICP-OES，美國(guó)安捷倫科技有限公司;AFS-9800原子熒光光度計(jì)，北京科創(chuàng)海光儀器有限公司;SPX-250型生化培養(yǎng)箱，北京市永明醫(yī)療儀器廠;TGL-18C型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠;722S型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司;LG-5型真空冷凍干燥機(jī)，上海市離心機(jī)械研究所;101-0型電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司;Milli-Q超純水機(jī)，美國(guó)Millipore公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 發(fā)菜粗多糖含量測(cè)定

人工液體培養(yǎng)發(fā)菜細(xì)胞胞外多糖提取:用超濾濃縮和乙醇沉淀法［9］。

人工液體培養(yǎng)發(fā)菜和野生發(fā)菜莢膜多糖提取:用熱水浸提法［10］。

多糖含量測(cè)定:用苯酚-硫酸法。

1.4.2 發(fā)菜粗脂肪含量測(cè)定

分別取發(fā)菜細(xì)胞粉、野生發(fā)菜粉適量，用索氏抽提法［11］測(cè)定其粗脂肪含量。

1.4.3 發(fā)菜粗蛋白質(zhì)含量測(cè)定

分別取發(fā)菜細(xì)胞粉、野生發(fā)菜粉適量，用凱氏定氮法［11］測(cè)定其粗蛋白質(zhì)含量。

1.4.4 氨基酸含量測(cè)定

樣品前處理:分別取2.5 g樣品放入安培瓶中，各加6 mol/L HCl 4 mL，加2～3滴重蒸苯酚，用氮?dú)獯祾邤?shù)秒后迅速用酒精噴燈對(duì)安培瓶封口，封口完畢后置于烘箱中110℃恒溫消解23 h，消解后去封口，將消解液置于離心管中9 000 r/min離心10 min去沉淀，抽取上清液于50 mL容量瓶，用6 mol/L NaOH調(diào)pH值為6～7，用磷酸緩沖液進(jìn)行定容，0.22 μm微孔膜過(guò)濾去雜質(zhì)。

柱前衍生:吸取5 mL上述樣液于10mL容量瓶中，依次加 0.5 mol/L NaHCO32mL，1%2，4-二硝基氟苯乙腈1 mL，混勻置于暗處，60℃水浴衍生6 h，放置室溫。

高效液相色譜測(cè)定:氨基酸單品標(biāo)準(zhǔn)液濃度為5 mg/mL，混標(biāo)為200 μg/mL，抽取適量進(jìn)行高效液相色譜測(cè)量，流動(dòng)相流速為1.0 mL/min，檢出波長(zhǎng)360 nm，柱溫 40℃，進(jìn)樣量10 μL。

1.4.5 Ca、Mg、Cu、Zn、Fe、Sr含量測(cè)定

樣品處理:分別稱取適量樣品于消解罐內(nèi)，加6 mL HNO3和2 mL H2O2，振蕩搖勻后加蓋密封，放入微波消解儀中進(jìn)行消解，消解條件見(jiàn)表1，同時(shí)做空白對(duì)照。消解完全后將消解液移至燒杯中放在電熱板上加熱驅(qū)除過(guò)量的HNO3，取下放冷，將消解液移入25 mL具塞管中，用0.5 mol/L的HNO3定容，備用。

表1 微波消解條件Table 1 The conditions of microwave digestion

標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的制備及回歸方程、相關(guān)系數(shù)的獲得:用0.5 mol/L的HNO3配制各元素標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，配制濃度見(jiàn)表2。以表3的工作條件用ICP-OES測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的強(qiáng)度值繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得出回歸方程和相關(guān)系數(shù)(見(jiàn)表4)。

表3 725型ICP-OES工作條件Table 3 The working conditions

表4 各元素回歸方程及其相關(guān)系數(shù)Table 4 The regression equation and correlation coefficient of each element

參照 DB53/T 288-2009云南省地方標(biāo)準(zhǔn)ICPAES 法測(cè)定樣品中 Ca、Mg、Cu、Zn、Fe、Sr的含量。

1.4.6 Se含量測(cè)定

樣品處理:取適量樣品于消解罐中，加6 mL HNO3和2 mL H2O2，振蕩搖勻后進(jìn)行微波消解，消解條件同表1。待消解液冷卻后移入燒杯中放在電熱板上加熱至近干，不能蒸干，再加5 mL HCl，繼續(xù)加熱至溶液變?yōu)榍辶翢o(wú)色并伴有白煙出現(xiàn)，將六價(jià)硒還原為四價(jià)硒。冷卻后移至25 mL具塞管中定容，搖勻備用。吸取5 mL消化液于10 mL離心管中，加 1 mL HCl，0.5 mL 100 g/L 的 K3Fe(CN)6，混勻待測(cè)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:用0.5 mol/L HNO3配制Se元素標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，配制濃度依次為 0、1、2、4、8、10 ng/mL，用原子熒光光度計(jì)測(cè)定Se系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到硒的標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=107.665x+67.105，R2=0.999 7。參照國(guó)標(biāo)GB 5009.93-2010氰化物原子熒光光譜法測(cè)定樣品中Se的含量。

1.4.7 營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)方法

根據(jù)FAO/WHO建議的氨基酸評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)模式和全雞蛋蛋白質(zhì)的氨基酸模式［12］，分別按以下公式計(jì)算氨酸酸評(píng)分(AAS)、化學(xué)評(píng)分(CS)和必需氨基酸指數(shù)(EAAI)。

式中:aa為樣品氨基酸含量，mg/g;AA(FAO/WHO)為FAO/WHO評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)模式中同種氨基酸含量，mg/g;AA(Egg)為全雞蛋蛋白質(zhì)中同種氨基酸含量，mg/g;n為比較的必需氨基酸數(shù)目，本文n=7;A、B…H為樣品蛋白質(zhì)中必需氨基酸含量，mg/g;AE、BE…HE為全雞蛋蛋白質(zhì)中相對(duì)應(yīng)的必需氨基酸含量，mg/g。

2 結(jié)果與討論

2.1 人工培養(yǎng)發(fā)菜與野生發(fā)菜中粗多糖、脂肪、蛋白質(zhì)含量

人工培養(yǎng)發(fā)菜與野生發(fā)菜中粗多糖、脂肪、蛋白質(zhì)含量見(jiàn)表5。由表5可知，人工培養(yǎng)發(fā)菜中的胞外多糖達(dá)到36.95 mg/L，莢膜多糖為15.03 mg/kg，而野生發(fā)菜中的莢膜多糖為13.84 mg/kg。野生發(fā)菜具有特殊的生長(zhǎng)特性［13］，一方面，它在干旱時(shí)期休眠狀態(tài)積累干物質(zhì)，另一方面它在濕潤(rùn)條件下復(fù)吸水進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，而人工培養(yǎng)能根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況調(diào)整培養(yǎng)條件，使其一直處于穩(wěn)定狀態(tài)，使得人工培養(yǎng)發(fā)菜能分泌較多的胞外多糖，莢膜多糖含量也有所增加。人工液體培養(yǎng)發(fā)菜中蛋白質(zhì)含量為26.17 g/100 g，野生發(fā)菜蛋白質(zhì)含量為23.05 g/100g，兩者的脂肪含量都較少，分別為0.23 g/100 g和0.31 g/100 g。

表5 人工液體培養(yǎng)與野生發(fā)菜中粗多糖、脂肪、蛋白質(zhì)含量(± S，n=3)Table 5 Crude polysaccharide，fat and protein contents of cultured and wild Nostoc flagelliforme(± S，n=3)

表5 人工液體培養(yǎng)與野生發(fā)菜中粗多糖、脂肪、蛋白質(zhì)含量(± S，n=3)Table 5 Crude polysaccharide，fat and protein contents of cultured and wild Nostoc flagelliforme(± S，n=3)

胞外多糖/(mg·L-1)莢膜多糖/(mg·kg-1)脂肪/［g·(100g)-1］蛋白質(zhì)/［g·(100g)-1］人工液體培養(yǎng)發(fā)菜 36.95±0.19 15.03±0.05 0.23±0.004 26.17±1.31野生發(fā)菜- 13.84±0.11 0.31±0.002 23.05±0.94

2.2 人工液體培養(yǎng)發(fā)菜與野生發(fā)菜中氨基酸含量

由表6可以看出，人工液體培養(yǎng)發(fā)菜與野生發(fā)菜總氨基酸含量分別為21.99 mg/g和21.20 mg/g，但人工培養(yǎng)發(fā)菜的必需氨基酸含量為11.73 mg/g，高于野生發(fā)菜，是野生發(fā)菜的1.47倍。兩者的EAA/TAA分別為53.34%、37.60%，符合FAO/WHO推薦的質(zhì)量較好的蛋白質(zhì)氨基酸組成在40%左右的要求，其中EAA/NEAA為1.14和0.60，也符合理想蛋白質(zhì)模式［14］。兩者的必需氨基酸中苯丙氨酸的含量最高，對(duì)改善記憶力提高思維敏捷度有明顯功效。呈味氨基酸天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸在野生發(fā)菜中的含量略高于人工液體培養(yǎng)發(fā)菜，占總氨基酸量的28.40%，豐富的呈味氨基酸是構(gòu)成發(fā)菜特有風(fēng)味的重要原因。野生發(fā)菜中脯氨酸的含量是人工液體培養(yǎng)發(fā)菜的15.88倍，分析在野生條件下，環(huán)境溫度較高，土壤鹽堿性較大，脯氨酸含量的增加能提高發(fā)菜的耐鹽性［15］。

表6 人工液體培養(yǎng)與野生發(fā)菜中氨基酸含量(±S，n=3) 單位:mg/kgTable 6 Amino acid contents of cultured and wild Nostoc flagelliforme(± S，n=3)

表6 人工液體培養(yǎng)與野生發(fā)菜中氨基酸含量(±S，n=3) 單位:mg/kgTable 6 Amino acid contents of cultured and wild Nostoc flagelliforme(± S，n=3)

注*:呈味氨基酸。

類(lèi)別 氨基酸種類(lèi) 人工液體培養(yǎng)發(fā)菜 野生發(fā)菜異亮氨酸0.18±0.001 0.18±0.001亮氨酸 2.76±0.17 2.21±0.24必需 蛋氨酸 0.82±0.003 0.38±0.01氨基酸 苯丙氨酸 4.09±0.97 3.01±0.56纈氨酸 2.16±0.24 1.66±0.11蘇氨酸 0.79±0.01 0.31±0.001賴氨酸 0.93±0.01 0.22±0.003半必需 組氨酸 1.37±0.001 0.81±0.002氨基酸 精氨酸 0.12±0.001 0.53±0.001天冬氨酸* 0.49±0.003 0.38±0.001酪氨酸 0.09±0.001 0.11±0.001非必需 胱氨酸 0.023±0.001 0.014±0.002氨基酸 谷氨酸* 1.40±0.04 1.17±0.06甘氨酸* 3.74±0.021 4.20±0.17絲氨酸 2.57±0.12 1.94±0.07丙氨酸* 0.22±0.001 0.27±0.001脯氨酸 0.24±0.001 3.81±0.007氨基酸總量(TAA) 21.99±0.12 21.20±0.095必需氨基酸含量(EAA)11.73±0.23 7.97±0.19非必需氨基酸(NEAA) 10.26±0.18 13.23±0.14呈味氨基酸(DAA) 5.85±0.007 6.02±0.06 EAA/TAA/% 53.34 37.60 EAA/NEAA 1.14 0.60 DAA/TAA/% 26.60 28.40

AAS和CS從不同角度反映了蛋白質(zhì)構(gòu)成和利用率的關(guān)系，而EAAI反映了蛋白源的必需氨基酸組成與標(biāo)準(zhǔn)蛋白必需氨基酸組成的擬合程度，是評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的常用指標(biāo)［16］。由表7中氨基酸評(píng)分結(jié)果(AAS)和化學(xué)評(píng)分(CS)可知，人工液體培養(yǎng)發(fā)菜的第一限制性氨基酸為異亮氨酸，第二限制性氨基酸為賴氨酸，而野生發(fā)菜的第一限制性氨基酸為賴氨酸，第二限制性氨基酸為異亮氨酸。

表7 人工液體培養(yǎng)與野生發(fā)菜中必需氨基酸組成的評(píng)價(jià)Table 7 Evaluation of essential amino acid contents of cultured and wild Nostoc flagelliforme

2.3 人工液體培養(yǎng)發(fā)菜與野生發(fā)菜中Ca、Mg、Cu、Zn、Fe、Sr、Se 含量

藻類(lèi)的細(xì)胞壁帶有一定的負(fù)電荷，細(xì)胞膜具有高度選擇性的半透膜，能富集一些金屬離子［17］，而其細(xì)胞壁表面存在的多糖、蛋白質(zhì)、脂肪等物質(zhì)增強(qiáng)了它的金屬結(jié)合能力［18］，使得藻類(lèi)含有較豐富的礦物質(zhì)元素。表8為野生發(fā)菜和人工液體培養(yǎng)發(fā)菜中的微量元素含量。表8中顯示，發(fā)菜中含有豐富的Ca、Mg、Fe、Zn、Sr，兩者Fe的含量相差不大，人工液體培養(yǎng)發(fā)菜中Mg、Cu、Zn、Se 的含量分別是野生發(fā)菜的2.9、3.4、3.8、1.6倍，而Ca和Sr的含量則少于野生發(fā)菜，Ca具有保護(hù)細(xì)胞膜、調(diào)控細(xì)胞內(nèi)酶活動(dòng)和細(xì)胞膜滲透的作用，Ca元素對(duì)增強(qiáng)植物碳水化合物含量，提高植株抗性等方面起著重要的作用［19］。野生發(fā)菜生長(zhǎng)在環(huán)境惡劣、土壤貧瘠的地方，鈣的積累更有利于其生長(zhǎng)，Sr和Se的含量與其生長(zhǎng)環(huán)境及土壤富集有關(guān)系。

表8 人工液體培養(yǎng)和野生發(fā)菜中元素含量(±S，n=3) 單位:mg/kgTable 8 Element contents of cultured and wild Nostoc flagelliforme(± S，n=3)

表8 人工液體培養(yǎng)和野生發(fā)菜中元素含量(±S，n=3) 單位:mg/kgTable 8 Element contents of cultured and wild Nostoc flagelliforme(± S，n=3)

元素 人工液體培養(yǎng)發(fā)菜 野生發(fā)菜 人工培養(yǎng)/野生Ca 3 625.35±5.03 1 5079.43±4.01 0.24±0.01 Mg 2 387.24±3.21 816.54±2.70 2.90±0.03 Cu 11.26±0.07 3.30±0.05 3.40±0.11 Fe 349.23±4.71 367.62±3.31 0.95±0.01 Zn 52.29±1.42 13.88±0.91 3.80±0.07 Sr 7.97±0.93 127.59±2.13 0.063±0.01 Se 1.06±0.06 0.68±0.01 1.60±0.14

3 結(jié)論

本文分析研究了野生發(fā)菜和人工液體培養(yǎng)發(fā)菜細(xì)胞的蛋白質(zhì)、多糖、氨基酸及微量元素的含量，結(jié)果表明，人工液體培養(yǎng)發(fā)菜的莢膜多糖、粗蛋白、脂肪含量與野生發(fā)菜差別較少，兩者都含有較高比例的蛋白質(zhì)，較低比例的脂肪，是一種高蛋白低脂肪的藻類(lèi)食品;氨基酸種類(lèi)豐富，含量高，人工培養(yǎng)和野生發(fā)菜中的呈味氨基酸/總氨基酸分別為26.60%和28.40%，構(gòu)成發(fā)菜的特有風(fēng)味，必需氨基酸/總氨基酸分別為37.60%和53.34%，趨近于或高于40%的普通蛋白質(zhì)正常比例，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值符合FAO/WHO推薦的蛋白質(zhì)氨基酸要求;人工培養(yǎng)發(fā)菜和野生發(fā)菜中各微量元素的含量略有不同，但均富含人體所需的 Ca、Mg、Cu、Fe、Zn、Sr、Se 等人體必需礦物元素。人工液體培養(yǎng)發(fā)菜營(yíng)養(yǎng)均衡，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，符合人類(lèi)營(yíng)養(yǎng)需求，具有廣闊的發(fā)展前景。

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