熊濤，廖良坤，黃濤，鄧耀軍

(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西南昌，330047)

乳酸菌(lactic acid bacteria)是一類對宿主有益的革蘭氏陽性益生菌［1］，能通過調(diào)節(jié)腸道菌群平衡和增強腸道黏膜抵御病原菌的入侵來發(fā)揮益生功能［2］。人們獲取益生菌的途徑主要是食用益生菌發(fā)酵的食品或服用含有益生菌活菌的藥劑，益生菌制品的生產(chǎn)需要高質(zhì)量的菌劑作保障。目前，國際上益生菌劑的生產(chǎn)方式主要為冷凍干燥，然而冷凍干燥耗時長，耗能高，產(chǎn)量小，使得冷凍干燥的菌劑生產(chǎn)成本高。噴霧干燥是將物料經(jīng)噴嘴霧化成小液滴，在干燥塔中經(jīng)過熱交換和質(zhì)交換，使物料快速干燥的一種方法［3］。由于噴霧干燥的高速率及其連續(xù)性特性，適于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)［4］。自1914年 Rogers應(yīng)用噴霧干燥生產(chǎn)出菌劑以來，國內(nèi)外關(guān)于噴霧干燥制備菌劑的研究越來越多，但通過噴霧干燥制備菌劑的應(yīng)用仍然沒有大的突破，噴霧干燥制備乳酸菌劑尚在試驗階段，目前世界上還沒有公司利用噴霧干燥技術(shù)規(guī)模化生產(chǎn)乳酸菌菌劑。噴霧干燥過程將菌體置于高溫、高滲、氧化等嚴(yán)苛的環(huán)境下，使得菌體遭受到嚴(yán)重的損傷或大量死亡，而加入保護(hù)劑通常能大大提高菌體的存活率。噴霧干燥制備的菌劑的優(yōu)良與否與乳酸菌的特異性和保護(hù)劑的種類有著密切的聯(lián)系［5］，因此，研究乳酸菌的噴霧干燥技術(shù)對其應(yīng)用有著重要意義。隨著研究的不斷深入，乳酸菌噴霧干燥技術(shù)從最初的條件優(yōu)化進(jìn)入到對細(xì)胞結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)的研究，如高溫對菌體的主要損傷部位的研究［6］，噴霧干燥過程中細(xì)胞膜的損傷［7］、菌體性能的變化［8］以及耐熱基因的研究［9］等。

目前，我國已經(jīng)在發(fā)酵產(chǎn)業(yè)方面有了很大的發(fā)展，但是國內(nèi)商業(yè)化的發(fā)酵劑生產(chǎn)廠家仍然極少，國內(nèi)的發(fā)酵劑市場一直被國外公司壟斷，發(fā)酵產(chǎn)品生產(chǎn)企業(yè)只能依靠進(jìn)口發(fā)酵劑，這極大地制約了我國發(fā)酵產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，本研究在擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的高性能植物乳桿菌 NCU116的基礎(chǔ)上，探索植物乳桿菌NCU116高濃度菌劑的噴霧干燥制備技術(shù)，以期為我國發(fā)酵劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

植物乳桿菌NCU116(Lactobacillus plantarum NCU116)，由南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室保藏。

MRS培養(yǎng)基的制備參考文獻(xiàn)［10］制備。

1.2 試劑與儀器

脫脂乳(食品級)，海藻糖(食品級)，谷氨酸鈉(食品級)，碘化丙啶(PI)，美國Sigma公司;羧基熒光素乙二酸酯(CFDA)，美國Sigma公司。

B-290小型噴霧干燥儀，瑞士步琪公司;BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀，美國BD公司;XL-30-E型環(huán)境掃描電子顯微鏡(SEM)，荷蘭 Philips公司;DSC-204F1型差示掃描量熱儀(DSC)，德國NETZSCH公司;Anke LXJ-IIB型離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠;DNP-9272型生化培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.3 菌種活化培養(yǎng)、收集

將冷凍干燥的菌劑接入MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)16 h后，將種子液按體積分?jǐn)?shù)1%的量接入到MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h至對數(shù)末期，4 500 r/min離心10 min，用0.01 mol/L的PBS沖洗2次，收集菌泥。

1.4 物料制備

配制保護(hù)劑，按要求將各保護(hù)劑溶解于蒸餾水中，90℃水浴30 min，冷卻后將得到的菌泥重懸于保護(hù)劑中，混合均勻，進(jìn)行噴霧干燥。

1.5 噴霧干燥

1.5.1 保護(hù)劑優(yōu)化

選取脫脂乳、海藻糖、麥芽糊精、谷氨酸鈉、阿拉伯膠、明膠進(jìn)行單因素試驗，并選取保護(hù)效果好的3種保護(hù)劑進(jìn)行3因素3水平正交試驗設(shè)計，得到噴霧干燥復(fù)配保護(hù)劑，噴霧條件為:進(jìn)風(fēng)溫度135℃，物料流量240 mL/h，菌含量(3～5)×109CFU/mL。

1.5.2 噴霧參數(shù)優(yōu)化

選取噴霧干燥可變參數(shù):進(jìn)風(fēng)溫度、物料流量以及菌含量為工藝參數(shù)，以存活率和活菌數(shù)為響應(yīng)因子，設(shè)計3因素3水平CCD響應(yīng)面試驗。

1.6 細(xì)胞膜完整性

利用CFDA和PI對細(xì)胞進(jìn)行雙染，CFDA可以穿透所有細(xì)胞膜，在細(xì)胞內(nèi)酯酶的作用下分解出熒光基團(tuán)，完整的細(xì)胞膜可將熒光基團(tuán)截留在細(xì)胞內(nèi)，在494 nm的激發(fā)光下發(fā)射出綠色熒光，而PI僅能穿透損傷的細(xì)胞膜，與DNA結(jié)合，在535 nm的激發(fā)光下發(fā)射出紅色熒光，通過熒光強度分析細(xì)胞膜受損與未受損細(xì)胞的量。具體操作如下:將噴霧干燥菌劑0.1 g溶于10 mL PBS中，洗滌后于4 500 r/min離心10 min收集菌泥，重懸于PBS中，加入CFDA使其質(zhì)量濃度為20 μg/mL，37℃避光孵育15 min后4 500 r/min離心10 min，用PBS沖洗2次除去多余的 CFDA，再加入PI，使其質(zhì)量濃度為1.2 μg/mL，4℃孵育10 min，沖洗2次除去多余染料，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，收取10 000個菌體分別計算各熒光強度［11-12］，以不添加保護(hù)劑進(jìn)行噴霧干燥的菌劑作為空白對照組。

1.7 環(huán)境掃描電鏡檢測

利用環(huán)境掃描電子顯微鏡(SEM)觀察噴霧干燥后菌劑的微觀形態(tài)，取少量噴霧干燥樣品撒在粘有導(dǎo)電的膠性物質(zhì)樣品臺上，置于電子顯微鏡樣品室中，電壓為10 kV，選擇合適的放大倍數(shù)對樣品進(jìn)行掃描觀察并拍照。

1.8 玻璃化轉(zhuǎn)變溫度

利用差示掃描量熱儀(DSC)測量噴霧干燥后菌劑的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，取10 mg噴霧干燥樣品置于鋁盤中，另取一個空鋁盤作為參照。對樣品進(jìn)行程序升溫，溫度范圍為30℃至180℃，升溫速度為10℃/min。

1.9 存儲穩(wěn)定性

將噴霧干燥菌劑真空密封于鋁箔袋中，存儲于-20、4、25℃環(huán)境下，每隔10 d測定其菌數(shù)變化，共檢測60 d。

1.10 活菌計數(shù)

用MRS固體培養(yǎng)基進(jìn)行平板涂布計數(shù)，將1 mL噴霧前的物料溶于9 mL 0.01 mol/L的PBS中或噴霧后的菌劑0.1 g溶于9.9 mL 0.01 mol/L的PBS中，振蕩混勻、梯度稀釋、涂布。將涂布平板放于37℃恒溫培養(yǎng)48 h后進(jìn)行菌落計數(shù)，單位為CFU/mL或CFU/g。

1.11 數(shù)據(jù)處理

每個實驗重復(fù)3次，正交試驗設(shè)計分析使用Spass20.0軟件，CCD響應(yīng)面采用Design-expert8.0.6設(shè)計分析，響應(yīng)面、DSC曲線及存儲穩(wěn)定性實驗數(shù)據(jù)采用Origin9.0作圖，存儲穩(wěn)定性利用Spass20.0進(jìn)行One-way ANOVA中的Tukey-HSD檢驗(P＜0.01)。

2 結(jié)果與分析

2.1 噴霧干燥結(jié)果

2.1.1 噴霧干燥保護(hù)劑優(yōu)化結(jié)果

脫脂乳、海藻糖、麥芽糊精、谷氨酸鈉、阿拉伯膠、明膠是常用的噴霧干燥保護(hù)劑，圖1為6種保護(hù)劑在不同濃度下對NCU116的保護(hù)效果。由圖1可知，當(dāng)脫脂乳、海藻糖、麥芽糊精、阿拉伯膠、明膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時，各保護(hù)劑的保護(hù)效果最好，NCU116的存活率分別為:43.9%、16.3%、4.6%、10.6%、6.9%;當(dāng)谷氨酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%時，保護(hù)效果最好，菌體存活率為:29.6%。故選取保護(hù)效果較好的保護(hù)劑:脫脂乳、海藻糖、谷氨酸鈉，進(jìn)行正交試驗設(shè)計，選取最佳復(fù)配保護(hù)劑。正交試驗設(shè)計及結(jié)果如表1所示。

圖1 單因素試驗結(jié)果Fig.1 One factor experiment results

表1 正交試驗及結(jié)果Table 1 Orthogonal experiment and results

Carlise［13］認(rèn)為，脫脂乳能通過水取代作用保護(hù)細(xì)胞膜蛋白質(zhì)在高溫過程中不發(fā)生變性。海藻糖是一種二糖，具有較高的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，Jimmy［14］研究認(rèn)為，海藻糖通過水取代作用和玻璃態(tài)機制維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性并降低細(xì)胞膜脂質(zhì)的相轉(zhuǎn)變溫度，從而使細(xì)胞膜在高溫脫水的過程中不發(fā)生相轉(zhuǎn)變而處于流動態(tài)。Sunny［15］研究表明，谷氨酸鈉可以通過抗氧化作用保護(hù)細(xì)胞膜在高溫過程中不被氧化。

有研究表明［16］，保護(hù)劑能大大提高噴霧干燥過程中乳酸菌的存活率，然而，單一保護(hù)劑不能達(dá)到最佳保護(hù)效果，而通過各種保護(hù)劑復(fù)配，可以提高保護(hù)效果，由表1可見，通過保護(hù)劑復(fù)配，可使NCU116的存活率提高20% ～35%，當(dāng)脫脂乳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，海藻糖為5%，谷氨酸鈉為3%時，保護(hù)效果最佳，噴霧干燥后NCU166的存活率達(dá)到69.5%，大大提高了噴霧干燥菌劑的存活率，保護(hù)劑效果:脫脂乳 ＞海藻糖 ＞谷氨酸鈉。

2.1.2 噴霧干燥條件優(yōu)化結(jié)果

噴霧干燥參數(shù)對菌劑的存活率有重要的影響，有研究認(rèn)為，高溫是噴霧過程中造成菌體死亡最重要的原因［17］，因此進(jìn)風(fēng)溫度對乳酸菌的存活率有非常重要的作用;研究表明物料流量和菌含量對乳酸菌的存活率也有重要的影響。響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面及結(jié)果Table 2 Response surface and results

圖2 進(jìn)風(fēng)溫度和物料流量對存活率的影響Fig.2 Response surface plot showing the interaction of inlet temperature and material flow on survival rate of L.plantarum NCU116

圖3 進(jìn)風(fēng)溫度和菌含量對存活率的影響Fig.3 Response surface plot showing the interaction of inlet temperature and microbial contents on survival rate of L.plantarum NCU116

圖4 物料流量和菌含量對存活率的影響Fig.4 Response surface plot showing the interaction of material flow and microbial contents on survival rate of L.plantarum NCU116

圖5 進(jìn)風(fēng)溫度和物料流量對活菌數(shù)的影響Fig.5 Response surface plot showing the interaction of inlet temperature and material flow on viable counts of L.plantarum NCU116

噴霧干燥過程中的高溫會對菌體結(jié)構(gòu)如細(xì)胞膜、核糖體、核酸、蛋白質(zhì)等造成破壞，致使細(xì)胞死亡;通過加大噴霧干燥物料流量，可使單位量的物料受熱減少，降低其中菌體的損傷;當(dāng)增加物料中的菌含量時，保護(hù)劑對菌體的相對保護(hù)作用降低，導(dǎo)致菌體損傷加劇。如圖2～4所示，噴霧干燥菌劑的存活率隨著進(jìn)風(fēng)溫度的升高而降低，隨物料中菌含量的增加，NCU116存活率先增加再降低，隨物料流量的增加而升高。由圖5～7可見，產(chǎn)品的活菌數(shù)隨物料中菌含量和物料流量的增加而增加，隨進(jìn)風(fēng)溫度升高而減少。通過Design-expert軟件分析，得到噴霧干燥的最佳參數(shù)為:進(jìn)風(fēng)溫度125℃，物料流量320 mL/h，菌含量為10.25 lgCFU/mL，經(jīng)過噴霧干燥后，NCU116存活率為89.95%，活菌數(shù)達(dá)到10.96 lgCFU/g，通過驗證，表明實驗值與預(yù)測值相吻合。

圖6 進(jìn)風(fēng)溫度和菌含量對活菌數(shù)的影響Fig.6 Response surface plot showing the interaction of inlet temperature and microbial contents on viable counts of L.plantarum NCU116

圖7 物料流量和菌含量對活菌數(shù)的影響Fig.7 Response surface plot showing the interaction of material flow and microbial contents on viable counts of L.plantarum NCU116

2.2 細(xì)胞膜完整性

研究表明，噴霧干燥過程中的高溫造成的細(xì)胞死亡與細(xì)胞膜的完整性相關(guān)，細(xì)胞膜的損傷造成細(xì)胞內(nèi)容物的外泄，導(dǎo)致細(xì)胞死亡［18］。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果如圖8所示。

如圖8-B所示，不添加保護(hù)劑時，Q4區(qū)域僅有1.12%，Q1區(qū)域為69.80%，表明絕大部分細(xì)胞的細(xì)胞膜在噴霧干燥的過程中受到高溫?fù)p傷;當(dāng)使用復(fù)配保護(hù)劑后，流式細(xì)胞檢測如圖8-C所示，Q4區(qū)域的量顯著增加，達(dá)到49.75%，而Q1區(qū)域的量僅為7.80%，表明復(fù)配保護(hù)劑降低了噴霧干燥過程中高溫對細(xì)胞膜的損傷，復(fù)配保護(hù)劑對菌體的保護(hù)作用明顯。李寶坤［19］研究表明，在冷凍干燥制備乳酸菌菌劑的過程中加入保護(hù)劑后，細(xì)胞膜的損傷明顯減少，這與噴霧干燥制備菌劑的結(jié)果相同，說明無論是噴霧干燥的方式還是以冷凍干燥的方式制備菌劑，選取適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)劑對細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性都有重要的作用。

圖8 流式細(xì)胞圖Fig.8 Flow cytometric fluorescence dot plot

2.3 SEM檢測

如圖9所示，SEM觀察到的微觀結(jié)構(gòu)顯示復(fù)配保護(hù)劑對菌體的包埋效果良好，微粒呈現(xiàn)球形和不同的顆粒大小，由于水分的蒸發(fā)，顆粒表面有典型的凹陷和褶皺，外表面未出現(xiàn)裂紋，這對保護(hù)微球內(nèi)部菌體免受高溫?fù)p傷及防止存儲過程中細(xì)胞膜脂質(zhì)的過氧化有重要的作用，菌劑顆粒大小為10～18 μm。這一結(jié)構(gòu)特性與冷凍干燥制備的菌劑微觀結(jié)構(gòu)有非常明顯的差異，在噴霧干燥過程中霧滴由于高溫的作用使水分迅速蒸發(fā)，使得菌劑的顆粒呈現(xiàn)球形并出現(xiàn)褶皺;在冷凍干燥過程中，水由冰晶直接升華而失去水分，菌劑微觀結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出塊狀并具有許多孔洞［20］，因此冷凍干燥制備的菌劑表現(xiàn)出易吸水的特性，而噴霧干燥制備的菌劑吸水性較弱。

圖9 噴霧干燥菌劑SEM圖Fig.9 SEM pictogram of spray drying starter culture

2.4 玻璃化轉(zhuǎn)變溫度

菌劑在存儲中的穩(wěn)定性與菌劑的狀態(tài)有密切的聯(lián)系，有研究表明，當(dāng)菌劑處于玻璃態(tài)時，分子流動性被抑制，細(xì)胞膜的氧化和化學(xué)反應(yīng)降低，減緩細(xì)胞在存儲過程中的死亡［21］。

圖10為最佳噴霧干燥條件下制備的菌劑的DSC曲線，由曲線可知，噴霧干燥制備的菌劑 Tg為79.50℃，說明在常溫下，菌劑處于玻璃態(tài)，這對保持NCU116菌劑的穩(wěn)定性有非常重要的作用。

圖10 噴霧干燥菌劑DSC掃描圖Fig.10 DSC thermograph of spray drying starter culture

2.5 存儲穩(wěn)定性

高質(zhì)量的菌劑不僅要求得到的產(chǎn)品活菌含量高，還需要在存儲過程中保持活力穩(wěn)定［22］，因而需要找到最佳的存儲條件。圖11為不同溫度條件下，菌劑的活菌數(shù)隨存儲時間的變化。

圖11 不同溫度存儲活菌數(shù)變化Fig.11 Viable counts change in different storage temperature

由圖11可知，在不同溫度下存儲時，菌劑活菌數(shù)變化差異明顯，當(dāng)存儲于-20℃時，菌劑的穩(wěn)定性良好，經(jīng)過60 d，菌數(shù)下降了0.52個對數(shù)值;存儲于4℃時，經(jīng)過60 d，菌數(shù)下降了1個對數(shù)值;在25℃條件下存儲時，菌數(shù)下降明顯，經(jīng)過60 d，活菌數(shù)降低了2.31個對數(shù)值。雖然菌劑在所有存儲溫度下都處于玻璃態(tài)，但不同存儲溫度下的穩(wěn)定性呈現(xiàn)顯著差異(P＜0.01)，表明菌劑的穩(wěn)定性不僅與是否處于玻璃態(tài)有關(guān)，還與存儲溫度有密切的聯(lián)系，處于玻璃態(tài)是確保菌體被固定在玻璃態(tài)基質(zhì)中，更低的溫度對NCU116菌劑保持其穩(wěn)定性也具有非常重要的作用。低溫可以降低酶的活性和減緩化學(xué)反應(yīng)的發(fā)生，這對保持菌劑的穩(wěn)定性有利。Thomas［23］研究發(fā)現(xiàn)，冷凍干燥制備的菌劑存儲穩(wěn)定性也隨著溫度的升高而降低，在4℃存儲60 d后，活菌數(shù)下降了1個對數(shù)值，而在25℃存儲60 d后，活菌數(shù)下降了2個對數(shù)值，這與本文通過噴霧干燥制備的菌劑存儲穩(wěn)定性結(jié)果相近。這一結(jié)果表明通過噴霧干燥制備的菌劑與通過冷凍干燥制備的菌劑在不同溫度下的存儲穩(wěn)定性基本一致。

3 結(jié)論

本文探究了植物乳桿菌NCU116菌劑噴霧干燥制備的最佳工藝條件，最佳保護(hù)劑為:脫脂乳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%、海藻糖為5%，谷氨酸鈉為3%;最佳噴霧條件為:進(jìn)風(fēng)溫度125℃，物料流量320 mL/h，菌含量10.25 lg CFU/mL，此時，噴霧干燥后NCU116存活率為89.95%，活菌數(shù)達(dá)到10.96 lg CFU/g。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測噴霧干燥菌劑的細(xì)胞膜完整性，添加保護(hù)劑后，細(xì)胞膜的損傷顯著降低;在最佳條件下制備的NCU116菌劑微觀形態(tài)、結(jié)構(gòu)良好，在存儲溫度下都處于玻璃態(tài)，但存儲過程中菌劑穩(wěn)定性差異較大，在-20℃存儲時，菌劑穩(wěn)定性較好。本文通過系統(tǒng)研究噴霧干燥制備植物乳桿菌NCU116菌劑的工藝條件及其菌劑特性，并制備出高濃度的植物乳桿菌NCU116菌劑，將為益生菌更廣泛的應(yīng)用及國內(nèi)發(fā)酵劑市場的發(fā)展提供理論支持，對利用噴霧干燥技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)益生菌劑有重要的指導(dǎo)作用。

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