李雅雙，劉杰，包瑛，劉春蘭

1(中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京，100081)2(北京市食品環(huán)境與健康工程技術(shù)研究中心，北京，100081)

近年來，對植物多糖的研究逐漸受到人們的重視。蕪菁(Brassica rapa L.)是我國少數(shù)民族地區(qū)常見的醫(yī)食兩用植物，種子或根為其藥用部分［1］。目前，對蕪菁多糖的研究報道較少。不同品種，不同產(chǎn)地多糖含量的測定結(jié)果顯示，產(chǎn)地可能對糖的代謝產(chǎn)生一定的影響［2］。目前對蕪菁多糖結(jié)構(gòu)研究的報道主要集中在蕪菁多糖的單糖組成分析，對蕪菁多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)一步解析的報道不多。對于蕪菁多糖活性的研究也主要集中在蕪菁粗多糖抗氧化［3］、抗疲勞［4］、抗腫瘤［5］、降血糖［6］、抗癌變等方面的活性。新疆蕪菁多糖的小鼠灌胃降血糖實驗表明，蕪菁多糖的劑量在400 mg/kg體重時，具有明顯的降血糖作用［7］;蕪菁多糖的清除自由基實驗表明，蕪菁多糖及其純化組分具有一定的抗氧化能力和還原能力，且對自由基的清除作用隨濃度的升高增強(qiáng)，具有一定的量效關(guān)系。

研究表明十字花科蔬菜可預(yù)防多種癌癥的發(fā)生，這可能與廣泛存在于十字花科植物中的多糖及硫代葡糖糖苷等化學(xué)成分有關(guān)，如Lewis一致性腫瘤模型對恰瑪古兒多糖體內(nèi)抗腫瘤的初步研究［7］結(jié)果表明，恰瑪古兒多糖高劑量組腫瘤生長抑瘤率為55%，配合環(huán)磷酞胺聯(lián)合用藥組抑瘤率為71%。本文利用化學(xué)、物理、生物學(xué)等方法，研究了十字花科蕪菁水溶性多糖的結(jié)構(gòu)及生物活性。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗材料為十字花科蕓苔屬蕪菁(Brassica rapa L.)的干燥塊根，產(chǎn)于河北廊坊。

1.2 儀器和試劑

UV-Jasco53型紫外分光光度計、GC-2014型毛細(xì)管氣相色譜儀，日本島津;Bruker Avance 600 MHz核磁共振譜儀，德國布魯克;Nicolet Magna-IR 750傅里葉變換紅外光譜儀，日本日立;QQQ7000氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司;BS224S電子天平，德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;HL-2S恒流泵，上海青浦滬西儀器廠;FC-95A餾分自動收集器，上海青浦滬西儀器廠;DCY-12G可調(diào)式氮吹儀，青島?？苾x器有限公司;KDY-9820型凱式定氮儀，北京瑞邦興業(yè);高效液相色譜儀、RI2041視差折光檢測器，德國KNAUER;柱溫箱，天津瑞迪弘欣科貿(mào)有限公司。

鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、果糖、葡萄糖、甘露糖、半乳醛酸糖、半乳糖(BR，上海國藥集團(tuán)產(chǎn)品);氫氧化鈉、乙醇、乙醚、乙酸酐、碳酸鋇、水楊酸、苯酚、三氟乙酸、CaCl2(AR，國藥集團(tuán)產(chǎn)品);正丁醇、H2SO4、甲醇、CHCl3、乙二醇、NaIO4、NaIO3、鄰苯二甲酸、CaCl2、NH3·H2O、H3BO3、HCl(AR，北京化工廠產(chǎn)品);KBH4、甲苯、KI、冰乙酸、P2O5(AR，北京化學(xué)試劑公司產(chǎn)品);吡啶、I2、CuSO4、二氯甲烷、NaHCO3(AR，天津光復(fù)研究所產(chǎn)品);SepharoseCL-4B、DEAE-52、Sepha-dex G-100、Dextran 標(biāo)準(zhǔn)品(BR，MW50 000，20 000，40 000，70 000，100 000和2 000 000)(GE公司Pharmacia產(chǎn)品);透析袋(韓國Biosharp分裝進(jìn)口產(chǎn)品);蛋白酶(德國默克公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 蕪菁水溶性多糖的提取

取經(jīng)乙醇回流脫脂，抽濾、風(fēng)干后的蕪菁粉末100 g，置于燒杯中，加3 000 mL的蒸餾水，80℃熱水浸提2.5 h，抽濾。合并濾液，濃縮至1/3體積，離心、醇沉，沉淀于真空干燥器中干燥得蕪菁粗多糖(WJc)［8］。

1.3.2 蕪菁水溶性多糖的WJdp4-b的制備

將蕪菁粗多糖配成2%的水溶液，經(jīng)淀粉酶、鏈酶蛋白酶和Seveage法聯(lián)合脫蛋白［9］，用pH=2.5的酸性乙醇分級［10］，得 WJdp4級分，取 30 mg WJdp4溶于3 mL超純水，經(jīng)DEAE-52(2.5 cm×60 cm)分離純化，分別用超純水、0.1、0.3、0.5、1.0、2.0 mol/L 的NaCl洗脫，每管收3.0 mL。苯酚-硫酸法顯色，根據(jù)繪洗脫曲線收集，透析，濃縮，干燥。取所收集部分30 mg溶于3 mL 0.1 mol/L的NaCl中繼續(xù)用Sephadex G-100(2.5 cm×60 cm)純化，0.1 mol/L的NaCl洗脫。苯酚硫酸法檢測多糖的分布情況，收集峰形較好的部分，濃縮，透析，加4倍體積的無水乙醇醇沉，常規(guī)干燥得級分WJdp4-b。

1.3.3 蕪菁多糖純度的鑒定、分子質(zhì)量的測定

SephroseCL-4B(1.5 cm×90 cm)柱層析:取5 mg WJdp4-b溶于0.5 mL洗脫液上樣，0.1 mol/L NaCl溶液洗脫，流速0.75 mL/min，每管2 mL收集，苯酚-硫酸法檢測。

以Dextran T-series標(biāo)準(zhǔn)品(分子質(zhì)量為5 000，20 000，40 000，70 000，100 000和2 000 000)及待測純化蕪菁多糖進(jìn)行高效液相檢測。橫坐標(biāo)為各標(biāo)準(zhǔn)糖的保留時間，縱坐標(biāo)為分子質(zhì)量的對數(shù)值，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。計算蕪菁純化多糖的相對分子質(zhì)量。

分別用100%、10%的甲醇和0.1 mol/L NaNO3溶液(所用溶液均過濾膜，超生除氣泡)清洗系統(tǒng)30 min。裝柱，待基線平穩(wěn)后上樣，選擇合適的濃度，用流動相溶解標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品。根據(jù)所獲標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品的分子量。

條件:OHpak SB-805HQ series凝膠柱(分子質(zhì)量﹤4 ×106，8 mm ×300 mm);柱溫，38 ℃;流動相，0.1 mol/L NaNO3;流速，0.8 mL/min;進(jìn)樣量，20 μL。

1.3.4 單糖組成分析

紙層析(PC)確定 WJdp4-b的單糖組成。稱取WJdp4-b1 mg，加入 2 mol/L H2SO41.0 mL，封管，110℃下水解6 h，冷卻后加入BaCO3中和，點樣于層析紙(15 cm×35 cm)上。展開12 h后晾干，反復(fù)3次，均勻的噴上顯色劑，置110℃烘箱內(nèi)加熱10～15 min后顯色。標(biāo)準(zhǔn)糖樣在相同條件下進(jìn)行紙層析。

展開劑:V(乙酸)∶V(正丁醇)∶V(水)=1∶4∶5，待混合相分離后，取上層正丁醇溶液。

顯色劑:苯胺-鄰苯二甲酸正丁醇飽和水溶液。

WJdp4-b進(jìn)行水解、還原、乙酰化處理后進(jìn)行GC分析，測得各組分單糖的組成［11］。色譜條件:Rtx-225毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm);柱溫:100℃→230℃，程序升溫5℃/min，保留時間30 min;載氣:氫氣;線速為48 cm/s，分流比10∶1;檢測器:FID。

1.3.5 結(jié)構(gòu)分析

1.3.5.1 紅外光譜分析及核磁圖譜分析

稱取 1 mg WJdp4-b、10 mg KBr，混合研磨壓片，SPECORD IR 型紅外光譜儀在400～4000 cm-1內(nèi)掃描［12］。

1.3.5.2 部分酸水解

純化后的WJdp4-b25 mg加入0.1 mol/L的TFA 10 mL，100℃水解2 h，氮氣吹干除去TFA，超純水溶解，超純水中透析48 h。袋內(nèi)部分用3倍體積的乙醇醇沉，醇沉部分常規(guī)干燥，上清部分蒸干;袋外部分除去透析液，干燥，待進(jìn)行GC分析［13-15］。

1.3.5.3 高碘酸氧化和Smith降解

準(zhǔn)確稱取25 mg WJdp4-b樣品按［16］進(jìn)行高碘酸氧化、Smith降解，透析，透析后對袋內(nèi)外的產(chǎn)物進(jìn)行GC分析。

1.3.5.4 甲基化分析

真空干燥的WJdp4-b2 mg溶解于二甲基亞砜溶液(60℃減壓蒸餾)中。加入NaOH-DMSO和碘甲烷各0.2 mL［17］，重復(fù)3次，IR檢測無羥基峰為止。

甲基化的糖樣殘渣，進(jìn)行與GC分析相同的水解、還原和乙酰化反應(yīng)，得可氣化的衍生物，待氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)分析。

他進(jìn)入客廳，見臥室門從里面鎖死，便從窗戶爬進(jìn)臥室，發(fā)現(xiàn)薛教授已經(jīng)死在床上。房間內(nèi)一切如常，鎖孔上還插著一把鑰匙。鑰匙上留下的拇指、食指指紋同薛教授的指紋一致，看起來像是他反鎖門后自殺的。

條件:DB-5 column(30 m×0.25 mm×0.25 m)，程序升溫80～200℃(5℃/min)，到215℃(2℃/min)最后升溫到270℃(20℃/min)，保留5 min。

1.4 WJdp4-b的降血糖活性篩選

Balb/c3T3細(xì)胞檢測液洗2次，種于96孔板，37℃、5%CO2孵育一定時間后。加樣品或Insulin(終濃度30nM，陽性對照)，37℃、5%CO2孵育。按葡萄糖氧化酶法進(jìn)行上清中的葡萄糖含量測定，促葡萄糖吸收按下列公式計算。

葡萄糖促吸收率/%=［(空白對照OD405-樣品OD405)/(空白對照OD405-本底OD405)］×100

2 結(jié)果與分析

2.1 蕪菁水溶性多糖的提取及分離純化

蕪菁塊根粉末經(jīng)體積分?jǐn)?shù)95%乙醇回流脫脂、抽濾、揮干溶劑，熱水浸提醇沉得蕪菁水溶性粗多糖WJc。WJc脫淀粉脫蛋白后得WJdp，酸性乙醇分級得WJdp4。

WJdp4經(jīng)DEAE-52(2.5 cm × 90 cm)柱層析，苯酚-硫酸法檢測，收集0.1 mol/L NaCl梯度洗脫部分，將所收集部分經(jīng)Sephadex G-100(2.5 cm×60 cm)柱層析，苯酚-硫酸法檢測，收集，得WJdp4-b。

2.2 蕪菁水溶性多糖的純度鑒定

WJdp4-b經(jīng)Sepharose CL-4B(1.5 cm × 90 cm)柱層析，苯酚-硫酸法檢測得單一對稱峰，HPLC檢測為單一對稱峰(圖1、圖2)。高效液相法測純化多糖的分子質(zhì)量，橫坐標(biāo)為各標(biāo)準(zhǔn)品HPLC的保留時間，縱坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品的分子質(zhì)量對數(shù)，得回歸方程y=-0.713 5x+13.262，R2=0.995 3計算得蕪菁純化多糖WJdp4-b的相對分子質(zhì)量約為10 840。

圖1 WJdp4-b的Sepharose CL-4B柱層析譜圖Fig.1 Chromatogram of WJdp4-bon Sepharose CL-4B

2.3 蕪菁水溶性多糖的組成分析

WJdp4-b經(jīng)PC和GC分析，顯示W(wǎng)Jdp4-b的單糖組成為鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glc)，相對摩爾比為 1.0∶1.0∶10∶9.0(與標(biāo)準(zhǔn)單糖圖比對)。艾克拜爾江·阿巴斯［18］用傳統(tǒng)的水提醇沉方法所獲得的新疆蕪菁多糖經(jīng)DEAE-52柱層析，分得7個組分，各組分多糖的GCMS分析結(jié)果顯示，均由鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、果糖、葡萄糖和核糖6種單糖組成。謝月［19］等蕪將菁塊根中的水溶性多糖進(jìn)行純化分得3個組分，其單糖組成情況為:BRP1-1由阿拉伯糖和葡萄糖組成;BRP2-1由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖組成;BRP3-1由阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖和葡萄糖組成。說明產(chǎn)地可能對蕪菁多糖的單糖組成產(chǎn)生影響。

圖2 WJdp4-b的高效液相凝膠色譜圖Fig.2 HPLC of WJdp4-b

2.4 蕪菁水溶性多糖的結(jié)構(gòu)解析

2.4.1 紅外光譜分析

多糖WJdp4-b在紅外光譜儀400～4 000 cm-1掃描，結(jié)果見圖3。

圖3 WJdp4-b的紅外譜圖Fig.3 IR spectrum of WJdp4-b

3 600～3 200，3 000～2 800和1 400～1 000 cm-1的吸收峰分別代表O-H、C-H伸縮振動和C-H彎曲振動［20］，3 423.10 cm-1代表多糖的O-H伸縮振動吸收峰，2 932.11 cm-1是C-H的伸縮振動吸收峰。1 200～1 000cm-1的吸收峰表明含有吡喃糖環(huán)，WJdp4-b在1 038.84 cm-1處有吸收峰，表明WJdp4-b含有吡喃糖。1 415.54 cm-1為C-O伸縮振動吸收峰［21］，1 617.60 cm-1為結(jié)合水吸收峰［22］。850 cm-1與890 cm-1處分別為α和β型糖苷鍵的吸收峰，根據(jù)所得的紅外圖譜，在850 cm-1與890 cm-1處有吸收峰，說明WJdp4-b含有α和β兩種糖苷鍵［23］。

2.4.2 部分酸水解

部分酸水解的原理是根據(jù)有些多糖的支鏈比多糖的主鏈容易被酸水解［13］，且由呋喃環(huán)連接的糖苷鍵比吡喃環(huán)鏈接的糖苷鍵較容易被酸水解，或者如果多糖鏈中含有糖醛酸或者糖醛酸較密集，也能抵抗酸水解［24］。WJdp4-b經(jīng)部分酸水解后透析，得到袋內(nèi)部分進(jìn)行醇沉，得到上清WJdp4-b-1和醇沉WJdp4-b-2兩部分，以及袋外的部分WJdp4-b-3，將得到的3部分進(jìn)行GC分析(圖4～圖6)，分析結(jié)果見表1。

圖4 部分酸水解上清部分氣相色譜圖Fig.4 GC spectrum of WJdp4-b-1

圖5 部分酸水解醇沉部分氣相色譜圖Fig.5 GC spectrum of WJdp4-b-2

圖6 部分酸水解袋外部分氣相色譜圖Fig.6 GC spectrum of WJdp4-b-3

表1 多糖WJdp4-b部分酸水解Table 1 Partial acid hydrolysis of WJdp4-b

從表1可以看出，袋內(nèi)沉淀部分主要檢測出Man和Glc，所以WJdp4-b在部分酸水解時，Man和Glc幾乎沒有被水解掉，因而從部分酸水解的結(jié)果可以看出，Man和Glc可能位于WJdp4-b的主鏈上。袋外檢測到Rha和 Ara，說明分子的分支部分可能由Rha和Ara組成。

2.4.3 高碘酸氧化和Smith降解

WJdp4-b進(jìn)行高碘酸氧化，經(jīng)紫外光譜在223 nm檢測反應(yīng)完全后，測得每摩爾己糖消耗1.201 1 moL IO4-，大于釋放甲酸量(0.432 2 moL)的2倍，表明其除1→(末端)及1→6糖基外，尚有可被高碘酸氧化但不產(chǎn)生甲酸的 1→2，1→2、6，1→4，1→4、6糖基，可氧化糖基占76.88%，不可氧化糖基占20.12%。

高碘酸氧化后的產(chǎn)物經(jīng)Smith降解，經(jīng)GC分析，測得透析袋內(nèi)含有 Man、Glc，推測 WJdp4-b的 Man、Glc存在不與高碘酸反應(yīng)的鍵型，因此推測Man、Glc含有1→3，1→2、3，1→2、4，1→3、4，1→3、6，1→2、3、4鍵型。

在袋外部分檢出赤蘚醇，表明Man、Glc可能存在1→4，1→4、6 鍵型;檢出甘油，說明 Man、Glc可能存在 1→，1→2，1→6，1→2、6 鍵型，也可能是 Rha、Ara存在吡喃型的1→、1→4鍵型，或呋喃型的1→、1→5 鍵型［27］。

2.4.4 甲基化分析

確定糖苷鍵的位置，對甲基化的多糖WJdp4-b經(jīng)水解、還原、乙?；蟮漠a(chǎn)物作氣相色譜-質(zhì)譜分析，結(jié)果列于表2和圖7。根據(jù)甲基化產(chǎn)物可知WJdp4-b主鏈由Glc構(gòu)成，Glc主要以(1→3)糖苷鍵連接，且在6位處有分支，平均每17個糖殘基有12個分枝，支鏈由Ara、Man、Glc構(gòu)成，連接方式為:Ara以1→4或1→5連接，Man以1→3，1→6連接，Glc以1→4連接;Rha和Glc構(gòu)成了末端。

2.4.5 核磁圖譜分析WJdp4-b

以Bruker Avance 600 MHz核磁共振譜儀檢測，得1H NMR譜圖(圖8)，一般情況下。WJdp4-b在4.6～5.5 ppm 間有 δ4.62、5.01、5.17、5.32 ppm 4 個信號［25］，說明 WJdp4-b由 4 種單糖組成，這與 GC 的分析結(jié)果一致。α型吡喃糖H-1質(zhì)子化學(xué)位移大于4.95 ppm，β型吡喃糖H-1質(zhì)子化學(xué)位移小于4.95 ppm［25］，說明 WJdp4-b存在 α 和 β 兩種糖苷鍵，這與紅外的分析結(jié)果一致。

表2 WJdp4-b甲基化產(chǎn)物GC-MS結(jié)果分析Table 2 Methylation and GC-MS analysis of WJdp4-b

圖7 WJdp4-b甲基化產(chǎn)物GC-MS譜圖Fig.7 GC spectrum of methylated WJdp4-b

圖8 多糖WJdp4-b的1H-NMR圖Fig.8 1H-NMR spectrum of WJdp4-b

由13C NMR譜圖(圖 9)在 95～101ppm有103.39、100.00、99.74、98.56ppm 四個碳信號，小于101 ppm的吸收峰為α型吡喃糖，大于101 ppm的吸收峰為β型吡喃糖［26］，這與紅外和氫譜的分析結(jié)果一致。WJdp4-b的13C NMR譜在δ78.00～85.00 ppm有4個信號分別是 84.39，82.05，81.31，80.25，可以肯定C2、C3、C4中某一個碳上有取代。δ67.00 ～70.00 ppm有2個碳信號，說明6位C發(fā)生取代。84.39 ppm處有碳信號，表明發(fā)生了C3取代。這與高碘酸氧化和Smith降解的結(jié)果一致。WJdp4-b在δ160～180 ppm處無碳信號，說明WJdp4-b中無糖醛酸［27］。

2.5 WJdp4-b的降血糖活性

圖9 多糖WJdp4-b的13C-NMR圖Fig.9 13C-NMR spectrum of WJdp4-b

選擇葡萄糖消耗篩選模型測定WJdp4-b的降血糖情況。WJdp4-b的濃度為30 nmol/L，所測得樣品的葡萄糖促進(jìn)吸收率為46.35%，陽性對照胰島素的促進(jìn)吸收率為57%(胰島素的濃度為30 nmol/L)。WJdp4-b的促進(jìn)吸收率接近于胰島素，說明WJdp4-b對Balb/c3T3細(xì)胞的葡糖消耗有促進(jìn)作用，蕪菁多糖在降血糖方面可能具有胰島素或胰島素生長因子的作用。

3 結(jié)論

蕪菁多糖經(jīng)提取分離純化得均一多糖WJdp4-b，分子質(zhì)量約為10 840，經(jīng)GC、IR、NMR、部分酸水解、高碘酸氧化和 Smith降解、甲基化分析，得多糖WJdp4-b為有分支結(jié)構(gòu)，主鏈主要由Glc的(1→3)糖苷鍵連接，支鏈由Ara、Man、Glc構(gòu)成，其中Ara以1→4或1→5連接，Man以1→3、1→6連接，Glc的1→4的連接構(gòu)成，Rha和Glc構(gòu)成了末端。WJdp4-b是多分支結(jié)構(gòu)復(fù)雜的中性多糖。且降血糖的初步篩選實驗表明，蕪菁多糖具有一定的降血糖活性，但是對于蕪菁降血糖活性的開發(fā)還需要進(jìn)一步的實驗研究。

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