萬會達(dá)，李丹，張玨

1(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇無錫，214122)

2(江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所，江蘇 無錫，214063)

人參皂苷是人參(Panax ginseng)中一類提高免疫力，抗疲勞，抗腫瘤的活性物質(zhì)，目前已經(jīng)分離和鑒定出超過100種的人參皂苷［1-2］。人參皂苷類物質(zhì)均具有17個碳原子排列成4個環(huán)的甾烷類固醇苷元，在苷元上連接不同種類和數(shù)量的糖基，形成具有各種理化性能的人參皂苷。構(gòu)效關(guān)系研究表明，主要人參皂苷(Rb1，Rg1，Re等)的代謝水解產(chǎn)物，通常被稱為次級苷，具有更高的生物利用度和藥理活性。如人參皂苷Rh2為Rg3水解一個葡萄糖基所得的次級苷(式1)，其生物利用度明顯強(qiáng)于Rg3［3］。在自然界中由于次級苷含量稀少，因而已經(jīng)有多種方法用于稀有次級苷的制備，例如化學(xué)法，生物酶催化法，微生物轉(zhuǎn)化法等［4-6］。人參皂苷中多個糖苷鍵均有可能被水解，而生物酶催化法具有高選擇性，反應(yīng)條件簡單溫和等特質(zhì)，成為目前次級苷制備研究的主要方向之一［7-9］。β-半乳糖苷酶(β-D-galactoside galactohydrolase，β-galactosidase，EC 3.2.1.23)是一種常見的 β-糖苷水解酶，可以催化乳糖水解和轉(zhuǎn)苷兩種反應(yīng)，已經(jīng)在食品加工、乳品飲料、生物醫(yī)藥制造等領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用［10-11］。不同來源的 β-糖苷水解酶同時具有多種催化活性，如水解β-半乳糖苷鍵、β-葡萄糖苷鍵、β-果糖苷鍵等。此外，大多數(shù)人參皂苷水溶性差，如Rg3在水中幾乎不溶(＜0.02 mg/mL)，成為制約水相酶催化制備次級苷的“瓶頸”?；瘜W(xué)修飾可以提高人參皂苷的溶解性，但分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化;加入甲醇等有機(jī)溶劑助溶無疑會導(dǎo)致酶失活。羥丙基-β-環(huán)糊精(hydroxypropyl-β-cyclodextrin，HP-β-CD)包合法能夠提高包括人參皂苷在內(nèi)的多種疏水性物質(zhì)的溶解度，且無毒副作用，已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)可以用于食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域中［12-13］。本文嘗試先包合Rg3，后以來源于Aspergillus sp.的β-半乳糖苷酶催化水解的方法制備Rh2，初探了加酶量、反應(yīng)時間、底物對水解反應(yīng)的影響(式1)。

式1 β-半乳糖苷酶選擇性催化水解Rg3制備Rh2Scheme 1 Transformation pathway from ginsenoside Rg3 to Rh2 using β-galactosidase

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

β-半乳糖苷酶(來源于Aspergillus sp.)由江南大學(xué)吳敬教授課題組提供;人參皂苷 Rg3-30粗品(30%，HPLC)由撫松縣大自然生物有限公司惠贈;人參皂苷Rg3-90(S型，≥90%，HPLC)，人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)物Rg3-98和Rh2-98(S型，≥98%，HPLC)購于江蘇澤朗生物醫(yī)藥有限公司;羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD，1 522.6 g/mol)購于山東淄博千匯生物科技有限公司;鄰硝基苯酚(oNP，99%)和對硝基苯酚(pNP，99%GC)購于上海晶純生化科技股份有限公司;對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG，98%)，鄰硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(oNPG，99%)，購于上海寶曼生物科技有限公司;乙腈(色譜純)，購于美國J.T.Baker公司;其他化學(xué)試劑(AR)購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

紫外可見分光光度計(T6新世紀(jì))，北京普析通用儀器有限公司;往復(fù)式水浴搖床(HZ-8812S-B)，太倉市華利達(dá)實驗設(shè)備有限公司;超級恒溫水槽(DKB-501A)，上海森信實驗儀器有限公司;液相色譜儀(2695，二極管陣列檢測器996)和液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI SYNAPT QTof MS)，美國Waters公司;場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM，S-4800)，日立公司。

1.2 方法

1.2.1 β-半乳糖苷酶酶活測定

oNPG水解酶活測定:依次在5 mL離心管中加入1.8 mL醋酸緩沖液(pH 4.6);再加入100 μL稀釋數(shù)倍的酶液(空白不加酶)，37℃下預(yù)熱10 min，加入oNPG(20 mmol/L)底物100 μL，計時反應(yīng)10 min;加入1 mL Na2CO3(1 mol/L)終止反應(yīng);在420 nm處測定其吸光度，根據(jù)鄰硝基苯酚oNP標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.229 2×OD值，R2=0.999 2)計算酶活。

pNPG水解酶活測定:依次在5 mL離心管中加入1.8 mL醋酸緩沖液(pH 4.6);再加入100 μL稀釋數(shù)倍的酶液(空白不加酶)，37℃下預(yù)熱10 min，加入pNPG(20 mmol/L)底物100 μL，計時反應(yīng)10 min;加入1 mL Na2CO3(1 mol/L)終止反應(yīng);在405 nm處測定其吸光度，根據(jù)對硝基苯酚pNP標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.058 3×OD值，R2=0.999 8)計算酶活。

酶活(U)定義為:在上述反應(yīng)條件下每分鐘生成1 μmol oNP或pNP所需要的酶量(g)。

1.2.2 Rg3 相溶解度曲線［14］

根據(jù)Higuchi和Connors提出的相溶解度法測定Rg3的相溶解度曲線:配制不同濃度的HP-β-CD水溶液，分別加入過量的Rg3-98，然后在一定溫度下(45℃，55℃或65℃)充分振蕩平衡24 h;離心取上清液，HPLC外標(biāo)法測定Rg3的濃度;以HP-β-CD濃度為橫坐標(biāo)，Rg3濃度為縱坐標(biāo)，繪制相溶解度圖，根據(jù)相溶解度曲線的回歸方程可得曲線的斜率。

1.2.3 Rg3 包合物制備［15］

配制HP-β-CD(200 mg/mL)水溶液，60℃下恒溫;將20 mg/mL Rg3-90逐滴加入到 HP-β-CD溶液中;持續(xù)攪拌2 h后再在25℃下攪拌3 h;在70℃下真空干燥即可得Rg3包合物。計算Rg3的回收率和包合率。同樣方法制備Rg3-30粗品的包合物。

1.2.4 包合物表征

場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察包合前后樣品的形貌，加速電壓1.0 kV，真空狀態(tài)下噴金1 min;HPLC含量測定:Waters 2695，二極管陣列檢測器(waters 996)，檢測波長 205 nm;C18柱(Lichrospher C18，4.6 mm×250 mm，5 μm);梯度洗脫75%乙腈水溶液(0 min)到50%乙腈水溶液(25 min);流速1 mL/min。

1.2.5 β-半乳糖苷酶催化水解Rg3水解反應(yīng)

配制25 mg/mL的Rg3-90包合物溶液，在60℃下恒溫0.5 h;加入來源于Aspergillus sp.的β-半乳糖苷酶(250 U/g Rg3，500 U/g Rg3)并計時反應(yīng)，定時取樣進(jìn)行HPLC分析;反應(yīng)結(jié)束后，對反應(yīng)液進(jìn)行LC-MS分析:色譜條件為BEH HILIC色譜柱，柱溫為30℃，流速為0.3 mL/min，梯度洗脫30%乙腈水溶液(0 min)，100%乙腈水溶液(11～13 min)，30%乙腈水溶液(13.1 min)，進(jìn)樣量1 μL，進(jìn)樣濃度為1 mg/mL;質(zhì)譜條件為碰撞電壓6 eV;離子化方式電噴霧電離(ESI)，負(fù)離子檢測模式，分子質(zhì)量范圍200～2 000)。

以Rg3-30為底物時，包合物濃度為100 mg/mL，其他條件同上。

2 結(jié)果與討論

2.1 Rg3包合物的制備

來源于Aspergillus sp.的β-半乳糖苷酶直接催化水解Rg3時，未檢測出有產(chǎn)物生成，推測是由于Rg3在水中的溶解度低導(dǎo)致，25℃時僅為0.017 mg/mL;雖然甲醇能助溶，但β-半乳糖苷酶失活，仍無產(chǎn)物生成。所以首先采用包合法提高Rg3溶解度，然后再進(jìn)行水相酶催化反應(yīng)。選用的包合劑為HP-β-CD，Rg3包合物收率為88.2%，Rg3含量為2.45%。圖1a為Rg3的掃描電鏡圖;由圖1b和圖1d可知HP-β-CD具有球狀孔隙結(jié)構(gòu)，Rg3包合之后呈現(xiàn)較大的片狀結(jié)構(gòu)，均不同包合之前的形貌;圖1c為二者物理混合物(水溶性并沒有明顯提高)的SEM，HP-β-CD的球狀孔隙結(jié)構(gòu)仍然存在，因而推測Rg3包合物已經(jīng)制備得到。

25℃下的溶解度實驗表明包合后，Rg3在水中的溶解度至少提高74.6倍，達(dá)到1.2 mg/mL。根據(jù)Higuchi和Connors提出的相溶解度法測定Rg3的相溶解度曲線，隨HP-β-CD濃度增加，被包合的Rg3濃度也成線性增加(圖2)。根據(jù)分類，可知Rg3的包合類型屬于典型的AL型，并且Rg3與HP-β-CD之間形成了1∶1的包合物。

圖1 Rg3(a)，HP-β-CD(b)，HP-β-CD/Rg3 物理混合物(50∶1 w/w)(c)，Rg3/HP-β-CD 包合物(d)的 SEMFig.1 SEM micrographs of Rg3(a)，HP-β-CD(b)，HP-β-CD and Rg3 physical mixture(50∶1 mass ratio)(c)and Rg3/HP-β-CD complex(d)

圖2 Rg3的相溶解度曲線Fig.2 Phase solubility curve of Rg3

2.2 來源于Aspergillus sp.的β-半乳糖苷酶催化水解Rg3

測得來源于 Aspergillus sp.的 β-半乳糖苷酶的oNPG水解酶活為14 U/g，而pNPG水解酶活為6 540 U/g。以Rg3-90包合物為底物，考查β-半乳糖苷酶催化Rg3水解的反應(yīng)。由圖3可知只有一個產(chǎn)物生成，并且其與Rh2-98標(biāo)準(zhǔn)物的保留時間相同，結(jié)合質(zhì)譜信息(m/z:829.6，［MRg3+COOH］-;m/z:783.6，［MRg3-H］-;m/z:667.5，［MRh2+COOH］-)，確定產(chǎn)物為Rh2。說明HP-β-CD包合并未阻斷水解反應(yīng)，來源于Aspergillus sp.的β-半乳糖苷酶能夠選擇性催化水解Rg3中的β-1，2糖苷鍵，不會進(jìn)一步水解水解苷元與槐糖基之間的糖苷鍵而得到原人參二醇。

圖3 Rg3水解過程取樣的LC-MSFig.3 LC-MS profiles of Rg3 hydrolysis reaction

60℃下考查加酶量和反應(yīng)時間對水解反應(yīng)的影響，加酶量按照oNPG水解酶活加入，Rg3-90包合物濃度為25 mg/mL。由圖4可知，反應(yīng)24 h左右達(dá)到平衡。當(dāng)加酶量提高1倍，初始反應(yīng)速率加快，并且Rg3轉(zhuǎn)化率和Rh2產(chǎn)率均提高1.6倍，Rg3的轉(zhuǎn)化率達(dá)90.6%，Rh2的產(chǎn)率為88.5%。文獻(xiàn)報道來源于Fusarium proliferatum ECU2042的β-葡萄糖苷酶(Rg3的轉(zhuǎn)化率為60%)和來源于 Esteya vermicola CNU 120806的粗酶液(Rg3的轉(zhuǎn)化率為90%，未提及產(chǎn)率)同樣可以催化Rg3變成Rh2，但生物酶來源不常見，且忽視Rg3的溶解性問題［16-17］。

圖4 β-半乳糖苷酶催化水解Rg3-90的進(jìn)程Fig.4 Time course of enzymatic transformation of Rg3

市售Rg3純度不高，還含有多種人參皂苷。選取Rg3-30粗品，同樣先包合后在60℃下β-半乳糖苷酶催化Rg3-30包合物(100 mg/mL)水解。經(jīng)包合后，Rg3-30溶解度提高了65倍，說明除Rg3以外的人參皂苷也可以與HP-β-CD發(fā)生包合。由圖5可知，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC，Rg3(16.87 min)水解生成Rh2(23.12 min)，反應(yīng)后期Rh2會以沉淀形式析出(圖5e)。此外還發(fā)現(xiàn)18.96 min和19.21 min對應(yīng)的人參皂苷未知物未發(fā)生變化，19.96 min和20.39 min對應(yīng)的人參皂苷未知物反應(yīng)前后峰面積減少，說明在β-半乳糖苷酶作用下也發(fā)生了反應(yīng)。因此需要進(jìn)一步以高純度人參皂苷為底物并結(jié)合各種表征手段，繼續(xù)考查來源于Aspergillus sp.的β-半乳糖苷酶催化水解制備其他次級苷的性能。

圖5 β-半乳糖苷酶催化水解Rg3-30的HPLCFig.5 HPLC profiles of Rg3-30 hydrolysis reaction

3 結(jié)論

本文先用羥丙基-β-環(huán)糊精包合Rg3，Rg3在水中的溶解度提高了74.6倍，包合屬于AL型，形成1∶1的包合物。然后以Rg3包合物為底物，初探了來源于Aspergillus sp.的 β-半乳糖苷酶催化水解制備Rh2。當(dāng)加酶量為500 U/g Rg3，60℃下反應(yīng)24 h，Rg3的轉(zhuǎn)化率達(dá)90.6%，Rh2的產(chǎn)率為88.5%。本文提供了一種新的高效制備Rh2的方法。

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