吳滿珍，李鵬越，蘇珂，徐國強，蔣伶活

1(江南大學糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇無錫，214122)

2(江南大學工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫，214122)

3(江南大學生物工程學院，江蘇無錫，214122)

作為TCA循環(huán)的中間產(chǎn)物，蘋果酸、延胡索酸和琥珀酸等C4二元羧酸廣泛應用于食品、醫(yī)藥和化工等產(chǎn)業(yè)。鑒于C4二元羧酸重要的應用價值及潛在的應用前景，2004年，美國能源部專門成立了C4二元羧酸研究組研究這些有機酸的生產(chǎn)工藝和應用［1］。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)C4二元羧酸因具有原料可再生、生產(chǎn)工藝對環(huán)境污染小等優(yōu)勢而備受關(guān)注［2-5］。釀酒酵母具有:(1)營養(yǎng)需求簡單，下游分離工藝成本低廉;(2)能耐受較低pH條件及高濃度底物產(chǎn)生的滲透壓;(3)長期用于食品和釀造等領(lǐng)域，并通過FDA認證，發(fā)酵產(chǎn)品具有安全性;(4)遺傳信息豐富，代謝改造操作簡便［6］。因此，這種微生物被認為是生產(chǎn)C4二元羧酸的潛在最適微生物。

在高糖濃度及有氧條件下，釀酒酵母會產(chǎn)生大量的乙醇，這種現(xiàn)象被稱為反巴斯德效應(也稱為克勒勃屈利效應)［7］。然而，對于以C4二元羧酸目標產(chǎn)物來說，乙醇的大量產(chǎn)生會導致碳代謝流和輔助因子的損失。因此，如何減少乙醇或消除乙醇的產(chǎn)生，成為釀酒酵母生產(chǎn)C4二元羧酸等羧酸所面臨的共同難題［8］。釀酒酵母乙醇合成途徑主要涉及到丙酮酸脫羧酶(pyruvate decarboxylase，Pdc)和乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase，Adh)，Pdc 主要有 PDC1，PDC5，PDC6 三個基因編碼，Adh由 ADH1，ADH2，ADH3，ADH4，ADH5，ADH6 等基因編碼，其中，ADH1編碼的產(chǎn)物的作用是將乙醛轉(zhuǎn)化為乙醇［9］。圍繞上述兩個關(guān)鍵酶及其輔因子，減少或消除乙醇形成的主要策略及進展如下:(1)缺失丙酮酸脫羧酶，通過同時敲除PDC1，PDC5，PDC6三個基因，完全阻止了乙醇的產(chǎn)生，但菌株不能以葡萄糖為唯一碳源進行分批發(fā)酵［10-11］;(2)缺失乙醇脫氫酶，通過同時敲除ADH1，ADH2，ADH3，ADH4，ADH5，ADH6 同樣可以完全阻止乙醇的產(chǎn)生，但這種策略會引起甘油和乙醛的積累，從而導致菌體生長較弱［12-13］;(3)調(diào)控輔因子水平，硫胺酸是Pdc的輔因子，而THI2和THI3是硫胺素合成途徑的調(diào)控基因，敲除THI2或THI3均降低了Pdc的酶活，進而減少了乙醇的生成［14］，但硫胺酸也是α-酮戊二酸脫氫酶的輔因子，因此，敲除THI2或THI3不利于通過氧化TCA途徑積累C4二元羧酸。此外，Tokuhiro等用來源于牛的乳酸脫氫酶基因L-ldh分別替換PDC1和ADH1兩個基因，既實現(xiàn)了同時弱化Pdc和Adh的活性，又實現(xiàn)了外源乳酸脫氫酶在釀酒酵母中的表達，獲得的工程菌株乙醇產(chǎn)量大幅下降，乳酸產(chǎn)量大幅上升［15］。而通過單純敲除PDC1和ADH1兩個基因來同時弱化Pdc和Adh的活性，進而減少乙醇形成未見報道。

鑒于此，本研究嘗試通過敲除PDC1和ADH1兩個基因來同時弱化Pdc和Adh的活性，實現(xiàn)減少乙醇形成的目的。在此基礎(chǔ)上，通過發(fā)酵優(yōu)化提高雙基因缺失突變株的生長特性，以期實現(xiàn)減少乙醇的形成。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

釀酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C、敲除模板質(zhì)粒pUG27、標記回收質(zhì)粒pSH47及PCR引物相關(guān)信息見表1。

表1 本研究所用的菌株、質(zhì)粒、引物Table 1 Lists of S.cerevisiae strains，plasmids and primers used in this study

1.1.2 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨20(固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉20)，pH自然，121℃滅菌20 min。

SD-HIS培養(yǎng)基(g/L):酵母氮源 1.7，(NH4)2SO45，葡萄糖 20，氨基酸 mix 5.9，亮氨酸0.1，尿嘧啶0.02(固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉20)，pH自然，121℃滅菌 20 min。

SD-URA培養(yǎng)基(g/L):酵母氮源 1.7，(NH4)2SO45，葡萄糖 20，氨基酸 mix 5.9，亮氨酸0.1，組氨酸0.02(固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉20)，pH自然，121℃滅菌 20 min。

種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 40，YNB 3.4，(NH4)2SO45，氨基酸 mix 5.9，亮氨酸 0.1，組氨酸0.02，尿嘧啶0.02。裝液量20 mL/100 mL。115℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 40，YNB 3.4，(NH4)2SO45，氨基酸 mix 5.9，亮氨酸 0.1，組氨酸0.02，尿嘧啶0.02。添加CaCO35 g/L，裝液量為40 mL/250 mL。CaCO3單獨滅菌后加入。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法［16］

從-80℃菌種保藏管取菌在YPD(含營養(yǎng)標記質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子在對應的SD缺陷培養(yǎng)基)平板上進行劃線活化，30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h;挑取活化的單菌落接種到種子培養(yǎng)基中，30℃、220 r/min搖床培養(yǎng)24 h至飽和;測定每個菌株的OD600值，以起始OD=0.2轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、220 r/min搖床培養(yǎng)發(fā)酵96 h。

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 生物量測定

取不同時間點的發(fā)酵液 0.1 mL，用 0.4 mol/L的鹽酸除掉發(fā)酵液中的碳酸鈣，并稀釋適當?shù)谋稊?shù)，振蕩混勻。待溶液澄清后，以稀鹽酸為空白，在600 nm波長處測定吸光值，以測得的OD值作為菌體生物量計量單位。

1.2.2.2 代謝物分析

HPLC檢測代謝物:HPLC儀器為Waters 1515，葡萄糖、乙醇用RID檢測器，丙酮酸用紫外檢測器。色譜柱為Aminex HPX-87H，流動相為0.0275%(v/v)H2SO4，流速 0.6 mL/min。

1.2.3 酶活測定

粗酶提取:4℃，8 000 r/min離心1 min收集菌體，去上清液;用預冷雙蒸水重懸菌體，并于離心后去掉上清液;加入與菌體等量并預冷的蛋白提取緩沖液PEB，PEB中再加入100×PMSF;加入與菌體體積差不多量的玻璃珠;在振蕩混合器上振蕩EP管10次，每次30 s，每次振蕩后放冰上1 min;12 000 r/min離心10 min，取上清即蛋白液放于冰上保存。

丙酮酸脫羧酶:向比色皿中依次加入40 mmol/L咪唑鹽酸0.4 mL、1.5 mmol/L NADH 0.1 mL、880 U/mL乙醇脫氫酶0.1 mL、50 mmol/L MgCl20.1 mL、500 mmol/L丙酮酸鉀0.1 mL、細胞破碎上清液0.1 mL(對照加0.1 mL的咪唑鹽酸)，測定340 nm處吸光度變化。反應起始于丙酮酸鉀的加入，在30℃，pH 8.0條件下，每分鐘能夠催化1 μg分子的輔酶 I的酶量為1個酶活單位。乙醇脫氫酶:吸取0.06 mol/L焦磷酸鈉溶液0.5 mL、3 mol/L乙醇溶液0.1 mL、0.005 mol/L NAD 溶液 0.1 mL、蒸餾水 2.2 mL置于石英比色杯中(容量4 mL)，加入已稀釋的樣液或酶制劑1 mL，立即混勻，測定A340，以后每隔15 s測1次，直至A340不變，記下反應時間和A340讀數(shù)。于另一石英比色杯中，以蒸餾水代替底物，作空白試驗。每分鐘A340增加0.001為1個活力單位。

1.2.4 基因敲除［16］

以質(zhì)粒pUG27為模板，利用引物F和R(表1)進行 PCR擴增，PCR條件為95℃ 5 min;9℃ 30 s;55℃ 30 s，72℃ 1.5 min，30 個循環(huán);72℃ 延伸 10 min。獲得的 PCR產(chǎn)物即為敲除盒，它含有His標記，loxP位點和PDC1(ADH1)基因同源的序列。然后利用LiAc轉(zhuǎn)化法將敲除盒直接轉(zhuǎn)化到S.cerevisiae CEN.PK2-1C，涂布在SD-His平板上，培養(yǎng)3～5 d。長出的單菌落劃線純化后接入SD-His液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)后提取基因組，PCR驗證確定為陽性菌落。將用以消除標記的Cre表達質(zhì)粒pSH47轉(zhuǎn)化到酵母陽性轉(zhuǎn)化子中，切除標記后，并將 pSH47移除，最終獲得陽性轉(zhuǎn)化子。

2 結(jié)果與討論

2.1 PDC1和ADH1雙基因缺失對菌體生長及耗糖的影響

考察了PDC1單獨缺失及PDC1和ADH1雙基因缺失對釀酒酵母細胞生長及耗糖的影響，結(jié)果如圖1所示。PDC1單獨缺失對菌體生長影響很小，但減弱了葡萄糖的消耗能力;PDC1和ADH1雙基因缺失后，發(fā)酵進行到36 h時，酵母細胞的生物量為2.64±0.16 OD600，較野生型菌株下降了75.3%。此時，雙基因缺失突變株葡萄糖消耗了22.9±1.9 g/L，對照菌消耗了62.5±0.6 g/L。說明PDC1和ADH1缺失后，在現(xiàn)有的發(fā)酵條件下，菌體生長和耗糖較弱。

圖1 野生型菌株與基因缺失株菌株生物量及葡萄糖消耗Fig.1 Growth(a)and glucose consumption(b)of the wild type，the pdc1 mutant and the pdc1adh1 mutant(Fermentation medium contains 100 g/L glucose)

2.2 PDC1和ADH1基因缺失對Pdc和Adh酶活的影響

考察了PDC1和ADH1基因缺失對Pdc和Adh酶活的影響，研究結(jié)果如圖2所示。在野生型菌株中，從24 h到48 h，Pdc酶活逐步增加，但是到第60 h又減少，48 h為最大值達到0.28 U/mg。而pdc1缺失株中，Pdc酶活從24 h至60 h都是逐步減少的，相同時間點酶活與野生型菌株相比顯著減少，48 h時的Pdc酶活僅有0.12 U/mg，與野生型菌株相比，減少了57.1%。同樣，無論在野生型菌株還是缺失株中，Adh酶活都是先增加后減少，在48 h達到最大值，其中野生型菌株Adh酶活達0.58 U/mg，缺失株為0.36 U/mg，而在相同時間點缺失株較野生型菌株相比 Adh酶活都減少，48 h、60 h相差顯著，說明ADH1基因缺失導致酶活降低，其中在48 h顯著降低40%。

圖2 丙酮酸脫羧酶以及乙醇脫氫酶酶活Fig.2 The specific activities of Pdc and Adh in the pdc1 mutant(a)and the pdc1adh1 mutant(b)

由圖1和圖2可知，PDC1單獨缺失對菌體Pdc酶活及菌的生長情況與文獻報道的結(jié)果基本一致［17］。PDC1和 ADH1基因的缺失，導致了 Pdc和Adh酶活的下降，進而影響了菌體生長和葡萄糖的消耗。NADH主要由胞質(zhì)里的糖酵解途徑等產(chǎn)生，在好氧條件下，釀酒酵母對葡萄糖的吸收速率超過一定的閾值時，NADH產(chǎn)生的速率就會超過其被氧化的速率，導致釀酒酵母通過溢流代謝合成乙醇［7］。Adh1p作用是將乙醛轉(zhuǎn)化為乙醇，同時將 NADH轉(zhuǎn)化為NAD+，因此，ADH1的敲除，會影響到葡萄糖的代謝，進而影響到菌體的生長。

2.3 發(fā)酵優(yōu)化提高菌體生物量

敲除基因PDC1和ADH1后，菌株生長較弱。為了提高菌體生物量，考察了葡萄糖濃度、C/N以及溶氧對雙基因缺失菌株生長的影響。重點比較了24 h和48 h的生長情況，結(jié)果如圖3所示。與高糖濃度相比，40 g/L葡萄糖對生長最有利，在48 h菌體生物量(OD600)達到 3.8，較 100 g/L葡萄糖提高了107.7%。當葡萄糖含量為40 g/L時，考察了不同氮源濃度及C/N對菌體生長的影響。研究發(fā)現(xiàn)，氮源為3.4 g/L YNB和5 g/L(NH4)2SO4對生長最有利，48 h時，菌體生物量(OD600)達到6.5，較對照提高了70.3%。此外，溶氧水平也能顯著地影響缺失株的生長，此實驗通過裝液量來實現(xiàn)?？疾炝?0 mL、80 mL、100 mL的裝液量對菌株的影響，研究發(fā)現(xiàn)，裝液量為40 mL時，雙基因缺失株的菌體生物量(OD600)達到了9.1，與對照(100 mL)相比，提高了49.2%。綜上，本研究通過優(yōu)化葡萄糖濃度、氮源濃度及C/N、溶氧水平，實現(xiàn)了菌體生物量(OD600)從最開始的1.8±0.15達到優(yōu)化后的9.1±0.45，提高了4倍，接近于野生型菌株的最大菌體生物量。

圖3 pdc1adh1菌株生物量優(yōu)化Fig.3 Growth optimization of the pdc1adh1 mutant

在本研究中，通過研究葡萄糖濃度、氮源濃度及C/N及溶氧水平對菌體生長的影響。實際上，PDC1和ADH1的缺失影響了葡萄糖的代謝，進而影響到菌體的生長。提高通風水平，可以明顯促進菌體生長，這個現(xiàn)象與Tokuhiro的研究結(jié)果(提高攪拌轉(zhuǎn)速，可以提高葡萄糖的消耗速率及菌體生物量)是一致的［15］。這是因為氧是電子受體，提高氧的供應，可以促進NAD+的再生，進而促進葡萄糖的代謝。

2.4 發(fā)酵特性研究

在上述最佳培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件下，考察了野生型菌株和雙基因缺失菌株的發(fā)酵特性。如圖4所示，雙基因缺失菌株的菌體生長弱于野生型菌株，但發(fā)酵進行到48 h后，最大生物量接近于野生型菌株;雙基因缺失菌株的葡萄糖的消耗速率也低于野生型菌株，發(fā)酵進行到48 h時，葡萄糖消耗完;野生型菌株乙醇產(chǎn)量在36 h時達到最大值，為5.8 g/L，而雙基因缺失菌株的乙醇產(chǎn)量在48 h達到最大值，為2.1 g/L，較野生型菌株下降了63.8%;野生型菌株幾乎不積累丙酮酸，而雙基因缺失菌株的丙酮酸產(chǎn)量在48 h達到最大值，為2.0 g/L。由此可見，在優(yōu)化后的發(fā)酵條件下，雙基因缺失菌株的菌體生長和葡萄糖消耗情況與野生型菌株接近。同時，通往乙醇的碳流大大減少，部分碳流以丙酮酸的形式積累，為目標產(chǎn)物C4二元羧酸的生產(chǎn)提供了前體物。

圖4 CEN.PK2-1C以及pdc1adh1缺失株發(fā)酵特性Fig.4 Fermentation profiles of the wild type and the pdc1adh1 mutant during batch culture under optimal growth conditions

3 結(jié)論

同時敲除基因PDC1和ADH1，可以弱化乙醇合成途徑中兩個關(guān)鍵酶Pdc和Adh兩個關(guān)鍵酶的活性，但導致菌體生長較弱;通過培養(yǎng)基優(yōu)化及培養(yǎng)條件優(yōu)化，確定了最優(yōu)的培養(yǎng)基組成為:葡萄糖40 g/L，YNB 3.4 g/L，(NH4)2SO45 g/L。最佳裝液量為40 mL/250 mL。在此發(fā)酵條件下，菌體最大生物量與對照菌株接近，發(fā)酵48 h時，最大乙醇產(chǎn)量為2.1 g/L，較野生型菌株最大乙醇產(chǎn)量下降了63.8%，丙酮酸產(chǎn)量為 2.0 g/L。因此，通過敲除基因 PDC1和ADH1，可以同時弱化Pdc和Adh兩個關(guān)鍵酶的活性，進而有效減少乙醇的形成，促進丙酮酸的積累，為研究減少副產(chǎn)物乙醇形成，促進C4二元羧酸形成提供了一個可供選擇的策略。

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