鄒湘月，李飛鳴，邵元元，宋南平，張仟，顏新培(湖南省蠶桑科學(xué)研究所，湖南長沙410127)

桑葉(Mulberry Leaf)史載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，藥用歷史悠久。1993年它被列入國家衛(wèi)生部藥食兩用品種目錄。新版《中國藥典》［1］收錄它為主治風(fēng)熱感冒、肺熱燥咳之要藥。桑葉含多種功能性成分。1-脫氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin，DNJ)為主要的功能活性物質(zhì)之一?，F(xiàn)代藥理研究證明，DNJ對小腸中的α-葡糖苷酶活性具有強(qiáng)競爭性抑制作用和抗腫瘤、抗病毒等藥理活性［2-4］，成為蠶桑綜合利用的一個(gè)研究熱點(diǎn)。筆者疏理了關(guān)于桑葉DNJ的相關(guān)研究成果，為后期有效獲得高含量、高純度的1-脫氧野尻霉素及開發(fā)利用桑葉提供參考。

1 影響DNJ含量的相關(guān)因素

自Yagi等［5］首次從桑根皮中分離得到DNJ以來，桑樹一直都是其最主要的植物來源。DNJ廣泛存在于桑樹的各組織中，以葉片最多，但其含量易受到桑樹品種、產(chǎn)地、采摘時(shí)期、部位、生長環(huán)境和施肥情況等因素的影響而呈現(xiàn)較大的含量差別。李有貴等［6］對來自云南不同地區(qū)的59份野生桑桑葉中DNJ含量進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)開遠(yuǎn)地區(qū)的巖桑桑葉中DNJ含量高達(dá)0．791 1%，是目前報(bào)道的DNJ含量最高的桑樹資源。大量研究和實(shí)踐證明，由于氣溫高和雨水、光線充足，7、8月份桑葉中DNJ含量明顯高于10月和11月，尤其在相對成熟的夏季桑葉中DNJ含量最高［7-8］，而在相同條件下DNJ含量隨葉位由上到下遞減，依次為嫩芽＞嫩葉＞成熟葉＞老葉［9］。目前，許多研究人員分析了桑樹生長條件對DNJ植物源的影響程度。殷浩等［10］研究表明，遮陰處理能顯著增加桑苗葉片中DNJ含量，且隨著遮陰程度的增加其含量明顯升高的結(jié)論。劉剛等［9］認(rèn)為，氮肥、磷肥、鉀肥的施肥水平及其配比均能顯著影響DNJ含量，并推薦了最優(yōu)的生產(chǎn)施肥指標(biāo)。另外，DNJ可直接從特定植物如鴨跖草［11］、風(fēng)信子［12］和萬年青［13］等和家蠶、桑蟥、桑螟等昆蟲［14］中提取獲得，其中家蠶對DNJ有較好的富集作用。Asano等［15］報(bào)道，蠶體中DNJ含量是桑葉中的2．7倍。此外，在有關(guān)化學(xué)合成研究方面，F(xiàn)rommer等［16-17］以芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌為初始菌株，通過優(yōu)化發(fā)酵條件獲得富含功能因子DNJ的發(fā)酵液，但該方法由于存在合成路線長、技術(shù)要求高、DNJ產(chǎn)量偏低等問題暫無法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)［18］。

2 影響DNJ得率的相關(guān)因素

2．1 DNJ的提取 上述影響因素的不同導(dǎo)致桑葉中DNJ含量的差別，因此針對某種桑葉樣品的提取檢測方法具有選擇性和特異性。植物源DNJ的含量偏低，且其他次生代謝干擾物的存在增加了提取技術(shù)的難度。目前，這一技術(shù)仍在不斷的改進(jìn)和完善中。

水提取法是提取DNJ的初級方法，簡單且重現(xiàn)性好，但提取液中水溶性雜質(zhì)較多，分離效果欠佳。酸提取法是目前被廣泛使用的方法，DNJ得率明顯高于水提取法。蔣小飛等［19］采用正交試驗(yàn)，得出最佳提取工藝為:提取液酸度0．2%，料液比 1∶5，提取時(shí)間 1．5 h，但后續(xù)濃縮時(shí)相對困難。乙醇的溶解性好，對植物細(xì)胞壁的穿透力強(qiáng)，又由于DNJ的分子結(jié)構(gòu)含有4個(gè)羥基而具有強(qiáng)極性，常被用來作為提取DNJ的有機(jī)溶劑。劉韋鋆等［20］用濃度70%乙醇提取，經(jīng)一系列吸附、洗脫和純化，獲得的DNJ含量為23．2%，收率為0．355%。

微波和超聲波處理是提取方法中的一種輔助技術(shù)，能大幅縮短溶劑提取時(shí)間，提高得率，保證物質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。胡瑞君等［21］研究了微波萃取桑葉中DNJ方法，確定最佳的微波處理時(shí)間只需要1．5 min。鄭曉靜等［22］采用響應(yīng)面法優(yōu)化方法，獲得桑葉DNJ的超聲波提取工藝參數(shù)，實(shí)測DNJ得率為0．302 7%。此外，在其他的輔助提取方面，也取得一定進(jìn)展。孫長波等［23］采用真空氣流細(xì)胞破壁技術(shù)(VAPB)輔助提取DNJ，其含量比對照桑葉樣品高出74%。谷緒頂?shù)龋?4］用里氏木霉(Trichoderma reesei)的菌液對桑葉粉發(fā)酵處理12 h，再用稀鹽酸提取DNJ，結(jié)果含量比未經(jīng)發(fā)酵處理組增加了7．14倍，高達(dá) 1．995 mg/g。

2．2 DNJ的分離純化 不同來源的DNJ樣品需要選擇最適的分離純化方法進(jìn)行處理，以降低提取液中蛋白質(zhì)、淀粉、色素、果膠等雜質(zhì)的干擾，并且進(jìn)行下一步的準(zhǔn)確檢測分析。

離子交換樹脂層析法是DNJ分離純化中應(yīng)用較多的方法之一，常用732H型陽離子純化DNJ，用蒸餾水洗去不吸附的雜質(zhì)，再用氨水或乙醇洗脫，經(jīng)濃縮后用正丁醇萃取，回收正丁醇，干燥后即得純化的DNJ［25-26］。該方法雖有較好的分離效果，但工藝復(fù)雜，作為洗脫劑的氨水因產(chǎn)生刺激性氣味對操作者的健康有一定的危害。大孔吸附樹脂分離法是利用吸附劑的大孔結(jié)構(gòu)從水溶液中吸附有機(jī)物達(dá)到分離目的，其操作簡單，選擇性好，材料可重復(fù)利用，常用于DNJ提取液的脫色除雜。羅蕾蕾等［27］用AB-8大孔吸附樹脂對含DNJ的桑葉提取液進(jìn)行脫色除雜處理，再用732H型陽離子樹脂層析法進(jìn)一步純化，得到含量為16．7%的DNJ產(chǎn)品。反相液相色譜法固定相大多為非極性載體，以比固定相極性強(qiáng)的溶劑作為流動(dòng)相，DNJ為強(qiáng)極性生物堿，故采用此方法可達(dá)到純化目的。周惠燕等［28］采用此方法對粗提的DNJ進(jìn)行純化，得到含量為10．7%的DNJ純化物，證實(shí)反相色譜技術(shù)分離純化DNJ簡單易行，能夠得到理想的分離效果。膜分離技術(shù)富集DNJ的優(yōu)勢明顯，在過程中未使用任何有機(jī)溶劑，環(huán)保安全，可作為DNJ生產(chǎn)過程中一項(xiàng)有效的分離富集方法。顏繼忠等［29］用氧化鋁陶瓷膜微濾和聚醚砜膜超濾純化桑葉水提物后，DNJ質(zhì)量分?jǐn)?shù)從1．32%提高到7．84%。在實(shí)際的分離過程中，膜孔易被堵塞，膜面污染造成膜通量的下降，從而影響DNJ的富集效果。因此，膜本身的穩(wěn)定性改進(jìn)和膜前處理技術(shù)是今后的研究方向。

2．3 DNJ的檢測 選用合適的檢測方法和精準(zhǔn)靈敏的檢測儀器對DNJ的最終得率有較大的影響。近些年的DNJ檢測研究大多集中在氣相、液相色譜與質(zhì)譜的聯(lián)用，并且表現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景，但這些設(shè)備價(jià)格昂貴，實(shí)用性不高，因此對檢測器的靈敏性和實(shí)用性的兼容方面還需要進(jìn)一步的改善。以下列舉了目前廣泛使用的或檢測水平較高的幾類方法。

分光光度法常用來進(jìn)行不同植物成分的含量測定，但DNJ分子結(jié)構(gòu)中不含苯環(huán)、雙鍵和羰基等發(fā)色基團(tuán)，因此較少用常規(guī)的分光光度法檢測DNJ含量［30］。氣相色譜法分離效率高，選擇性好，樣品用量極少。由于DNJ的沸點(diǎn)較高，必須先將樣品乙酰化或硅烷化生成沸點(diǎn)較低的衍生物才能進(jìn)行色譜分析，在定性時(shí)要聯(lián)用質(zhì)譜法或光譜法對衍生物目標(biāo)峰進(jìn)行確認(rèn)。王濟(jì)強(qiáng)等［31］先將DNJ硅烷衍生化處理后，經(jīng)過色譜分離、火焰離子化檢測器定量、GC-MS確定目標(biāo)峰，建立一種簡單、快速、準(zhǔn)確測定桑葉中DNJ含量的氣相色譜法。

高效液相色譜法(HPLC)被廣泛應(yīng)用于DNJ的含量檢測研究中，包括需要柱前衍生化反應(yīng)和不需要衍生化的HPLC法兩種類型。不需要進(jìn)行柱前衍生化的方法可直接借助特殊化的檢測器進(jìn)行測定。宋婕等［32］采用HPLC-ELSD(HPLC-蒸發(fā)光散射檢測器)法對DNJ含量進(jìn)行了準(zhǔn)確測定，其色譜條件為:TSKgel Am-ide-80色譜柱，以乙腈-水為流動(dòng)相，柱溫30℃。顏繼忠等［29］根據(jù)DNJ極性較強(qiáng)的特點(diǎn)，選用Aglient ZORBAX NH2色譜柱，以乙腈-水(70∶30)為流動(dòng)相，建立用于DNJ定量分析的高效液相色譜-示差折光檢測法。姜佳等［33］采用特異性強(qiáng)的高效液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)，準(zhǔn)確分析DNJ的含量。質(zhì)譜檢測器選用ESI電離源，監(jiān)測的離子對為164．1/110．2，MRM模式，樣品分析時(shí)間僅為4 min。這類設(shè)備成本高，不易獲得，在應(yīng)用普及方面還有一定的局限性。柱前衍生-高效液相色譜-熒光檢測法具有靈敏性極高、選擇性強(qiáng)、結(jié)果更可靠等優(yōu)點(diǎn)。李繼文［7］以芴甲氧羰酰氯(FMOC-Cl)為柱前衍生化試劑進(jìn)行了衍生條件優(yōu)化，測得DNJ為10～35 mg/L。紫外檢測器與熒光檢測器相比雖然靈敏度有所降低，但更具有實(shí)用價(jià)值，準(zhǔn)確性也可通過調(diào)節(jié)試驗(yàn)條件來完成［34］，是目前測定DNJ含量使用最頻繁、最適用的一種定量分析方法。陳巖等［35］建立了DNJ的高效液相色譜-紫外檢測法，色譜柱為Hypersil C18，流動(dòng)相為乙腈濃度-濃度0．1%冰醋酸水溶液(50∶50)，流速為 1．0 ml/min，檢測波長為 265 nm，柱溫為 35℃，DNJ的檢測濃度在 5．0 ×10-4～1．0 ×10-3mg/ml范圍內(nèi)。

3 藥理活性及應(yīng)用

3．1 降血糖、血脂 DNJ是一種具有類糖結(jié)構(gòu)的生物堿，能高效抑制α-葡糖苷酶的活性，降低人體空腹血糖和餐后血糖峰值的作用顯著。李有貴［36］發(fā)現(xiàn)，桑葉中的DNJ能與α-葡糖苷酶結(jié)合，而且其親和性遠(yuǎn)大于麥芽糖和蔗糖等二糖有效阻滯二糖的分解，延緩單糖在腸道內(nèi)的吸收。宮原知江子［37］選用自然發(fā)病的糖尿病大鼠，分3組進(jìn)行研究，Ⅰ組為對照，Ⅱ組和Ⅲ組分別喂給含2．5%和5%桑葉粉的飼料，到46周齡時(shí)所測3組的空腹血糖值分別為18．72、8．53和6．33%mmol/L。Kong等［38］先建立糖尿病大鼠模型，發(fā)現(xiàn)經(jīng)DNJ治療后的大鼠的空腹血糖水平、糖耐受量和胰島素敏感性都得到顯著改善。Andallu等［39］臨床研究發(fā)現(xiàn)，日服3 g桑葉粉膠囊比服用規(guī)定劑量的降糖藥物格列本脲更能有效降低Ⅱ型糖尿病患者的空腹血糖值，且性質(zhì)穩(wěn)定，無毒副作用。

DNJ因能影響與脂代謝相關(guān)的酶活性而具有降血脂的作用。仝義超［40］通過飼喂高脂飼料建立SD高血脂模型，選用桑葉提取液中不同成分進(jìn)行灌胃，4周后檢測TC(血清總膽固醇)、TG(甘油三酯)、HDL-C(高密度脂蛋白膽固醇)水平，發(fā)現(xiàn)甾醇組、總黃酮組、總生物堿組降血脂動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果呈陽性，其中總生物堿組效果最佳。

目前，國內(nèi)多家生物醫(yī)藥公司研發(fā)上市了以DNJ為原料的調(diào)節(jié)血糖血脂或減肥新藥，還有幾十家公司專業(yè)生產(chǎn)DNJ提取物。其優(yōu)越的藥理活性在作為降糖降脂食藥成分的產(chǎn)業(yè)化方面前景廣闊。但是，就DNJ對降血糖、血脂的影響來看，大部分學(xué)者仍集中在探討其對血糖、各血脂指標(biāo)、相關(guān)酶活的比較，而對其具體的抑制途徑和機(jī)理結(jié)構(gòu)未能深入。

3．2 抗腫瘤、病毒 王然君等［41］發(fā)現(xiàn)，DNJ作為天然糖苷酶抑制劑，對小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16F10的入侵、遷移、黏附有明顯的抑制作用，揭示DNJ可通過抑制MMP-2和MMP-9的活性和表達(dá)、上調(diào)TIMP-2 mRNA表達(dá)以及改變細(xì)胞表面糖蛋白水平來降低腫瘤的轉(zhuǎn)移活性。DNJ還可通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞表面糖蛋白的修飾、加工過程，抑制其侵襲能力，但其抗腫瘤的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

DNJ具有很強(qiáng)的抑制病毒活性的作用，在治療艾滋病和病毒性肝炎方面有一定的開發(fā)潛力。DNJ通過阻礙糖蛋白加工，擾亂gp120的糖基化，可以阻斷或減少HIV誘導(dǎo)的合體細(xì)胞形成，中斷HIV的穿透和擴(kuò)散［42］。此外，謝瓊［43］通過DNJ及其衍生物對體外抗乙型肝炎病毒(HBV)的活性研究，發(fā)現(xiàn)DNJ具有較明顯體外抗HBV的作用。

4 展望

基于桑葉中DNJ廣泛的生理活性，國內(nèi)外已研制出多種預(yù)防或治療糖尿病的新藥和相關(guān)營養(yǎng)保健食品。它們不僅可有效治療糖尿病及其并發(fā)癥，改善機(jī)體的健康狀況，而且毒副作用很低，具有很好的應(yīng)用前景，但受限于天然DNJ資源的不足，暫不能開展規(guī)模應(yīng)用。今后，應(yīng)基于桑葉食藥用途產(chǎn)業(yè)化開發(fā)，綜合考慮資源、成本等要素，在優(yōu)勢桑樹品種篩選、示范以及規(guī)模應(yīng)用提取工藝、高效純化工藝優(yōu)化和有效提高檢測靈敏度等方面探索成熟路徑;在提高產(chǎn)出手段方面，積極探索桑樹基因組中調(diào)控DNJ合成的基因，通過基因工程的方法使其高效表達(dá)，從而獲取高含量、高純度DNJ;在活性機(jī)理研究方面，應(yīng)利用代謝組學(xué)的特征性評價(jià)在分子水平上加深降糖機(jī)制研究，特別是桑葉DNJ與其他活性物質(zhì)的協(xié)同作用研究以及在臨床診斷和治療中的安全性和有效性評價(jià)研究?？傊?，DNJ在醫(yī)藥、保健食品等領(lǐng)域?qū)碛袩o比廣闊的市場潛力和應(yīng)用前景。

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