詹雪艷，張燕玲，張加余，譚 鵬，冀嬌嬌，董 潔，劉永剛（北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 100102）

積雪草苷和羥基積雪草苷的電噴霧質(zhì)譜裂解機制研究

詹雪艷，張燕玲，張加余，譚 鵬，冀嬌嬌，董 潔，劉永剛
（北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 100102）

以積雪草苷和羥基積雪草苷為研究對象，在正負離子模式下，獲得其電噴霧離子阱三級質(zhì)譜圖，結(jié)合分子模擬方法，解析了其正負離子模式下二級質(zhì)譜中基峰子離子的三級質(zhì)譜裂解途徑，并尋找其裂解規(guī)律。結(jié)果表明，以上兩種皂苷化合物在正負離子模式下，分子離子均發(fā)生苷鍵的斷裂，主要生成苷糖基的碎片離子；苷糖基在三級質(zhì)譜裂解中主要發(fā)生脫水和交叉環(huán)切除的裂解反應，其質(zhì)譜裂解途徑應遵循苷糖基的脫水和縮環(huán)時不破壞分子內(nèi)氫鍵的裂解規(guī)律。應用密度泛函（DFT）方法優(yōu)化得到苷糖基能量最低的穩(wěn)定構(gòu)型，利用氫鍵識別模塊對苷糖基可能形成的分子內(nèi)氫鍵及其位置進行了預測。實驗結(jié)果表明，推測的正負碎片離子與質(zhì)譜裂解結(jié)果相符，從而驗證了以上苷糖基的脫水和縮環(huán)規(guī)律的合理性。本實驗結(jié)果豐富了烏蘇烷型皂苷的電噴霧質(zhì)譜裂解規(guī)律，可為烏蘇烷型皂苷的結(jié)構(gòu)鑒定提供更多支持。

烏蘇烷型皂苷；ESI-MSn；裂解途徑；裂解規(guī)律

積雪草苷和羥基積雪草苷為傘形科植物積雪草Centella asiatica（L.）Urban中的活性成分，屬于烏蘇烷型皂苷，具有促進創(chuàng)面愈合和抑制瘢痕形成的雙重療傷作用［1］，同時具有抗抑郁［2］、抗驚厥［3］和改善記憶［4］等作用，還具有抗腫瘤［5］、抗病原微生物［6］等方面的生物活性，其化學結(jié)構(gòu)示于圖1。

高效液相色譜-電噴霧離子阱質(zhì)譜（HPLCESI-MS）作為一種軟電離技術(shù)，已成為研究物質(zhì)結(jié)構(gòu)與生物分子間相互作用的重要手段［7-9］。為了使解析的裂解途徑更合理，可利用量子化學計算以輔助推測化合物的電噴霧質(zhì)譜裂解途徑和裂解規(guī)律［10-12］。目前，積雪草苷和羥基積雪草苷經(jīng)電噴霧質(zhì)譜裂解后，相關(guān)苷元離子和糖鏈離子的裂解規(guī)律的報道較少。因此，本工作擬通過研究積雪草苷和羥基積雪草苷的電噴霧多級正負離子質(zhì)譜裂解方式，總結(jié)其質(zhì)譜裂解特征和裂解規(guī)律，以期為烏蘇烷型化合物的結(jié)構(gòu)鑒定提供相關(guān)的質(zhì)譜資料和依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1100series高效液相色譜儀：美國Agilent公司產(chǎn)品，配備在線脫氣機、四元泵、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器、Chemstations色譜工作站等；Agilent XCT 6320型電噴霧離子阱質(zhì)譜儀：美國Agilent公司產(chǎn)品；Satorious十萬分之一電子分析天平：德國Satorious公司產(chǎn)品。

圖1 積雪草苷和羥基積雪草苷的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of asiaticoside and madecassoside

積雪草苷（批號：110892-200604）、羥基積雪草苷（批號：110893-200701）標準品：由中國食品藥品檢定研究院提供；乙腈（色譜純）：美國Fisher公司產(chǎn)品；甲酸：美國Sigma公司產(chǎn)品；實驗用水：二次蒸餾水，并經(jīng)0.45μm濾膜過濾。

1.2 實驗條件

1.2.1 HPLC條件 Agilent-XDB C18色譜柱（4.6mm×250mm×5μm）；流動相：乙腈-0.1%甲酸水溶液（25∶75，V／V）；流速：1.0mL／min；檢測波長：205nm；柱溫：30℃；進樣量：10μL。

1.2.2 ESI-MS條件 正負離子模式檢測，霧化氣和干燥氣均為氮氣（純度＞99.99%），碰撞氣為氦氣（純度＞99.99%）；干燥氣流速：11L／min；霧化氣壓力：241.5kPa；離子源電噴霧電壓：3 500V；毛細管溫度：350℃；目標質(zhì)量數(shù)：500；化合物穩(wěn)定性：150%；離子阱驅(qū)動水平：100%；質(zhì)量掃描范圍：m／z100～1 200；自動多級質(zhì)譜掃描模式；碰撞能量：1V；小碎片增益：30%～200%。所得數(shù)據(jù)利用Agilent 6300離子阱工作站（6.1版本）進行處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 正離子模式下的裂解途徑

圖2 正離子模式下，積雪草苷和羥基積雪草苷的多級質(zhì)譜圖Fig.2 Multi-stage mass spectra of asiaticoside and madecassoside in positive ion mode

積雪草苷和羥基積雪草苷均是烏蘇烷型的五環(huán)三萜皂苷，具有相同的糖鏈，二者的結(jié)構(gòu)差異在于皂苷元6位上相差一個羥基。積雪草苷和羥基積雪草苷在正離子模式下的多級質(zhì)譜圖示于圖2。在正離子模式下，積雪草苷和羥基積雪草苷一級質(zhì)譜的準分子離子分別為m／z 997.5和m／z981.5，均為［M＋Na］＋離子，示于圖2a。對選中的準分子離子進行碰撞誘導解離分析，在二級質(zhì)譜圖中，以上兩個皂苷具有相同的碎片離子m／z 493.2，根據(jù)文獻［13］報道，標記為B型碎片離子，示于圖2b。此碎片離子為糖苷鍵斷裂產(chǎn)生的糖基碎片離子，它的存在說明這兩個皂苷均發(fā)生了糖苷鍵的斷裂，正電荷均保留在糖基碎片離子一側(cè)。在二級質(zhì)譜圖中沒有觀察到皂苷苷元部分的碎片離子，這與皂苷元的結(jié)構(gòu)有關(guān)，糖鏈與苷元以酯鍵的形式連接，正離子模式下，糖苷鍵斷裂時電荷強烈地保留在糖鏈的一側(cè)，沒有電荷競爭反應的發(fā)生［14］。對糖鏈B型離子m／z 493.2進一步裂解得到三級質(zhì)譜圖，示于圖2c。其中m／z 475.2、447.2、421.2、405.2、391.3、349.1和m／z 347.1、331.1、329、289.2、259.1、184.9、167.1碎片離子均出現(xiàn)在積雪草苷和羥基積雪草苷的三級質(zhì)譜圖中，豐度最高的m／z 347.1為脫去末端鼠李糖所產(chǎn)生的碎片離子。

在圖2c中能看到m／z 493離子繼續(xù)丟失一分子水生成碎片離子m／z 475，這表明在該條件下糖鏈發(fā)生了脫水反應。

圖3 糖鏈中分子內(nèi)氫鍵的位置示意圖Fig.3 Intramolecular hydrogen bonds in sugar chain

已有研究表明，能形成氫鍵的取代基的結(jié)合能力強于不能形成氫鍵的取代基，質(zhì)譜裂解中通常不能形成氫鍵的取代基更容易獲取鍵斷裂所需的能量而優(yōu)先失去［15］。為了明確苷糖基交叉環(huán)切除的位置，采用Discovery Studio 4.0（DS）構(gòu)建了糖鏈的模型，MM2（molecular mechanics 2）方法進行苷糖基結(jié)構(gòu)的初步優(yōu)化，應用Gaussian 03軟件中的密度泛函（DFT）方法，在B3LYP／6-31d水平上進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，得到能量最低苷糖基的穩(wěn)定構(gòu)型。根據(jù)各個基團中氫、氧原子的電子云方向及其空間距離，利用DS中的氫鍵識別模塊對分子中可能發(fā)生的分子內(nèi)氫鍵進行預測，得到3個分子內(nèi)氫鍵，示于圖3。量取各個氫鍵的距離，根據(jù)該距離推斷氫鍵作用能力的強弱，結(jié)果表明，R2位羥基H與G6’位羥基O、G2’位羥基H與葡萄糖G環(huán)中氧橋上O較易形成分子內(nèi)氫鍵，氫鍵距離分別為1.756和1.878，均小于氫鍵空間距離的閾值2.5［15］。此外，葡萄糖G3’位羥基O與鼠李糖R1位上的H，兩原子間距離大于2.5，預測有形成氫鍵的傾向，但難以真正成鍵或所成氫鍵不穩(wěn)定。

分子內(nèi)氫鍵增強了G6’和G3’位羥基與鼠李糖的連接，也增強了G2’位羥基與葡萄糖G的連接，因此中間環(huán)葡萄糖G’只進行0，2鍵開裂，其余兩個環(huán)交叉切除裂解遵循不破壞上述氫鍵的原則。根據(jù)此規(guī)律推導三級質(zhì)譜中m／z493離子的裂解途徑，示于圖4。其中，圖4a所示的裂解途徑中產(chǎn)生的碎片離子與三級質(zhì)譜圖中的碎片離子很好地吻合，進一步驗證了鼠李糖R2位羥基H與G6’位羥基O，G2’位羥基H與葡萄糖G環(huán)中氧橋上O形成氫鍵，以及糖鏈環(huán)交叉切除時保留分子內(nèi)氫鍵的質(zhì)譜裂解規(guī)律的合理性。

由于鼠李糖R3和R4位羥基，葡萄糖G上G2、G3和G4位羥基的電子云無法達到形成氫鍵的角度或原子間空間距離較大，而無法形成分子內(nèi)氫鍵，因此推測此處羥基與碳鏈的結(jié)合能較小，但卻容易與鄰碳上的氫結(jié)合成H2O后失去，對應的兩個碳原子間形成雙鍵，轉(zhuǎn)變?yōu)橄┐际浇Y(jié)構(gòu)，由于烯醇式結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，進一步轉(zhuǎn)化為酮式結(jié)構(gòu)，裂解途徑示于圖4b。根據(jù)圖4b中碎片離子m／z475的結(jié)構(gòu)式，推測該離子易縮環(huán)脫去CO分子，得到m／z447碎片離子，示于圖4c。

2.2 負離子模式下的裂解途徑

在負離子模式下，積雪草苷和羥基積雪草苷的一級質(zhì)譜圖中的準分子離子分別為m／z 957.5和m／z973.5，是以上兩化合物的［MH］-離子，對該［M-H］-離子進行裂解得到負離子模式下的二級質(zhì)譜圖，示于圖5。積雪草苷裂解為m／z 469.1、487.3碎片離子，羥基積雪草苷裂解為m／z469.1、503.2碎片離子。其中，m／z487.3和m／z 503.2分別是積雪草苷和羥基積雪草苷的苷元部分碎片離子，m／z 469.1是皂苷的寡糖鏈片段負離子，該離子的存在表明負離子模式下糖苷鍵斷裂時，電荷在糖鏈上或苷元上的保留發(fā)生競爭，電荷競爭反應的結(jié)果是糖鏈上部分碎片負離子的豐度強于苷元的碎片負離子。

圖4 糖鏈加合離子［M＋Na］＋的裂解途徑Fig.4 Fragmentation pathway of sugar adduct ions［M＋Na］＋

圖5 負離子模式下，積雪草苷（a）和羥基積雪草苷（b）的二級質(zhì)譜圖Fig.5 MS2 spectrum of asiaticoside（a）and madecassoside（b）in negative ions mode

糖鏈碎片負離子m／z469進一步裂解得到的三級質(zhì)譜圖示于圖6。根據(jù)不破壞分子內(nèi)氫鍵的質(zhì)譜裂解規(guī)律進行苷糖基交叉環(huán)切除，推測負離子模式下兩皂苷的寡糖鏈負離子可能的裂解途徑，示于圖7。苷糖基［M-H］-離子的脫氫位置可能是不能形成氫鍵的鼠李糖R3和R4位上的H，葡萄糖G上G2、G3和G4位的H，而該離子的中間環(huán)是0，2鍵斷裂，生成的碎片離子主要是C型離子和C型離子交叉開環(huán)或失去一分子水產(chǎn)生的碎片離子。

2.3 討論

圖6 負離子模式下，糖鏈負離子m／z469的三級質(zhì)譜圖Fig.6 MS3 spectrum of sugar negative ion m／z 469in negative ion mode

圖7 負離子模式下，糖鏈負離子m／z 469的裂解途徑Fig.7 Fragmentation pathway of sugar negative ion m／z 469in negative ion mode

積雪草苷和羥基積雪草苷均為烏蘇烷型皂苷，在正負離子模式下，兩者的電噴霧質(zhì)譜裂解的二級質(zhì)譜圖中主要以糖苷鍵斷裂所產(chǎn)生的苷糖基碎片離子為主。在本實驗條件下，正負離子模式下其二級質(zhì)譜中均只發(fā)生糖苷鍵的斷裂，電荷更容易保留在糖鏈上，分別得到高豐度的苷糖基正負離子。

在積雪草苷和羥基積雪草苷三級質(zhì)譜圖中，苷糖基的碎裂方式主要有鄰二羥基脫水和糖基交叉環(huán)切除。應用分子模擬方法，預測了糖鏈上羥基形成分子內(nèi)氫鍵的位置。研究結(jié)果表明，苷糖基交叉環(huán)切除的位置與其分子內(nèi)氫鍵有關(guān)，苷糖基環(huán)交叉切除時保留分子內(nèi)氫鍵，同時苷糖基上鄰二羥基脫水也發(fā)生在不能形成氫鍵的鄰二羥基間。同時計算了苷糖基上C—H鍵的鍵能，確定了負離子模式下苷糖基［M-H］-離子的脫氫位置，即G2、G3、G4位羥基H或R3、R4位羥基產(chǎn)生競爭脫H，脫氫后在不同位置產(chǎn)生負電荷中心，得到不同類型的碎片離子，由此推測的裂解過程中產(chǎn)生的正負碎片離子與質(zhì)譜裂解結(jié)果相符，從而驗證了以上苷糖基的脫水和縮環(huán)規(guī)律的合理性。

3 結(jié)論

本研究應用分子模擬方法預測了積雪草苷和羥基積雪草苷糖鏈上可能存在的分子內(nèi)氫鍵，推測了積雪草苷和羥基積雪草苷的三級質(zhì)譜裂解途徑，其質(zhì)譜裂解途徑遵循苷糖基的脫水和縮環(huán)時不破壞分子內(nèi)氫鍵的裂解規(guī)律。實驗結(jié)果豐富了烏蘇烷型皂苷的電噴霧質(zhì)譜裂解規(guī)律，可為烏蘇烷型皂苷的結(jié)構(gòu)鑒定提供更多支持。

［1］ 翁小香，黃文武，孔德云.積雪草中三萜類成分及其活性研究進展［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2011，42（9）：709-716.

WENG Xiaoxiang，HUANG Wenwu，KONG Deyun.Progress of triterpenoids from centella asiatica and their pharmacological activities［J］.Chinese Journal of Pharmaceuticals，2011，42 （9）：709-716（in Chinese）.

［2］ 曹尉尉，徐江平，趙娜萍，等.積雪草總苷元對慢性應激抑郁大鼠的影響［J］.藥學實踐雜志，2012，30（2）：121-124.

CAO Weiwei，XU Jiangping，ZHAO Naping，et al.Effects of total aglycone of Centella asitica on depressed rats by chronic unpredicted mild stress［J］.Journal of Pharmaceutical Practice，2012，30（2）：121-124（in Chinese）.

［3］ 梁鑫，李剛，袁橙，等.積雪草苷的抗驚厥作用研究［J］.齊齊哈爾醫(yī)學院學報，2010，（1）：10.

LIANG Xing，LI Gang，YUAN Cheng，et al.Research on the anticonvulsant effect of asiaticoside［J］.Journal of Qiqihar Medical College，2010，（1）：10（in Chinese）.

［4］ 章卓，張紅，姜鮮，等.積雪草苷改善阿爾茨海默病大鼠記憶能力［J］.滬州醫(yī)學院學報，2012，35 （6）：564-567.

ZHANG Zhuo，ZHANG Hong，JIANG Xian，et al.Aisaticoside amelioratses the memory capacity on rat of Alzheimer＇s disease model［J］.Journal of Luzhou Medical College，2012，35 （6）：564-567（in Chinese）.

［5］ 黃云虹，張勝華，甄瑞賢，等.積雪草甙誘導腫瘤細胞凋亡及增強長春新堿的抗腫瘤作用［J］.癌癥，2004，23（12）：1 599-1 604.

HUANG Yunhong，ZHANG Shenghua，ZHEN Ruixian，et al.Asiaticoside inducing apoptosis of tumor cells and enhancing anti-tumor activity of vincristine［J］.Chinese Journal of Cancer，2004，23（12）：1 599-1 604（in Chinese）.

［6］ 張勝華，余蘭香，甄瑞賢，等.積雪草苷的抗菌作用及對小鼠實驗性泌尿系統(tǒng)感染的治療作用［J］.中國新藥雜志，2006，15（20）：1 746-1 749.

ZHANG Shenghua，YU Lanxiang，ZHEN Ruixian，et al.Suppression of bacterial urinary inefetion in mice with asiatieoside［J］.Chinese Journal of New Drugs，2006，15（20）：1 746-1 749（in Chinese）.

［7］ 從蒲珠，李筍玉.天然有機質(zhì)譜學［M］.北京：醫(yī)學科技出版社，2001.

［8］ 孫維星，劉志強，劉淑瑩.電噴霧質(zhì)譜在非共價生物——有機分子復合物研究中的應用［J］.分析化學，1998，26（1）：111-116.

SUN Weixing，LIU Zhiqiang，LIU Shuying.Application of electrospray mass spectrometry for study of specific noncovalent large biomoleculeorganic molecule complexes in solution［J］.Chinese Journal of Analytical Chemistry，1998，26 （1）：111-116（in Chinese）.

［9］ SIMMONS D A，KONEMRANN L.Charaeterization of transient protein folding intermediates during myoglobin reconstitution by time-resolved electrospray mass spectrometry with on-line isotopic pulse labeling［J］.Biochemistry，2002，41 （6）：1 906-1 914.

［10］譚鵬，關(guān)君，劉永剛，等.烏頭堿去甲基代謝產(chǎn)物的量子化學計算［J］，世界科學技術(shù)：中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2011，13（5）：792-795.

TAN Peng，GUAN Jun，LIU Yonggang，et al.Quantum chemistry calculation on demethylated metabolites of aconitine［J］.World Science and Technology／Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica，2011，13（5）：792-795（in Chinese）.

［11］王學杰，游金宗.拉米夫定降解機理的量化研究［J］.計算機與應用化學，2011，28（2）：192-196.

WANG Xuejie，YOU Jinzong.Theoretical study on the degradation mechanism of lamivudine［J］.Computers and Applied Chemistry，2011，28 （2）：192-196（in Chinese）.

［12］崔培珅，張乃峰，王蒙，等.大黃酸ESI-IT-MS質(zhì)譜行為及碎片離子的量子化學研究［J］.分析測試學報，2013，32（4）：432-436.

CUI Peishen，ZHANG Naifeng，WANG Meng，et al.Studies on mass behavior and fragment ions of rhein by ESI-IT-MS and quantum chemistry ［J］.Journal of Instrumental Analysis，2013，32 （4）：432-436（in Chinese）.

［13］DOMON B，COSTELLO C.A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentations in FAB-MS／MS spectra of glycoconjugates［J］.Glycoconjugat J，1988，（5）：397-409.

［14］劉淑瑩，宋鳳瑞，劉志強.中藥質(zhì)譜分析［M］.北京：科學出版社，2012.

［15］陳蘭慧.烏頭堿等中藥有效成分質(zhì)譜行為的量子化學研究［D］.長春：東北師范大學，2006.

Fragmentation Pathways and Patterns of Asiaticoside and Madecassoside in ESI-MSn

ZHAN Xue-yan，ZHANG Yan-ling，ZHANG Jia-yu，TAN Peng，JI Jiao-jiao，DONG Jie，LIU Yong-gang
（Beijing University of Chinese Medicine，Beijing100102，China）

To study the fragmentation pathways and patterns of asiaticoside and madecassoside by electrospray ionization mass spectrometry（ESI-MSn），the two compounds were analyzed by HPLC-ESI-MSnin positive ion mode and negative ion mode respectively，and multi-stage mass spectrum diagrams of the above two compounds were obtained.Mass spectrometry fragments of asiaticoside and madecassoside were analyzed under positive ion mode and negative ion mode，the stable configuration of sugar ions having the lowest energy was determined by calculation with density functional theory（DFT），and the fragments from the above two compounds mainly were the fragments of the anthocyanin glycosylation after the Glycoside bond of the molecular breaked，and dehy-dration and cracking rings occured in the fragments of the anthocyanin glycosylation in which the intramolecular hydrogen bonds were not destroyed.The intramolecular hydrogen bonding and dehydrogenation position in the anthocyanin glycosylation were predicted by calculating the molecular space bond length by Monitor Hbonds in the soft Discovery Studio 4.0，from which the positive and negative ions inferred are accord with the anthocyanin glycosylation fragments in the experiment，which confirms the rationality of the law of dehydration and cracking rings in the anthocyanin glycosylation fragments were guided by the law of dehydration and cracking rings of the anthocyanin glycosylation.The fragmentation pathways of the anthocyanin glycosylation fragments are explained by the calculation of the quantum chemistry at a molecular level，and can provide the basis for the chemical structure identification of ursane saponins.

ursane saponins；ESI-MSn；fragmentation pathways；fragmentation patterns

O657.63

A

1004-2997（2015）04-0289-07

10.7538／zpxb.youxian.2015.0015

2014-06-30；

修回日期：2014-11-15

北京市青年英才計劃（YETP0815）資助

詹雪艷（1978—），女（漢族），湖北鄂州人，博士，從事中藥分析與中藥質(zhì)量評價研究。E-mail：snowzhan＠126.com通信作者：劉永剛（1981—），男（漢族），山東臨沂人，博士，從事中藥化學研究。E-mail：liuyg0228＠163.com

時間：2015-05-25；

網(wǎng)絡出版地址：http：∥www.cnki.net／kcms／detail／11.2979.TH.20150525.1527.001.html