王洪允，劉 明，胡 蓓，江 驥（中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院臨床藥理中心，北京 100730）

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定人血漿中羅匹尼羅濃度

王洪允，劉 明，胡 蓓，江 驥（中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院臨床藥理中心，北京 100730）

建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS／MS）測定人血漿中羅匹尼羅濃度的方法，采用向血漿樣品中加入氘代內(nèi)標后，以甲基叔丁基醚進行萃取。色譜柱為Acquity UPLC BEH C18柱（2.1mm× 50mm×1.7μm），流動相為甲醇-10mmol／L乙酸銨（含0.2%氨水）（80∶20，V／V），流速為0.4mL／min。采用多反應監(jiān)測（MRM）掃描模式，以電噴霧離子源（ESI）正離子方式檢測。結果顯示，方法的線性范圍為0.02～5μg／L，最低定量限為0.02μg／L，日內(nèi)、日間精密度均小于15%，準確度在85%～115%之間，萃取回收率為85%。該方法快速、靈敏、專屬性強，不受血漿基質(zhì)的影響，不同條件下的穩(wěn)定性考察結果良好，適用于羅匹尼羅的人體藥代動力學研究。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS／MS）；羅匹尼羅；血藥濃度；藥代動力學

羅匹尼羅（ropinirole，商品名Requip）是第二代多巴胺受體激動劑，主要適應帕金森病和多動腿綜合癥［1-2］。該藥物能夠選擇性地刺激多巴胺D2受體，增強多巴胺作用，矯正中樞神經(jīng)傳導素的不平衡，解除癥狀并維持病人的自主性與活動力。臨床研究證明，羅匹尼羅不僅能夠有效地緩解運動徐緩、僵直和震顫，還能明顯地改善患者的日常生活能力及情緒，對帕金森病的各種階段均有較好的療效［3-5］，而且其副作用較少，常見的不良反應包括惡心、頭痛和嗜睡等。在最新版的《帕金森病治療指南》中，羅匹尼羅已經(jīng)成為該類疾病治療的初始一線藥物。

羅匹尼羅血藥濃度的測定方法主要有高效液相色譜（HPLC）法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS／MS）法［6-10］。近年來，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS／MS）法在生物醫(yī)學和藥物研究領域的應用逐漸增多。與傳統(tǒng)的分析方法相比，UPLC-MS／MS法能夠獲得更高的靈敏度和分析效率，特別適用于大批量生物樣品的高通量分析。本研究采用UPLC技術進行色譜分離，以電噴霧離子源和多反應離子掃描進行檢測，擬建立測定人血漿中羅匹尼羅藥物濃度的UPLC-MS／MS方法，以適用于羅匹尼羅的人體藥代動力學研究。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

Xevo TQS三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國Waters公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源（ESI）及MassLynx 4.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；Acquity超高效液相色譜儀：美國Waters公司產(chǎn)品；低溫高速離心機和渦流混合器：德國Heraeus公司產(chǎn)品；DB-3D型氮氣吹干儀：英國Techne公司產(chǎn)品；AX240十萬分之一分析天平：瑞士Mettler Toledo公司產(chǎn)品；純水機：美國Milli-Q公司產(chǎn)品；WinNonlin軟件（Version 6.3）：美國Pharsight公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

羅匹尼羅對照品（批號5801-7，純度99.6%）、內(nèi)標［2H6］-SKF101468對照品（批號JW46955-097A1，純度88.0%）、羅匹尼羅緩釋片（2mg／片）：由葛蘭素史克（中國）投資有限公司提供，其結構示于圖1；甲醇（色譜純）：Honeywell Burdick ＆Jackson公司產(chǎn)品；叔丁基甲醚（色譜純）：美國Thermo-Fisher公司產(chǎn)品；純水：由Milli-Q純化系統(tǒng)制備；空白血漿：來自北京協(xié)和醫(yī)院血庫。

圖1 羅匹尼羅（a）及其內(nèi)標（b）的結構式Fig.1 Chemical structures of ropinirole（a）and its internal standard（b）

1.3 實驗條件

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Acquity UPLC BEH C18柱（2.1mm×50mm×1.7μm）；流動相：甲醇-10 mmol／L乙酸銨（含0.2%氨水）（80∶20，V／V）；流速0.4mL／min；進樣體積5μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源；正離子電離；毛細管電壓3.0kV；錐孔電壓25V；錐孔氣流速50L／h；離子源溫度120℃；脫溶劑氣溫度500℃；脫溶劑氣流速900L／h；碰撞氣為氬氣，碰撞能為26V；采用多反應監(jiān)測（MRM）質(zhì)譜掃描方式進行測定：羅匹尼羅m／z 261.2→114.2，［2H6］-羅匹尼羅（內(nèi)標）m／z267.2→120.1。

1.4 血漿樣品處理

取100μL血漿樣品，加入20μL（10μg／L）內(nèi)標工作液，渦旋振蕩10s，然后加入300μL甲基叔丁基醚，再渦旋振蕩30s。以3 000r／min離心5min后，取200μL上清液，轉移至潔凈試管中，于40℃下以氮氣吹干，用200μL乙腈-水溶液（50∶50，V／V）復溶，取5μL進樣測定。

1.5 方法學考核

參照美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）在2013年頒布的指導原則［11］，對本方法的特異性，標準曲線線性，最低定量濃度，準確度和日內(nèi)、日間精密度，萃取回收率，稀釋實驗以及穩(wěn)定性（長期、室溫、凍融和自動進樣器放置）進行考核和基質(zhì)效應考察。

2 結果與討論

2.1 方法學考核

圖2 空白血漿（a）、空白血漿中加入內(nèi)標（b）、最低定量濃度（LLOQ）樣品（c，0.02μg／L）、受試者服藥后2h血漿樣品（d）的典型質(zhì)量色譜圖Fig.2 Typical MRM chromatograms of blank plasma（a），blank plasma spiked with IS（b），LLOQ sample（c，0.02μg／L）and a subject plasma sample at 2hpost-dose（d）

2.1.1 特異性 分別取空白血漿、空白血漿加標樣、受試者給藥后收集的血漿樣品，按1.3節(jié)和1.4節(jié)進行分析，其質(zhì)量色譜圖示于圖2。結果表明，羅匹尼羅和內(nèi)標的保留時間分別為0.60min和0.59min時，色譜峰峰形良好，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾羅匹尼羅及其內(nèi)標的測定。

2.1.2 標準曲線線性關系 按照上述方法制備并測定血漿標準曲線樣品，標準曲線濃度點依次為0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2和5μg／L。以羅匹尼羅濃度為縱坐標，藥物與內(nèi)標峰面積之比為橫坐標，權重系數(shù)為1／X2，進行線性回歸，得到回歸方程y＝0.507 166x＋0.006 724 68，r＝0.998。

2.1.3 最低定量濃度（LLOQ） 以血漿標準曲線的最低非零濃度點作為本方法的最低定量濃度（即0.02μg／L），制備并測定6個LLOQ樣品，連續(xù)測定3天。結果顯示，LLOQ的準確度分別為105.0%，日內(nèi)和日間精密度（RSD%）分別為8.5%和9.5%，結果列于表1。

表1 羅匹尼羅的測定準確度，日內(nèi)、日間精密度和萃取回收率Table 1 Accuracy，intra-and inter-day precision and extraction recoveries of ropinirole

2.1.4 準確度和日內(nèi)、日間精密度 按照上述方法制備并測定低、中、高3種濃度的質(zhì)控樣品（0.06，0.25和4μg／L），每一濃度制備并測定6次，連續(xù)測定3天，計算準確度和日內(nèi)、日間精密度。結果顯示，本方法的準確度在85%～115%之間，日內(nèi)、日間精密度均在15%以內(nèi)，完全符合CFDA的相關規(guī)定。

2.1.5 萃取回收率 萃取樣品：取低、中、高濃度的質(zhì)控樣品（n＝6），按照上述方法制備并測定；未萃取樣品：配制濃度分別為0.06、0.25和4μg／L標準品溶液（溶劑為50%乙腈-50%水，V／V），取空白血漿，按照1.4節(jié)方法處理至氮氣吹干步驟，分別以上述3種濃度的溶液（體積200μL）進行復溶，并測定。將萃取樣品與相同濃度未經(jīng)萃取樣品的峰面積比較，計算羅匹尼羅的萃取回收率。結果顯示，低、中、高濃度樣品的平均萃取回收率分別為85.4%，85.0% 和87.3%，符合CFDA的相關要求。

2.1.6 基質(zhì)效應 配制濃度分別為0.06、0.25和4μg／L羅匹尼羅標準品溶液（溶劑為50%乙腈-50%水，V／V）。取6份來自不同個體的空白血漿，按照1.4節(jié)方法處理至氮氣吹干步驟，分別以上述3種濃度溶液（體積200μL）進行復溶并測定（每一濃度制備并測定6次，共18次），與相同濃度的上述標準品溶液直接測定獲得的峰面積比較，計算基質(zhì)效應。結果顯示，低、中、高濃度樣品的平均基質(zhì)效應因子分別為104.3%、94.4%和93.9%，RSD%分別為11.2%，9.2%和5.9%。這說明，在當前的分析條件下，不同來源的血漿基質(zhì)對羅匹尼羅的測定沒有影響。

2.1.7 稀釋實驗 配制25μg／L高濃度羅匹尼羅質(zhì)控樣品，以空白血漿稀釋10倍后（n＝6），按照1.4節(jié)方法處理并測定。結果顯示，稀釋實驗的準確度和精密度分別為101.3%和2.4%。因此，本方法的稀釋因子可以設定為10。

2.1.8 穩(wěn)定性考察 取低、中、高3種濃度的質(zhì)控樣品（n＝6）進行穩(wěn)定性考察：長期穩(wěn)定性，將樣品在-30℃凍存7個月；室溫穩(wěn)定性，將樣品在室溫下放置24h；凍融穩(wěn)定性，樣品在-30℃和室溫下反復凍、融3次，每次間隔12h；萃取后樣品穩(wěn)定性，將處理好的樣品在室溫下放置24h后測定，結果列于表2。結果表明：樣品在-30℃可以穩(wěn)定貯存3個月；室溫下可以穩(wěn)定放置24h；可耐受3次凍融循環(huán)；萃取后樣品室溫24h內(nèi)穩(wěn)定。此外，將在4℃條件下放置7個月的貯備液與新鮮配制的貯備液比較，證明貯備液在4℃條件下可以穩(wěn)定放置7個月。

表2 羅匹尼羅的穩(wěn)定性實驗結果Table 2 Stability results of ropinirole

2.2 方法應用

24名中國健康受試者，年齡（31±3）歲，體重指數(shù)23.2±1.6，參加羅匹尼羅緩釋片的藥代動力學研究。受試者在試驗前自愿簽署知情同意書，體檢、血常規(guī)、尿常規(guī)及血生化、血壓、心電圖、胸片檢查均正常，HIV陰性，無藥物過敏史和依賴史，不嗜煙、酒。試驗前2周及試驗期間未服用過其他任何藥物。整個臨床試驗持續(xù)14天，受試者在第1天、第8～14天接受羅匹尼羅緩釋片2mg／天，給藥間隔為24h；第2～7天為單劑量和多劑量研究之間的洗脫期，不給藥。采集下列時間點的系列血樣：第1天，首次給藥前（0h）和給藥后1、2、3、4、6、8、10、 12、14、16、18、20、22、24、36、48、72、96、120、144、168h血樣；第9～13天，給藥前0h；第14天，給藥前0h和給藥后1、2、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24h血樣。24名受試者系列血樣的平均血藥濃度-時間曲線示于圖3。結果表明，本方法可用于羅匹尼羅在中國健康受試者中的藥代動力學研究。

2.3 討論

圖3 中國健康受試者單次和多次口服羅匹尼羅緩釋片（2mg／天）后，羅匹尼羅的平均血藥濃度-時間曲線（n＝24）Fig.3 Mean plasma concentration-time curves of ropinirole in Chinese healthy subjects following a single or multiple doses of ropinirole prolonged release tablets（2mg per day）（n＝24）

在方法開發(fā)過程中，鑒于該藥物是弱堿性化合物，具有一定極性，容易形成［M＋H］＋準分子離子，因此采用ESI離子源在正離子模式下進行測定。為了提高分析效率，采用了先進的超高效液相色譜技術，羅匹尼羅及其內(nèi)標均有較好的保留且峰形良好，每個樣品的檢測僅需1min，大幅提高了研究效率，實現(xiàn)了UPLCMS／MS的高通量分析。在樣品制備方面，曾使用乙醚、二氯甲烷和甲基叔丁基醚進行液液萃取。結果發(fā)現(xiàn)，雖然這3種有機試劑都能將羅匹尼羅從血漿中萃取出來，但在本實驗條件下，甲基叔丁基醚的萃取率最高，且干擾最少，因此采用甲基叔丁基醚作為萃取劑。此外，分析過程中，氘代同位素內(nèi)標的使用也提高了分析方法的準確性和適用性。

3 結論

本研究建立了測定血漿中羅匹尼羅濃度的UPLC-MS／MS方法，并進行了嚴格的方法學考核。與傳統(tǒng)的分析方法相比，該方法高效、靈敏、專屬性強，測定時間僅需1 min，實現(xiàn)了UPLC-MS／MS技術的高通量分析，可為羅匹尼羅的人體藥代動力學和藥物代謝研究提供穩(wěn)定、可靠的檢測手段。

致謝：本研究的申辦者是葛蘭素史克（中國）投資有限公司。感謝參加本研究的醫(yī)生、護士和實驗室分析人員，特別感謝參加臨床試驗的受試者。

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Determination of Ropinirole in Human Plasma by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

WANG Hong-yun，LIU Ming，HU Pei，JIANG Ji
（Clinical Pharmacology Research Center，Peking Union Medical College Hospital，Chinese Academy of Medical Science，Beijing100730，China）

A method of ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS／MS）was developed for the determination of ropinirole in human plasma.The plasma samples were extracted with methyl tert-butyl ether after the addition of deuterated internal standard.The analytical column was Acuity UPLC BEH C18column（2.1mm×50mm×1.7μm），and the mobile phase was composed of methanol-10mmol／L ammonium formate in 0.2%ammonium solution（80∶20，V／V）.The flow rate was 0.4mL／min.Detection was performed with multiple reactions monitoring （MRM）using positive electrospray ionization（ESI）.The results show that the calibration curve is linear over the concentration range of 0.02-5μg／L.The lower limit of quantification is 0.02μg／L.Inter-day and intra-day precision are less than 15%，and the accuracy is within 85%-115%.Extraction recoveries are around 85%and the determination is independent of plasma matrix.In addition，the analyte is proved to be stable under various storage and processing conditions.Therefore，this method proves to be rapid，sensitive and specific，and suitable for the pharmacokinetic study of ropinirole in humans.

ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS／MS）；ropinirole；plasma concentration；pharmacokinetics

O657.63

A

1004-2997（2015）04-0296-06

10.7538／zpxb.youxian.2015.0014

2014-07-21；

修回日期：2014-09-15

國家科技重大專項課題“重大新藥創(chuàng)制”（2008ZX09312-016）資助

王洪允（1975—），男（滿族），遼寧撫順人，副研究員，從事藥代動力學和藥物代謝研究。E-mail：wanghongyunpharm＠yahoo.com

江 驥（1954—），男（漢族），江蘇淮陰人，研究員，從事藥代動力學和藥物代謝研究。E-mail：pk.frosh＠gmail.com

時間：2015-01-30；

網(wǎng)絡出版地址：http：∥www.cnki.net／kcms／detail／11.2979.TH.20150130.1601.014.html