劉 霜，盧建遠(yuǎn)，馬 力，夏 威，胡 亮，羅 斌，楊珂?zhèn)ィ窒驏|

(西南民族大學(xué)國(guó)家民委動(dòng)物科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041)

山羊ZP3基因的cDNA克隆、序列分析及組織表達(dá)研究

劉 霜，盧建遠(yuǎn)，馬 力，夏 威，胡 亮，羅 斌，楊珂?zhèn)?，字向東

(西南民族大學(xué)國(guó)家民委動(dòng)物科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041)

對(duì)高繁金堂黑山羊和低繁藏山羊ZP3基因cDNA進(jìn)行克隆、序列分析，并采用Real-time PCR技術(shù)對(duì)其在發(fā)情前期母羊卵巢組織的表達(dá)進(jìn)行研究.結(jié)果表明:山羊ZP3基因編碼區(qū)全長(zhǎng)為1269bp，共編碼422個(gè)氨基酸，兩品種間有2處堿基差異，但未導(dǎo)致氨基酸的差異.山羊的ZP3基因在卵巢表達(dá)量高，與其他組織差異極顯著(P＜0.01)，但兩個(gè)品種間差異不顯著(P＞0.05).說明ZP3基因主要在卵巢中表達(dá)，但可能不是影響山羊多羔性狀的主基因.

山羊；ZP3；克隆；序列分析；qPCR

透明帶(zona pellucida，ZP)是卵母細(xì)胞周圍一層糖蛋白基質(zhì)，該家族有ZP1、ZP2、ZP3和ZP4四種糖蛋白[1-2]，在哺乳動(dòng)物精卵識(shí)別、結(jié)合、穿透、胚胎著床等過程中有著關(guān)鍵的作用[3-5].人、鼠、雞等中已證實(shí)，ZP3蛋白是精子第一受體[6-8]，精卵結(jié)合與ZP3糖蛋白的O-糖基化位點(diǎn)息息相關(guān)[9].重組人的ZP3同樣能誘導(dǎo)頂體反應(yīng)，使人的精子和倉(cāng)鼠透明帶融合[10-11].同時(shí)，研究表明敲除ZP3基因的小鼠不能形成透明帶[12].可見ZP3基因?qū)β淹该鲙г诰呀Y(jié)合過程具有極為重要的作用.

目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)山羊多胎機(jī)制的研究主要集中在綿羊上，已證實(shí)與卵泡發(fā)育和排卵數(shù)的突變基因，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白-15(BMP15)和及其受體-1B (BMPR1B)等，但結(jié)果表明這些基因不是控制山羊多胎的主基因[13-14].對(duì)與受精過程密切相關(guān)的山羊ZP3基因的研究則未見報(bào)導(dǎo).金堂黑山羊是優(yōu)良的多胎(平均產(chǎn)羔率240%)肉山羊品種[15]，而藏山羊則是單胎肉山羊品種[16].因此，本研究以多胎金堂黑山羊和單胎藏山羊?yàn)檠芯繉?duì)象，首次對(duì)不同產(chǎn)羔率的山羊品種的ZP3基因進(jìn)行cDNA克隆、序列分析和組織表達(dá)研究，以期從受精環(huán)節(jié)探討山羊多胎性狀的分子調(diào)控機(jī)制奠定一定的理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集

選用5只健康成年雌性四川金堂黑山羊和5只四川理縣藏山羊，在同期發(fā)情取出陰道栓塞(CIDR)后40h，屠宰羊只，即刻采集卵巢、輸卵管、子宮、垂體等組織，液氮凍存?zhèn)溆?

1.2 主要試劑

反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自FERMENTAS(MBI)公司；2 ×Taq PCR Master Mix、感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自購(gòu)自康迪生物技術(shù)有限公司；氨芐青霉素(Ampr)、克隆載體pMD-19 Vector購(gòu)自大連寶生物公司；Sso Advanced TMSYBR?Green Super mix，購(gòu)自伯樂公司.

1.3 總RNA的提取和cDNA的合成

采用Trizol法提取金堂黑山羊和藏山羊卵巢、輸卵管、子宮、垂體組織中的總RNA，按Fermentas (MBI)反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA的合成，保存?zhèn)溆?

1.4 引物設(shè)計(jì)及目的基因PCR擴(kuò)增

根據(jù)NCBI上已收錄的牛ZP3基因mRNA序列(NM173974)，設(shè)計(jì)克隆引物和qPCR引物(表1). PCR擴(kuò)增程序:95.0℃預(yù)變性5 min；94.0℃變性40s，60.0℃、退火40s；72.0℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán)；最后72.0℃延伸5 min；4.0℃保存.

表1 ZP3克隆及定量引物序列Table 1 Primer pairs of ZP3 for cloning and qPCR

1.5 目的基因的克隆、鑒定及測(cè)序

PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)，連接，轉(zhuǎn)化.取菌液PCR鑒定，挑選陽性克隆菌液2mL送上海英俊生物技術(shù)有限公司測(cè)序.

1.6 山羊ZP3基因的生物信息學(xué)分析

利用DNAman軟件對(duì)獲得的上下游序列進(jìn)行拼接.從NCBI上檢索的人(NM_001110354)、牛(NM_ 173974)、牦牛(GQ856646)、豬(NM_213893)、鼠(NM _011776)、雞(NM_204389)的ZP3基因相應(yīng)的核苷酸序列進(jìn)行多重對(duì)比，構(gòu)建物種分子進(jìn)化樹.用NCBI在線程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/ gorf.html)對(duì)所得兩種山羊ZP3序列進(jìn)行ORF查找，將CDS區(qū)翻譯成氨基酸序列.ProtParam程序分析ZP3蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)，理化參數(shù)；ProtScal程序分析山羊ZP3蛋白疏水性；TMHMM2.0 Server程序進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測(cè)；SignalP 4.0 Server程序預(yù)測(cè)信號(hào)肽；NetOGlyc4.0程序分析O-糖基化位點(diǎn)；GOR程序預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)；Phyre2程序預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu).

1.7 山羊ZP3基因系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

通過DNAman、DNAstar等生物分析軟件對(duì)兩品種ZP3基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)，并利用生物軟件MAGA 6.0構(gòu)建ZP3基因的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹.

1.8 qPCR

qPCR反應(yīng)體系為10μL:ZP3上下游引物(表1)各0.8μL，SsoAdvancedTM SYBR?Green Super mix 5μL，ddH2O 2.9μL，cDNA模板0.5μL.反應(yīng)程序: 95.0℃預(yù)變性3min，95.0℃/10s、57.6℃/20s，35個(gè)循環(huán).每個(gè)樣品為3個(gè)重復(fù)，并且設(shè)置不加模板為對(duì)照，取平均值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析.

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

qPCR所得數(shù)據(jù)用Pfaffl法[17]分析ZP3在金堂黑山羊和藏山羊卵巢組織及其他組織的相對(duì)表達(dá)量，RE＝(1+E ref)Ctre/(1+E target)Cttarget.兩品種ZP3基因表達(dá)量用t檢驗(yàn)法進(jìn)行顯著性差異分析.

2 結(jié)果

2.1 藏山羊和金堂黑山羊ZP3基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

以金堂黑山羊和藏山羊總cDNA為模板，擴(kuò)增ZP3基因，得到約1300bp左右的片段，與預(yù)期相符，并以菌液作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得片段大小也與預(yù)期相符(圖1).

圖1 ZP3基因PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)1.DNA Marker DL2000；2、3.金堂黑山羊和藏山羊ZP3基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results of ZP3 PCR product1.DNA marker DL2000；2，3.ZP3 of Jintang black goat and Tibetan goat

2.2 金堂黑山羊和藏山羊ZP3基因CDS序列分析

用DNAman軟件對(duì)測(cè)序所得ZP3序列拼，得到1269bp同樣長(zhǎng)度的片段.金堂黑山羊與藏山羊基因編碼區(qū)的同源性為99.85%，均長(zhǎng)1269bp，編碼422個(gè)氨基酸.金堂黑山羊和藏山羊兩品種核苷酸序列有兩處不同，第356位C→T，第581位A→G，但是核苷酸的差異沒有引起氨基酸的差異.金堂黑山羊ZP3基因CDS區(qū)的核苷酸序列與藏山羊及NCBI中牛(NM_ 173974)、牦牛(GQ856646)、豬(NM_213893)、鼠(NM _011776)、雞(NM_204389)進(jìn)行對(duì)比，相應(yīng)序列間的一致性分別為99.8%、96%、95%、86%、71.5%、54.6%.

利用MEGA6.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)，藏山羊和金堂黑山羊先聚為一類，牛與牦牛聚為一類再與山羊聚為一類，然后和豬，鼠聚為一類，最后和雞聚成一大類，這與哺乳動(dòng)物的進(jìn)化程度保持一致. 2.3 金堂黑山羊和藏山羊ZP3蛋白的結(jié)構(gòu)特征

圖2 基于核苷酸序列的金堂黑山羊和藏山羊ZP3基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of ZP3 gene of Jintang black goat and Tibetan goat

Protparam分析結(jié)果表明，金堂黑山羊和藏山羊蛋白的分子式為C2074H3260N588O602S23，相對(duì)分子質(zhì)量為46801.6，理論等電點(diǎn)PI為7.19，半衰期為4.4h，不穩(wěn)定參數(shù)為50.01，屬不穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)82.84.疏水性分析，顯示大多數(shù)氨基酸為親水性氨基酸，判定ZP3蛋白為親水性蛋白.SignalP3.0信號(hào)肽預(yù)測(cè)，ZP3基因第1-22(Met-Pro)氨基酸序列是信號(hào)肽位點(diǎn)，信號(hào)肽裂解點(diǎn)位于第22位Pro和第23位Glu之間，屬分泌型蛋白.TMHMM 2.0進(jìn)行跨膜區(qū)分析，ZP3蛋白只存在一個(gè)跨膜區(qū)，位于氨基酸第382-404之間.NetOGlyc4.0分析，ZP3基因存在10個(gè)O-糖基化位點(diǎn).

GOR程序在線預(yù)測(cè)ZP3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示ZP3蛋白包括α螺旋、β折疊、無規(guī)卷曲，分別占靶蛋白的2.13%、34.36%和63.51%，由此可見無規(guī)卷曲在ZP3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中有重要作用.PHYRE2.0預(yù)測(cè)ZP3蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖3)，殘基建模覆蓋率63% (266個(gè)氨基酸殘基)，置信度達(dá)100%，說明ZP3蛋白與模板蛋白的空間結(jié)構(gòu)比較接近，適合的空間結(jié)構(gòu)比例大. 2.4 組織差異表達(dá)分析

圖3 ZP3蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 Prediction for the tertiary structure of ZP3 protein

對(duì)ZP3基因在金堂黑山羊和藏山羊4個(gè)組織中的mRNA表達(dá)量的分析結(jié)果表明:ZP3基因mRNA在山羊卵巢、子宮、輸卵管、垂體中均有表達(dá)，但在卵巢表達(dá)量最高，與其他組織差異極顯著(P＜0.01，圖4)，而兩品種之間差異不顯著(P＞0.05).

圖4 ZP3基因在金堂黑山羊和藏山羊不同組織中的相對(duì)表達(dá)量(Mean±SE)Fig.4 Expression of ZP3 gene in different tissues of Jintang black goat and Tibetan goat(Mean±SE)

3 討論

精子與ZP3受體結(jié)合后，形成受體配體復(fù)合物，從而激發(fā)精子發(fā)生頂體反應(yīng)和透明帶反應(yīng).在精卵識(shí)別和粘附過程中，ZP3蛋白的O-連接糖基化位點(diǎn)具有極關(guān)鍵作用[18].O-聚糖俗稱粘蛋白，與細(xì)胞的識(shí)別、粘附及細(xì)胞凋亡等生命過程密切相關(guān)[19].小鼠定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)表明，ZP3蛋白的Ser332和Ser334位的絲氨酸的O-糖基化位點(diǎn)是結(jié)合精子的必須基團(tuán)[20].而研究者在生物進(jìn)化過程中發(fā)現(xiàn)，Ser332和Ser334附近的氨基酸發(fā)生改變，導(dǎo)致種的特異性，從而影響精卵結(jié)合[21].本研究對(duì)多胎山羊品種(金堂黑山羊)和單胎山羊品種(藏山羊)ZP3基因的克隆、生物信息學(xué)分析表明，兩品種ZP3基因cDNA序列一致性達(dá)到99.8%，與牛和牦牛的序列一致性達(dá)到96%[22]，說明山羊ZP3基因cDNA序列比較保守.山羊的ZP3基因編碼區(qū)序列與其他物種同源性很高，在哺乳動(dòng)物中較保守，分子系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果也符合進(jìn)化系統(tǒng).山羊ZP3蛋白分子量為46.80kD，與普通牛(46.55kD)和牦牛(46.62kD)蛋白分子量差異不大[22].目前，有關(guān)卵透明帶的研究主要集中在受精過程時(shí)精子的特異性位點(diǎn)識(shí)別及相關(guān)分子機(jī)制[23].本研究發(fā)現(xiàn)兩個(gè)山羊品種的氨基酸序列都為10個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，說明O-糖基化結(jié)合位點(diǎn)不會(huì)導(dǎo)致金堂黑山羊和藏山羊在受精環(huán)節(jié)的差異.

哺乳動(dòng)物中，人和鼠的ZP3蛋白主要在卵巢組織中表達(dá)，在其他組織只有微量表達(dá)[12，24]；魚類中，紅鯽和中華鱘等的ZP3蛋白在卵巢中的表達(dá)量極顯著于心臟、肝臟、腦等[25-26].本實(shí)驗(yàn)熒光定量PCR結(jié)果顯示，金堂黑山羊和藏山羊ZP3基因在子宮、輸卵管和垂體均有極低表達(dá)，但是在卵巢中的表達(dá)量顯著高于其它組織(P＜0.01)，說明ZP3基因在卵巢組織具有表達(dá)特異性，體現(xiàn)ZP3基因在透明帶中的重要作用.但是兩個(gè)品種間差異不顯著(P＞0.05)，說明ZP3基因不是影響山羊產(chǎn)羔性狀的主要原因.

4 結(jié)論

本試驗(yàn)首次克隆了山羊ZP3基因，多胎金堂黑山羊與單胎藏山羊ZP3基因CDS編碼區(qū)存在2處核苷酸差異，但未導(dǎo)致氨基酸的差異.山羊和其他物種的ZP3基因的同源性高，在生物進(jìn)化上高度保守.山羊ZP3基因包含一個(gè)1269bp的開放閱讀框，編碼422個(gè)氨基酸.ZP3基因在兩山羊品種間的表達(dá)無顯著差異.

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(責(zé)任編輯:李建忠，付強(qiáng)，張陽，羅敏；英文編輯:周序林，鄭玉才)

cDNACloning，sequence analysis and tissue expression of goat ZP3 gene

LIU Shuang，LU Jian-yuan，MA Li，XIA Wei，HU Liang，LUO Bin，YANG Ke-wei，ZI Xiang-dong
(The Key Laboratory of Animal Science of State Ethnic Affairs Commission，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，P.R.C.)

This study was carried out for ZP3 gene cloning and sequence analysis on non-prolific Tibetan goats and prolific Jintang black goats，and its mRNA expression levels in ovary at pro-estrus were determined by real-time PCR.The result showed that the coding region sequence(CDS)of goat ZP3 gene was 1269bp long，encoding 422 amino acids.There were 2 basic differences between the two breeds without amino acid change.The mRNA expression level was higher in ovary than in other tissues (P＜0.01)，but there was no differential expression between the two breeds(P＞0.05).The result shows that ZP3 gene is highly expressed in ovary，but it may not be the major gene to determine the kidding rate in goat.

goat；ZP3；cloning；sequence analysis；qPCR

S814；S827

A

2095-4271(2015)04-0412-05

10.11920/xnmdzk.2015.04.004

2015-04-01

字向東(1963-)，男，白族，云南云龍人，教授，研究方向:動(dòng)物遺傳育種與繁殖，E-mail:zixd＠sina.com

四川省應(yīng)用基礎(chǔ)項(xiàng)目(2013JY0043)；西南民族大學(xué)研究生創(chuàng)新型科研項(xiàng)目(CX2014SZ69)