于 淼，金素鈺，黃 林，蔣忠榮，劉 曦，鄭玉才

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.四川省甘孜州畜牧科學(xué)研究所，四川 康定 626000)

三個牦牛品種(類群)尿苷一磷酸合成酶缺乏癥的檢測

于 淼1，金素鈺1，黃 林1，蔣忠榮2，劉 曦2，鄭玉才1

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.四川省甘孜州畜牧科學(xué)研究所，四川 康定 626000)

檢測牦牛中是否存在尿苷一磷酸合成酶缺乏癥(DUMPS).實驗選取分布于四川省的昌臺牦牛、九龍牦牛、麥洼牦牛三個品種(類群)共100頭，從血液中提取基因組DNA，采用常規(guī)PCR-RFLP技術(shù)進行DUMPS的遺傳缺陷檢測.首先擴增牦牛尿苷一磷酸合成酶基因部分片段，再用限制性內(nèi)切酶AvaⅠ酶切擴增產(chǎn)物，通過酶切條帶數(shù)確定牦牛群體中是否存在DUMPS攜帶者.結(jié)果顯示，所檢測的100頭牦牛PCR產(chǎn)物的酶切條帶均為3條，為正常純合子，未發(fā)現(xiàn)DUMPS攜帶者.

牦牛；尿苷一磷酸合成酶缺乏癥；PCR-RFLP

尿苷一磷酸合成酶缺乏癥(Deficiency of uridine monophosphate synthase，DUMPS)是牛中的一種常染色體遺傳缺陷病，為單基因隱性遺傳疾病.Schwenger等發(fā)現(xiàn)該遺傳病雜合子C-末端編碼405處氨基酸的密碼子存在1個C→T點突變，原編碼精氨酸的密碼子CGA轉(zhuǎn)變?yōu)榻K止密碼子TGA[1].該病攜帶者因基因突變不能將乳清酸轉(zhuǎn)化為鳥苷酸，瓜氨酸積累引起高氨血癥，使致病純合子犢牛在出生一周內(nèi)死亡，或者母牛妊娠40 d左右流產(chǎn)[2-3].

由于隱性遺傳病的攜帶者表現(xiàn)正常，因此難以發(fā)現(xiàn).DUMPS發(fā)現(xiàn)于荷斯坦牛中，攜帶該病基因的優(yōu)質(zhì)種公牛的精液，因人工授精技術(shù)的廣泛應(yīng)用，有可能導(dǎo)致DUMPS病在較大范圍內(nèi)傳播.國內(nèi)已有檢測出荷斯坦牛攜帶DUMPS的報道，而關(guān)于牦牛中是否存在DUMPS尚未見報道.牦牛是青藏高原及毗鄰高寒地帶特有的牛種，是當(dāng)?shù)啬撩裰匾纳钯Y料和創(chuàng)造財富的生產(chǎn)資料.研究牦牛種群中是否存在DUMPS，對牦牛的育種和改良等工作具有實際意義.利用PCR -RFLP方法檢測DUMPS雜合子，已在美國、歐洲等地廣泛使用.該方法對牛的基因型進行分型，簡單快速，不受奶牛的年齡、性別等因素影響[4-6].

1 材料與方法

1.1 試驗牦牛和樣品的采集

選取分布于四川省三個地區(qū)的成年健康牦牛(Bos grunniens)100頭，其中九龍牦牛40頭，昌臺牦牛30頭，麥洼牦牛30頭，分別飼養(yǎng)于九龍縣、紅原縣和白玉縣.通過頸靜脈采血，用肝素抗凝，冰瓶帶回實驗室，-80℃保存至分析.

1.2 基因組DNA的提取

TaKaRa DNA提取試劑盒購自寶生物(大連)有限公司，按試劑盒操作指南從全血中提取牦?；蚪MDNA.

1.3 尿苷一磷酸合成酶(UMPS)基因的PCR擴增

PCR引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成，采用Schwenger等設(shè)計的引物[7]，預(yù)期擴增片段長度為108 bp，序列為:UMPS-F:5′-GCAAATGGCTGAAGAACATTCTG-3′，UMPS-R:5′-GCTTCTAACTGAACTCCTCGAGT-3′.用Eppendorf AG 22331 Hamburg PCR儀擴增，PCR擴增體系為25 μL: 2×Taq PCR MasterMix酶12.5 μL，超純水9.5 μL，上、下游引物各0.8 μL，DNA模板1.4 μL.擴增條件: 94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃延伸5 min.用3%瓊脂糖凝膠檢測，60 V電泳40 min.

PCR產(chǎn)物通過基因克隆方法測序.用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司生產(chǎn))對目的條帶進行回收，用紫外分光光度計測定回收片段的DNA濃度.pMD?19-T Vector(TaKaRa公司生產(chǎn))連接目的基因后，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞，在培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)過夜，挑出單一菌落于液體培養(yǎng)基內(nèi)搖菌培養(yǎng).菌液送予上海生工公司進行測序.

1.4 酶切分型

酶切反應(yīng)體系:PCR產(chǎn)物10 μL，Ava I 1 μL，超純水9 μL，10×buffer 1 μL.混勻后于37℃酶切過夜.酶切產(chǎn)物用4%瓊脂糖凝膠檢測，50 V電泳50 min.

AvaI酶識別序列位點為5′-CYCGRG-3′，因此荷斯坦牛的PCR擴增序列酶切后分為三種情況:正常純合子基因型為CC，酶切后得到53 bp、36 bp、19bp共3條帶；患病雜合子基因型為CT，酶切后得到89bp、53 bp、36 bp、19 bp共4條帶；患病純合子基因型為TT，酶切后得到89 bp、19 bp兩條條帶[8].

2 結(jié)果與分析

2.1 尿苷一磷酸合成酶基因PCR擴增結(jié)果

100頭牦牛的基因組DNA經(jīng)PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳分離，獲得了同預(yù)期分子量大小相近的特異性擴增產(chǎn)物(圖1).

圖1 牦牛UMPS基因的PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳泳道1～4為牦牛樣品，M為DNA markerFig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products amplifying UMPS gene of yak Lanes 1 to 4:yak samples，M:DNA marker

裁掉克隆測序結(jié)果中載體的固有序列，再與上、下游引物進行比對，得到牦牛UMPS基因的部分編碼區(qū)序列，長度為108 bp，用DNAMAN軟件將PCR產(chǎn)物測序結(jié)果與荷斯坦牛UMPS基因?qū)Ρ?圖2)，顯示二者相似性為99.07%.其中的1個堿基不同，是在設(shè)計引物時將G改為C，從而引入一個酶切位點(CYCGRG)，因此，實驗所獲得的牦牛和荷斯坦牛UMPS基因片段序列是相同的.牦牛與荷斯坦牛的酶切位點是一致的，因此酶切后非患病純合子為3條帶，雜合子為4條帶.

2.2 檢測分型結(jié)果

對三個品種(類群)的100頭牦牛的尿苷一磷酸合成酶基因PCR擴增產(chǎn)物進行酶切，凝膠電泳上均顯示為3條區(qū)帶，為正?；蚣兒献樱窗l(fā)現(xiàn)DUMPS攜帶者(圖3).

圖2 牦牛與荷斯坦牛UMPS基因片段的序列比對Fig.2 Alignment of partial sequence of UMPS gene of yak and Holstein cattle

圖3 牦牛UMPS基因PCR產(chǎn)物酶切的瓊脂糖凝膠電泳圖泳道1～4是正常牦牛的條帶型，M為DNA markerFig.3 Agrose gelelectrophoresis of enzyme digested PCRproduct amplifying UMPS gene of yak Lanes 1 to 4:band types of normal yaks，M:DNA marker

3 討論

本研究采用PCR-RFLP方法檢測，用PCR擴增出可能出現(xiàn)突變的基因片段，再用特異的內(nèi)切酶切割，由于存在特定位點的堿基突變產(chǎn)生不同長度，直接用凝膠電泳分型[9].本實驗結(jié)果表明，用此方法檢測牦牛中是否存在DUMPS攜帶者，方法簡便，分型時間短.雖然在3個牦牛品種(類群)中未發(fā)現(xiàn)DUMPS攜帶者，這是值得慶幸的，但也應(yīng)對該遺傳病予以重視.公牛攜帶者不會表現(xiàn)出癥狀，若未檢測到而用于配種，其隱性有害基因則會在牛群中快速傳播，給畜牧業(yè)造成很大經(jīng)濟損失.1987年美國公牛Happy-Herd Beautician因為其生產(chǎn)能力排行全美第五，其凍精被廣泛用于與各國當(dāng)?shù)嘏５娜斯な诰牧?，?dǎo)致北美洲和歐洲出現(xiàn)很多隱性基因攜帶者(美國438頭、歐洲314頭)[10].Jon-Red是上世紀(jì)80年代末期美國著名的公牛，其西門塔爾牛后代均攜帶DUMPS突變基因，在美國和歐洲分別檢測到101頭和84頭[11].國內(nèi)荷斯坦牛中檢測到DUMPS攜帶者也時常見報道.在臺灣1468頭荷斯坦牛中檢測到2頭隱性突變基因攜帶者[12].謝巖等人檢測了全國14個省共計519頭荷斯坦公牛凍精樣品，發(fā)現(xiàn)DUMPS攜帶者比例為0.17%，且是美國公牛Skokie sensation Ned的后代[13].梁若冰等檢測了來自全國27個牛場的691頭荷斯坦公牛的血樣，共發(fā)現(xiàn)1頭雜合子母牛[14].

國內(nèi)外報道的DUMPS發(fā)生頻率大約在0.2%～2.5%范圍內(nèi)[15]，盡管目前沒有在牦牛群體中發(fā)現(xiàn)該遺傳病攜帶者，但鑒于牦牛的雜交改良在青藏高原牧區(qū)的應(yīng)用，也須注意DUMPS突變基因的檢測.牦牛若與荷斯坦牛進行雜交改良，更應(yīng)注意檢測DUMPS攜帶者.同時，對牦牛DUMPS的檢測，應(yīng)擴大牦牛的品種、數(shù)量和分布區(qū)范圍，尤其是經(jīng)過種間雜交改良的群體，以確保該遺傳病不在牦牛中發(fā)生.

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(責(zé)任編輯:李建忠，付強，張陽，羅敏；英文編輯:周序林，鄭玉才)

Detection of deficiency of uridine monophosphate synthase in three yak breeds or population

YU Miao1，JIN Su-yu1，HUANG Lin1，JIANG Zhong-rong2，LIU Xi2，ZHENG Yu-cai1
(1.School of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，P.R.C.；2.Institute of Animal Science and Veterinary Medicine of Ganzi Prefecture，Kangding 626000，P.R.C.)

The aim of the study is to detect the occurence of yaks carrying deficiency of uridine monophosphate synthase (DUMPS).A total of 100 yaks belonging to three breeds or population in Sichuan Province(Changtai yak，Jiulong yak and Maiwa yak)were used，Genomic DNA was extracted from the blood，and PCR-RFLP was employed to screen the possible occurrence of DUMPS.Ava I was used to digest PCR product generated by amplification of genomic DNA using DUMPS specific primers，and the genotypes were visualized according to the sizes of the fragments.The results showed that no carrier of DUMPS was found among the 100 yaks examined，normal homozygous DUMPS allele exhibited three fragments.

yak；deficiency of uridine monophosphate synthase；PCR-RFLP

S823；S852.23

A

2095-4271(2015)04-0403-04

10.11920/xnmdzk.2015.04.002

2015-05-04

鄭玉才(1965-)，男，內(nèi)蒙古人，教授，博士，研究方向:高原動物生化與分子遺傳；E-mail:yucaizheng＠hotmail.com.

國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(編號:201203010)