劉芳，趙金紅，朱明慧，甘芝霖，倪元穎

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083）

多酚氧化酶結(jié)構(gòu)及褐變機理研究進(jìn)展

劉芳，趙金紅，朱明慧，甘芝霖，倪元穎*

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083）

多酚氧化酶（polyphenoloxidase，PPO，EC.1.10.3.1）是動物、植物、真菌體內(nèi)普遍存在的一類銅結(jié)合酶。在有氧條件下，PPO果蔬原料中的內(nèi)源性多酚物質(zhì)氧化為醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)聚合產(chǎn)生黑色素，是引起果蔬褐變的主要因素。多酚氧化酶的催化性質(zhì)及活性抑制方面已經(jīng)做了大量研究，取得了一定成果。但其結(jié)構(gòu)（尤其是活性中心的結(jié)構(gòu)）與褐變機理一直未研究清楚，本文綜述了多酚氧化酶結(jié)構(gòu)及褐變機理方面的研究進(jìn)展，為這方面的研究工作提供參考。

多酚氧化酶；褐變；結(jié)構(gòu)；活性中心；機理

早在1883年，Yoghid發(fā)現(xiàn)日本漆樹樹汁變硬可能與某種活性物質(zhì)有關(guān)。1896年Betrand首次研究了這種物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)它是一種酶蛋白。1938年Keilin和Mann以及Kubowitz報道了多酚氧化酶的分離過程，為其性質(zhì)的研究打下了基礎(chǔ)[1]。隨著研究的深入，多酚氧化酶分為單酚單氧化酶（酪氨酸酶tyrosinase，EC. 1.14.18.1）、雙酚氧化酶（兒茶酚氧化酶catecholoxides，EC.1.10.3.2）和漆酶（laccase，EC.1.10.3.1）[2]?，F(xiàn)在所說的多酚氧化酶一般是兒茶酚氧化酶和漆酶的統(tǒng)稱。1998年，Klabunde等獲得了從甘薯中分離出的多酚氧化酶的結(jié)晶，揭示了其活性中心是由一個以二價銅為中心的羥基橋組成，其中每個二價銅copper（II）與三個組氨酸相連。這一發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了分子水平上的構(gòu)效關(guān)系模型的研究[3]。但由于多酚氧化酶的基因家族及其表達(dá)的復(fù)雜性，其反應(yīng)途徑、機理及其結(jié)構(gòu)方面的信息仍然很不完善。多酚氧化酶在果蔬保藏、咖啡等飲料的制作及植物生理方面都有著非常重要的作用，研究其性質(zhì)特點對實際生產(chǎn)有重要意義。而作用性質(zhì)是由結(jié)構(gòu)決定的，所以明確其結(jié)構(gòu)是研究其作用特性及反應(yīng)機理的根本。近年來，國外對多酚氧化酶結(jié)構(gòu)的模擬探索逐漸深入，國內(nèi)這方面的研究較淺較缺乏，缺乏對其結(jié)構(gòu)信息的探索及總結(jié)。

1 PPO的一級結(jié)構(gòu)

PPO通常先以無活性的前體形式存在。前體由N-端導(dǎo)肽、中間高度保守的Cu原子結(jié)合區(qū)和C-端疏水區(qū)3部分組成。PPO的Cu原子結(jié)合區(qū)是該酶的主要功能區(qū)，其他部分則對酶的構(gòu)象、高級結(jié)構(gòu)的形成和維持起作用[4]。中間高度保守的Cu原子結(jié)合區(qū)富含His殘基，每個Cu與3個His殘基以配位鍵相連，形成了有特定三維結(jié)構(gòu)的活性部位[1]。Hernandez-Romero等（2006）從Ralstonia中分離出了一種酪氨酸酶，發(fā)現(xiàn)存在第7個組氨酸與Cu原子相連。大多數(shù)植物的PPO與細(xì)菌、真菌和哺乳動物酪氨酸酶相同，具有2個Cu原子結(jié)合區(qū)域（CuA和CuB）。其中CuA的保守性（92%～94%）要大于CuB（60%～82%）。也有人提出了第3個Cu結(jié)合區(qū)域，它富含His，CuA與PPO的水溶性有關(guān)，CuB是底物的連接位置，CuC則與分子氧相連，CuA—CuB彼此相互影響，CuB—CuC在空間相連，從而使酶整體具有活性[5]。

研究工作者在氨基酸序列方面做了大量研究工作。結(jié)構(gòu)方面，PPOs不僅在氨基酸序列方面存在差異性，在其高度保守的活性中心氨基酸特征也存在差異[1]。Gerdemann C（2002）[6]比較了甜土豆中的兒茶酚酶、鏈孢霉菌中酪氨酸酶、淡青鏈霉菌酪氨酸酶、黑腹果蠅中酚氧化酶的前體、lpHC，馬蹄蟹中血藍(lán)蛋白和大章魚血藍(lán)蛋白幾種多酚氧化酶的2個Cu結(jié)合區(qū)域的氨基酸序列，如圖1所示。

圖1 幾種多酚氧化酶中與Cu原子結(jié)合的氨基酸序列[6]Fig.1 Sequence alignment of the copper-coordinating regions of the type-3 copper proteins.

ibCO為甜土豆兒茶酚酶（Ipomoea batatas）；hsTYR為人類酪氨酸酶；ncTYR為鏈孢霉菌酪氨酸酶；sgTYR為淡青鏈霉菌酪氨酸酶；dmProPO為黑腹果蠅酚氧化酶前體；lpHC為馬蹄蟹血藍(lán)蛋白；odgHC為大章魚血藍(lán)蛋白。兒茶酚氧化酶和軟體動物血藍(lán)蛋白酶都有Cys-His二硫，但是節(jié)肢動物血藍(lán)蛋白酶沒有。與CuB結(jié)合的氨基酸序列結(jié)構(gòu)大多相同，具有參與底物脫質(zhì)子反應(yīng)殘基E236，但節(jié)肢動物的血藍(lán)蛋白酶不具備該結(jié)構(gòu)；而CuA結(jié)構(gòu)有很大不同：雖然一般都具有H88和H118，但是第3個His常常有所差異。不同種植物，比如菠菜、梨、桃、蠶豆、胡蘿卜、馬鈴薯、番茄、葡萄和蘋果，它們的PPO具有高度的相似性（45%～95%）[7]。

圖2 富士蘋果與葡萄、白楊、番茄及土豆的PPOs氨基酸序列比較。框中部分是CuA與組氨酸殘基結(jié)合區(qū)域，CuA，CuB and CuC組氨酸殘基用著重號（*）標(biāo)出Fig.2 Comparison of the derived amino acid sequences of the Fujiapple PPOs with the PPO proteins from grape berry，poplar，tomato and potato

不同種植物，比如菠菜、梨、桃、蠶豆、胡蘿卜、馬鈴薯、番茄、葡萄和蘋果，它們的PPO具有高度的相似性。圖2比較了富士蘋果與幾種植物得氨基酸序列。整個氨基酸序列中，N-導(dǎo)肽與C-端保守性較低，而CuA與CuB區(qū)域比較保守。蘋果PPOs氨基酸有43%～58%與其他植物PPOs一致，包括番茄、土豆、蠶豆、葡萄、杏及白楊。蘋果的PPOs與其他植物的相似度為：杏（58%），葡萄（50%）和白楊50%。在這些相似片段中，存在2個高度保守的包括組氨酸殘基的氨基酸序列：銅離子結(jié)合區(qū)，（CuA和CuB框中的部分）。富士PPOs的CuA區(qū)與杏、葡萄及白楊的CuA區(qū)相似度分別為88%，75%及77%。CuB為80，73及77%。同時發(fā)現(xiàn)，在蘋果PPOs C端存在一個組氨酸殘基的Cu離子結(jié)合區(qū)。同樣的，在番茄、土豆及蠶豆中也都存在這樣的區(qū)域（CuC，如圖2所示）[7]。

2 多酚氧化酶的高級結(jié)構(gòu)

因為PPO分離純化及結(jié)晶的難度較大，以及其存在的廣泛性和復(fù)雜性，其高級結(jié)構(gòu)至今仍未解開。但研究普遍認(rèn)為其三級結(jié)構(gòu)與血藍(lán)蛋白的結(jié)構(gòu)相似。Gerdemann和Eichen（2002）比較了馬鈴薯PPO與章魚HC時發(fā)現(xiàn)，成熟的PPO三維結(jié)構(gòu)與HC（hemocyanin）很相似，但HC比PPO要多1個富含His的C-端，PPO的C-端只在前體中存在，他們推測馬鈴薯PPO的C-端可能與其三維結(jié)構(gòu)的形成以及其酶的活性有關(guān)，并且能與Cu結(jié)合[4]。其C端與軟體動物的血藍(lán)蛋白具有同源性[8]。節(jié)肢動物的血藍(lán)蛋白結(jié)構(gòu)與酪氨酸酶結(jié)構(gòu)比較，如圖3所示。

圖3 （a）節(jié)肢動物的血藍(lán)蛋白[9]。區(qū)域II中包含著兩個Cu原子（綠色的圓球形）；（b）鏈霉菌屬castaneoglobisporus酪氨酸酶與球蛋白ORF378結(jié)合后的整體結(jié)構(gòu)[1]。酪氨酸酶用紅色表示，ORF 378蛋白用藍(lán)色表示。銅離子用綠色表示。Fig.3（a）Arthropod hemocyanin.Domain II（red）carries the active site with the two Cu atom s（green）.（b）Overall structure of the tyrosinase from Streptomyces castaneoglobisporus，complexed with a“caddie”protein，ORF378.The tyrosinase is shown in red and the ORF 378 in blue.Copper atoms are shown as green spheres

彭益強等（2012）[10]研究了溴乙酸、乙酰丙酮、N-溴代琥珀酰亞胺、1，4-二硫代蘇糖醇和對氯汞苯甲酸等具有相對專一性的氨基酸基團(tuán)修飾劑，研究PPO的酶活性中心必需基團(tuán)，結(jié)果表明富士蘋果中的PPO蛋白結(jié)構(gòu)中酶活性中心必需基團(tuán)有組氨酸的咪唑基、精氨酸的胍基與色氨酸殘基。Hernández-Romero D（2006）從R.solanacearum中分離出2種主要的具有酚酶特性的蛋白質(zhì)：NP_518458與NP_519622。

根據(jù)Gerdemann等描述的兒茶酚酶的結(jié)構(gòu)構(gòu)造了6個銅原子與組氨酸殘基組合的基本結(jié)構(gòu)，如圖4所示。

圖4 兩種PPOs活性中心的構(gòu)象[11]Fig.4 A plausible scheme for the conformation of the active site for the two PPOs

兩者存在2點不同，第一，在H3B前面的殘基，在NP_518458中是H，而在NP_519622中是L。第二，在與甘薯兒茶酚酶第F261對應(yīng)的位置，在NP_518458中是A，在NP_519622中是I[11]。NP_519622中有1294個基因，一個龐大的非芳香族的殘基基團(tuán)。隨后是一個緊湊的P295殘基基團(tuán)。這個蛋白具有較低的單酚氧化酶活性。而NP_51845只含有一個很小的基團(tuán)A241，同時表現(xiàn)出高酪氨酸羥化酶的活性。

Eicken C（1999）[12]發(fā)表了經(jīng)過計算機軟件SwissPdbViewer和POV-Ray處理的甘薯兒茶酚酶的活性中心示意圖。甘薯兒茶酚酶分子量為39 KDa，大小為55×45×45?橢球形單體?；钚灾行膬蓚€Cu（II）–Cu（II）相距2.5?。其二級結(jié)構(gòu)主要是α-螺旋，活性中心主要包括4個與中心的銅離子結(jié)合的α-螺旋結(jié)構(gòu)α2、α3、α6和α7；外面被兩個α-螺旋（α1和α4）和幾個β折疊；兩個維系N-端蛋白的Loop結(jié)構(gòu)（氨基酸1-50）與α-螺旋結(jié)構(gòu)相連的二硫鍵C11-C28和C27-C89）以及活性配體殘基（比如控制底物接近速度的Phe（F261））。

PPO通常是一種由4個亞基組成的寡聚蛋白質(zhì)，如薯蕷皂小球莖PPO和萵苣的PPO；但大白菜、香草中PPO則是由3個亞基聚合形成；蘑菇的兒茶酚氧化酶則是一種多聚酶，分重鏈（43 kDa）和輕鏈（13.4 kDa）；從甲殼類動物中分離出的酪氨酸酶在體外是以6聚體的形式存在，每個亞基分子量為71 kDa[13]。Han-Ju S（2012）[14]從油菜花中分離得到的多酚氧化酶分子量為60.4 kDa，以二聚體形式存在。甜菜根和香蕉果肉中的PPO卻是單體酶[15]。

3 酶促褐變機理

酶促褐變只在多酚氧化酶、多酚類底物、氧3個條件同時具備時才可能發(fā)生。不同品種、不同成熟度的果蔬的多酚類物質(zhì)含量不同，多酚氧化酶的含量、種類也不同，導(dǎo)致酶促褐變機制不同。圖5所示為Gerdemann C等[6]在前人研究的基礎(chǔ)上提出的酶促褐變的反應(yīng)機理。

圖5 甲酚酶以及兒茶酚氧化酶催化反應(yīng)機理Fig.5 Mechanism of cresolase and catecholase activity of TYR and/or CO.

盡管3個Cu結(jié)合區(qū)域具有相似的結(jié)構(gòu)（與3個組氨酸參加相連），但是3個Cu活性卻不同[16]。Chazarra等研究萵苣PPO活性發(fā)現(xiàn)，PPO的酶促反應(yīng)呈S型曲線，反應(yīng)速度與酶的純度、底物的濃度成正比，而隨著反應(yīng)的進(jìn)行，PPO會緩慢的變構(gòu)成一個更適應(yīng)于底物結(jié)合、有更高催化活性的寡聚酶[4]。Matoba Y（2006）發(fā)現(xiàn)多酚氧化酶的活性中心在反應(yīng)過程中是變化的[17]。當(dāng)鄰苯二酚等底物存在時，由于其“靠近”及“定向”效應(yīng)，使多肽鏈和底物的空間構(gòu)象發(fā)生改變，相互契合，從而使底物進(jìn)入活性中心，鄰苯二酚基上的2個羥基與多肽鏈上的氨基酸殘基以氫鍵相連，形成酶與底物的復(fù)合物，由于復(fù)合物的不穩(wěn)定性，多肽鏈構(gòu)象發(fā)生扭曲，氫鍵斷裂，H被附著在多肽鏈上，酶與底物不再契合，兩者都同時發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變，于是產(chǎn)物脫離了活性部位，成為鄰醌。鄰醌可發(fā)生一系列次生氧化作用，形成了多種氧化產(chǎn)物。酶再通過脫氫作用，發(fā)生構(gòu)象回轉(zhuǎn)，恢復(fù)以前的天然構(gòu)象，重新成為具有催化能力的蛋白質(zhì)[15]。而且多酚氧化酶可與離子形成配體，從而對其活性產(chǎn)生影響。

國內(nèi)外有關(guān)褐變機理主要3種假說：酚酶區(qū)域分布假說、自由基傷害假說、保護(hù)酶系統(tǒng)假說。目前國內(nèi)外比較接受的是酚、酚酶的區(qū)域性分布假說。

3.1 酚酶區(qū)域分布假說

PPO在組織細(xì)胞內(nèi)存在2種形式，一種呈游離態(tài)（FPPO）存在于細(xì)胞質(zhì)中，具有催化活性；一種呈結(jié)合態(tài)（BPPO）束縛于細(xì)胞膜上。一旦細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞發(fā)生變化后，BPPO便游離出來，向FPPO轉(zhuǎn)化，F(xiàn)PPO活性顯著提高，表現(xiàn)PPO和酚類物質(zhì)的區(qū)催化活性[18]。切分、高溫等脅迫條件引起膜系統(tǒng)的破壞，從而打破了區(qū)域化分布，使酶和底物相互接觸而引起果蔬褐變[19]。褐變多發(fā)生在較淺色的水果和蔬菜中，如蘋果、香蕉、杏、櫻桃、葡萄、梨、桃、草莓和土豆等，在組織損傷、削皮、切開時，細(xì)胞膜破裂，相應(yīng)的酚類底物與酶接觸，在有氧情況下，發(fā)生酶促褐變。通常PPO是以非活性態(tài)存在于類囊體中，而它的酚底物在液泡中，這種空間隔離只有被打破，PPO才表現(xiàn)出酶活性[4]。Mishra BB（2012）[20]利用掃描電鏡和熒光顯微鏡證實了這一點。

3.2 自由基傷害假說

自由基襲擊生物大分子和膜脂，會導(dǎo)致膜脂過氧化加劇，膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的破壞，膜透性增大，進(jìn)而導(dǎo)致代謝障礙和膜系統(tǒng)的破壞和解體。正常情況下，由于機體內(nèi)存在防御系統(tǒng)，故自由基代謝保持平衡。但在干旱、高鹽分、SO2、O3、低溫或水分虧缺時，由于自由基產(chǎn)生過多，此時活性氧的產(chǎn)生和清除平衡體系被打破，會導(dǎo)致植物細(xì)胞受到傷害，從而引起褐變的發(fā)生[21]。

3.3 保護(hù)酶系統(tǒng)假說

通常情況下，植物組織中有較高的還原勢，正常的氧化還原代謝平衡使氧化形成的醌類物質(zhì)通過還原氧化或轉(zhuǎn)化而未聚和。保護(hù)酶系統(tǒng)包括2類物質(zhì)：一是氧化酶系統(tǒng)，主要有超氧化歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等，它們可以清除自由基、活性氧，以防止其對細(xì)胞膜的攻擊，防止膜脂過氧化；二是抗氧化酶系統(tǒng)，主要有谷胱甘肽還原酶、抗壞血酸、VE，類胡蘿卜素、細(xì)胞色素f等，它們能清除自由基和活性氧，也可以作為抗氧化劑，對酚類物質(zhì)的氧化起抑制作用。在逆境下，超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶三者作用失調(diào)，導(dǎo)致H2O2積累，從而引起褐變的發(fā)生[22]。

4 影響褐變差異的因素

4.1 PPO基因家族差異性

PPO由多個基因編碼，表現(xiàn)出多基因家族性，有4個～8個基因[23-25]。但Dry和Robinson卻發(fā)現(xiàn)在葡萄藤中只存在一種PPO基因[1]。Shetty SM（2011）[24]發(fā)現(xiàn)即使在同一個物種中PPO基因也存在很多個亞型。茄子中有6個PPO基因家族（PPO1-6）。Mishra BB（2013）[26]發(fā)現(xiàn)在8中茄子品種中有36個相似的氨基酸殘基。番茄有7個編碼PPO的核基因（PPOA、A′、B、C、D、E、F），串連分布于8號染色體2.2 cM（約1 650 kb）的區(qū)域內(nèi)，其中PPOE、F，PPOB、D、A集中分布在12.4 kb的區(qū)域[27]。馬鈴薯的P1和P22個PPO基因定位在8號染色體分子標(biāo)記CD60與TG216之間。Winters A（2009）[28]發(fā)現(xiàn)紅三葉草中存在至少有6個基因組，其中的3個基因組具有高度同源性。CaiY（2013）[29]研究發(fā)現(xiàn)2個基因型（BTx623和HN16）的高粱中存在8個不同的基因組SbPPO1–SbPPO8。這8個基因型定位在高粱的第3染色體（SbPPO1和SbPPO2），第6染色體（SbPPO3，SbPPO4），第7染色體（SbPPO5-SbPPO7），及第10染色體（SbPPO8）上，并且分別包含0個（SbPPO6-SbPPO8），1個（SbPPO1，SbPPO2，SbPPO5）及2個（SbPPO3，SbPPO4）內(nèi)含子。

4.2 PPO基因表達(dá)的差異性

多酚氧化酶能化酚類化合物選擇性的羥基化生成鄰苯二酚并進(jìn)一步氧化脫氫生成鄰苯醌。醌類物質(zhì)是合成某些重要生物物質(zhì)的中間體，如動物的黑色素（melanin）、植物的木多糖及昆蟲的殼硬蛋白等，與植物的自我保護(hù)系統(tǒng)相關(guān)。Bhonwong A（2009）[33]發(fā)現(xiàn)番茄的PPOs主要分布于番茄的根、莖、葉、花等幼嫩易受出現(xiàn)病害易受到蟲咬的部位。植物中多酚氧化酶基因存在2類，一類是常規(guī)表達(dá)的基因，另一類則只在有誘因，如環(huán)境脅迫、病原體侵入、動物啃食、受到損害等誘導(dǎo)時表達(dá)，表達(dá)后多酚氧化酶可生成黑色素，更有效的抵擋外界的不利因素的侵害。

PPO基因的表達(dá)比較復(fù)雜。不同種植物、同一植物體的不同部位及同一部位的PPO多基因家族表達(dá)的種類及表達(dá)的量都不同[4，6]。Mishra BB（2013）[26]研究了8種茄子的多酚氧化酶活性，發(fā)現(xiàn)其多酚氧化酶各不相同。杏果實PPO的前體Mr為67.1 kDa，成熟PPO的Mr為56.2kDa；葡萄漿果PPO前體的Mr為67kDa，成熟PPO的Mr為40 kDa；番茄中PPO前體的Mr約為67 kDa，成熟的PPOMr為57 kDa～62 kDa；菠菜葉PPO的前體Mr為64 kDa，成熟PPO的Mr為42.5 kDa[15]。蘋果中PPODNA經(jīng)克隆并在E.coli中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PPO含有一段轉(zhuǎn)運蛋白，成熟Mr為56 kDa。雖然用抗體可在E.coli中檢測到PPO的表達(dá)，卻檢測不到酶活[1]。

在植物不同生長期間，PPO表達(dá)也存在差異。在蘋果開花期間存在2種不同的基因表達(dá)，一種只在開花后表達(dá)。但是兩種基因氨基酸序列存在55%的一致性。Bhonwong A（2009）[30]報道在成熟的蘋果中存在兩種PPO蛋白：APO5和MD-PPO2。2種蛋白分別由504和493氨基酸殘基組成，預(yù)測分子量為56.3、55.4 kDa。在咖啡的種子和葉子中，以及寄生植物菟絲子中，白菜中均發(fā)現(xiàn)存在2種不同的PPO[1]。

同一品種植物PPO的同工酶也存在差異。侯召華（2007）[31]報告不同品種蘋果的PPO同工酶酶帶不同，富士酶帶數(shù)最多，有4條酶帶（El，E2，E3，E4），高酸蘋果45號和54號只有1條共有酶帶。E3和E4為富士所特有的酶帶。

4.3 PPO催化特性的差異

因品種、產(chǎn)地等的不同，PPO酶學(xué)特性也大不相同。PPO作用的底物有兒茶酚、花色素、綠原酸、咖啡酸、黃酮醇等。研究者對不同品種的蘋果PPO活性做了大量研究分析。田蘭蘭等（2011）[32]以富士蘋果為原料，從中提取多酚氧化酶粗提液，通過底物篩選，從不同的pH、溫度和抗氧化劑對PPO酶的影響等方面進(jìn)行研究。結(jié)果表明，PPO酶對4種底物催化活性不同，由高到低的順序依次為：鄰苯二酚，DL-半胱氨酸，苯甲酸，山梨酸；PPO酶的最適pH為5.0，最適溫度30℃，最佳酶濃度0.25mol/L，最佳底物濃度0.6mol/L；當(dāng)VC濃度達(dá)到150mmol/L，90%的PPO酶活性被抑制。王瓊波等（2011）[33]從嘎拉蘋果中提取多酚氧化酶（PPO），對其最適反應(yīng)pH、最適反應(yīng)溫度、熱穩(wěn)定性進(jìn)行研究，結(jié)果表明：嘎拉蘋果PPO的最適反應(yīng)pH值為6.0，最適反應(yīng)溫度是45℃，在80、90、100℃分別處理280、240、200 s時完全失活。Palma-Orozco G（2011）[34]從馬曼果中分離出2種同工酶：PPO1和PPO2，分子量分別為16.1和18 kDa，且電泳結(jié)果表明其為單聚體。PPO1最適pH為7，最適溫度是35℃。Rahman ANF（2012）[35]從花椰菜中分離出一種多酚氧化酶，其氧化間苯三酚的Km為3.3mM，最適pH 8.0，且在pH 3.0～11.0范圍內(nèi)可穩(wěn)定20 h。最適溫度為55℃。Han-Ju S（2012）[14]從油菜花中分離出的多酚氧化酶最適pH 5.5，且在pH 3.5～5.5較為穩(wěn)定。在60℃～70℃之間活性較為穩(wěn)定，在80℃～90℃之間易失活。

5 展望

盡管前人已做了大量的工作，至今仍有許多問題不清楚，如PPO的底物特異性是否更強（與現(xiàn)有結(jié)果相比）；PPO的亞細(xì)胞定位；PPO活性與前體的酶解的聯(lián)系，其激活機制；Cu2＋是否與PPO前體和中間體結(jié)合，是否參與了PPO的轉(zhuǎn)運；在催化反應(yīng)中活性中心的Cu2＋是否變價及其在生物方面的功能等，這些都是今后將要深入研究的方向。通過對PPO結(jié)構(gòu)及基因的進(jìn)一步研究，在特定的器官和組織中選擇調(diào)節(jié)PPO表達(dá)，使PPO對植物體可消費部分褐變的影響降至最低，在植物體其他部分大量表達(dá)PPO基因減少食草類的侵害，通過轉(zhuǎn)基因的方法來調(diào)節(jié)PPO基因的表達(dá)將是未來研究熱點。

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Advances in Research of the Structure and Browning Mechanism of Polyphenol Oxidase

LIU Fang，ZHAO Jin-hong，ZHU Ming-hui，GAN Zhi-lin，NI Yuan-ying*
（College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing100083，Chian）

Polyphenol oxidases（PPO，EC.1.10.3.1），found in bacteria，fungi and plants，belongs to the class of type 3 copper proteins that catalyze the oxidation of o-diphenols（catechols）to the corresponding o-quinones in the presence of oxygen.o-Quinones will then undergo spontaneous polymerization，which produces melanin，the pigment with high molecular weight and dark in color.It is believed to be the primary response for the deleterious browning of many fruits and vegetables.Although lots of research on the properties and the inhibition of its activity has been done，its structure（especially the structure of the active center）and the mechanism of browning was unclear.The present review attempts to highlight the recent advances in research of the structure and the mechanism of browning.

polyphenol oxidase；browning；structure；the active center；mechanism

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.06.032

2013-10-24

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD31B00）

劉芳（1984—），女（漢），博士，研究方向：蘋果漿褐變機理及分子調(diào)控。

*通信作者：倪元穎（1960—），女（漢），教授，主要從事果蔬加工天然產(chǎn)物提取、功能食品開發(fā)。