黃晨，吳冬雪，王禹，張俊哲，柴銘駿，董志珍，趙祥平

（天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測中心，天津300461）

鹽酸克倫特羅酶標(biāo)抗原的制備及鑒定

黃晨，吳冬雪，王禹，張俊哲，柴銘駿，董志珍，趙祥平

（天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測中心，天津300461）

選取辣根過氧化物為抗原標(biāo)記酶，采用重氮化法將鹽酸克倫特羅CLEN分別與牛血清蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）偶聯(lián)，合成包被抗原和免疫原，并通過紫外光譜掃描（UV）、SDS聚丙烯酞胺凝膠電泳法驗(yàn)證偶聯(lián)成功。這為下一步獲得針對鹽酸克倫特羅類特異性單克隆抗體制備及其相應(yīng)食品安全檢測試劑盒開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

鹽酸克倫特羅；重氮化法；ELISA

鹽酸克倫特羅（clenbuterol，CLEN）俗稱瘦肉精，化學(xué)名稱為羥甲叔丁腎上腺素，是β-腎上腺素受體激動(dòng)劑（簡稱β-激動(dòng)劑）的一種，曾作為生長促進(jìn)劑在畜牧業(yè)中應(yīng)用，長期使用后，在動(dòng)物體內(nèi)形成積累性殘留[1]，人食用殘留該物的肉品就會(huì)引起神經(jīng)過敏、心跳過速等急性中毒癥狀[2]，因此該藥物被我國明令禁止使用[3]。但因其能有效地促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和肌肉組織生長，減少脂肪尤其是皮下脂肪的沉積，降低胴體脂肪含量，提高瘦肉率[4]和飼料轉(zhuǎn)化率，具有一定的經(jīng)濟(jì)效益。因此，一些不法分子不顧消費(fèi)者的健康安全，仍將其利用于畜牧生產(chǎn)中[5]。我國農(nóng)業(yè)部1997年3月[農(nóng)牧發(fā)（1997）]3號(hào)文嚴(yán)令禁止β-激動(dòng)劑在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用，農(nóng)業(yè)部176號(hào)公告《禁止在飼料和動(dòng)物飲水中使用的藥物品種目錄》規(guī)定了β-激動(dòng)劑類不能在飼料和飲水中使用，中華人民共和國農(nóng)業(yè)部第193號(hào)公告中將鹽酸克倫特羅列為違禁藥品。CLEN在我國的非法使用屢禁不絕，從2000年～2001年浙江和廣東等地有近2000多人因食用含有CLEN殘留的動(dòng)物性食品而出現(xiàn)中毒，這不僅直接影響了我國在畜產(chǎn)品上出口的競爭力，而且也嚴(yán)重威脅到人民的健康安全。建立有效的殘留監(jiān)督檢測體系、提高人們對CLEN中毒危害的認(rèn)識(shí)是治理其非法使用的有效措施。為了配合、貫徹執(zhí)行我國政府的禁令，深入了解鹽酸克倫特羅在動(dòng)物體內(nèi)的代謝、吸收、殘留消除特點(diǎn)及其檢測方法具有重要意義。

目前，針對鹽酸克倫特羅的檢測方法主要有化學(xué)分析法、色譜技術(shù)、毛細(xì)管電泳、免疫分析技術(shù)和生物傳感器技術(shù)[6]。鹽酸克倫特羅是一種半抗原，只有通過和其他分子量較大的載體蛋白偶聯(lián)以后才能作為免疫原，并借助載體蛋白的T細(xì)胞表位產(chǎn)生特異性抗體，所以鹽酸克倫特羅人工抗原合成是ELISA檢測技術(shù)的關(guān)鍵[7]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 試劑

鹽酸克倫特羅純度高于99%；辣根過氧化物酶（HRP），為上海東風(fēng)生物科技有限公司產(chǎn)品；NaIO4、（1∶100）乙二醇溶液、硼氫化鈉（NaBH4/NaBH3CN）、亞硝酸鈉、鹽酸等，均為分析純；牛血清白蛋白（BSA）、雞蛋白蛋白（OVA）；試驗(yàn)用水為雙蒸去離子水。

1.1.2 儀器

天平（上海精科）；酶標(biāo)儀（BIO-TEK）；雙重水蒸餾器（華奧）；磁力恒溫?cái)嚢杵鳎ㄉ虾Ｋ緲罚?；紫外掃描儀（島津）；可見分光光度計(jì)（精科）；搖床；電泳儀（Biochrom）。

1.2 方法

1.2.1 酶結(jié)合物的制備

酶結(jié)合物的制備是以過碘酸鈉法將HRP（辣根過氧化物酶）同抗鹽酸克倫特羅抗體的抗體（二抗）結(jié)合[8]。HRP經(jīng)NaIO4氧化后形成的醛化酶可與抗體分子的氨基相連，形成斯夫氏鹼，然后再與二抗上的氨基相結(jié)合形成酶結(jié)合物（酶標(biāo)記物）。該方法所獲酶結(jié)合物的產(chǎn)率高，酶與二抗的活性無重大損失，是目前最常用的方法。

標(biāo)記流程：

1）HRP 10mg加水1mL，10mg/mL，混勻。

2）加新配過碘酸鈉（0.06mol/L）1mL，混勻，4℃，30min，避光，呈黑綠色。

3）加入0.16mol/L（1∶100）乙二醇溶液1mL，20℃～25℃30min，避光，呈棕色。

4）加入二抗10mg，裝入透稀袋中，攪拌結(jié)合或不攪拌，（抗體事先用0.05mol/L pH9.6 CB液平衡）用0.05mol/L pH9.6CB液1 000mL透稀，過夜，使抗體與酶充分結(jié)合，中間換液一次。

5）取出透析袋，向袋內(nèi)加入硼氫化鈉（NaBH4/NaBH3CN）0.4mL，混勻，4℃，2 h。

6）透稀除鹽，0.02mol/LPBSpH7.2。

7）加入優(yōu)質(zhì)甘油50%保存酶結(jié)合物。

1.2.2 重氮法制備CLEN-BSA偶聯(lián)蛋白質(zhì)

免疫原和包被原的制備原理簡述：鹽酸克倫特羅為小分子化合物，僅具有反應(yīng)原性而缺乏免疫原性，屬半抗原。半抗原與載體蛋白偶聯(lián)形成的偶合物，不僅具有免疫原性，而且有其本身特異的反應(yīng)原性。將鹽酸克倫特羅抗原與載體蛋白BSA/OVA，通過重氮法使CLEN與BSA/OVA偶聯(lián)合成免疫抗原CLENENOVA和包被原CLENEN-BSA，才能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，其具體合成路線如下[9]。

1）CLEN的偶氮化[10-13]

從10mg/mlCLEN貯備液中取5mL液體于試管中，用1.0mol/LHCI鹽酸調(diào)至pH2.5，置于冰箱內(nèi)，另從亞硝酸鈉貯備液中取2.0m l液體放冰箱內(nèi)，待以上兩液體預(yù)冷至4℃后，在4℃陰暗避光的環(huán)境下將亞硝酸鈉溶液逐滴加入CLEN溶液中，邊加邊搖動(dòng)，加完后置于4℃冰箱陰暗處孵育lh，取出滴加2～3滴氨基磺酸鹽溶液，除去游離的亞硝酸鈉，以上操作均在4℃陰暗環(huán)境下進(jìn)行，最后量出溶液體積，計(jì)算溶液中CLEN的濃度。

2）偶氮化CLEN與載體蛋白的偶聯(lián)

將在預(yù)冷的鹽酸和亞硝酸鈉溶液中偶氮化后的CLEN，按20∶1摩爾比例，慢慢滴入BSA溶液，加完后用0.25mol/mLNaoH調(diào)至pH7.5，并在4℃冰箱陰暗處孵育24 h。隨后將其在4℃冰箱中用PBS（0.01mol/L，pH.7.2）連續(xù)透析7 d，期間多次換液，最后冷凍干燥保存。

同法合成CLEN-OVA。

1.2.3 CLEN-BSA免疫原的鑒定

1）紫外分光光度計(jì)法

用生理鹽水精確配制CLEN與BSA的標(biāo)準(zhǔn)溶液。稱取一定量的CLEN-BSA溶于生理鹽水中，用Broaford法測其蛋白質(zhì)的濃度。根據(jù)此濃度調(diào)整CLEN-BSA溶液中蛋白質(zhì)的濃度使其與BSA一致。用Uv3000紫外掃描儀，在波長為（200 nm～360 nm）的范圍內(nèi)分別進(jìn)行掃描。代入?yún)⒖嘉墨I(xiàn)[14]公式，計(jì)算出CLEN-BSA的偶聯(lián)率。

2）SDS聚丙烯酞胺凝膠電泳法[14-16]

其原理是蛋白質(zhì)分子在凝膠中的遷移率與其分子質(zhì)量成反比，分子質(zhì)量越大的蛋白質(zhì)分子遷移率越小[17]。

按垂直平板電泳10%凝膠配方在模具中灌注分離膠后，小心地在分離膠表面加一層水封住膠面，放置1小時(shí)后，吸掉水，灌注濃縮膠，插入適當(dāng)?shù)氖嶙臃胖?小時(shí)后拆去梳子備用，選擇CLEN-BSA作為鑒定樣品，從1mg/mL的CLEN-BSA溶液中吸取1μL加入等量的樣品緩沖液，100℃水浴30min后加樣，同時(shí)以BSA作為對照進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)染色，用脫色液在脫色搖床上脫色，最后照相分析結(jié)果。

3）間接ELISA法鑒定

將CLEN-BSA稀釋成一定的濃度，0.1、0.5、1、5、10μg/mL，100μL/孔，4℃過夜，將1%BSA+10%sucrose封閉液加入酶標(biāo)板，100μL/孔，37℃溫育2 h，將孔內(nèi)液體甩干，用吸水紙拍干。加入倍比稀釋的抗CLEN單克隆抗體，抗體稀釋比例為1∶1 k、1∶5 k、1∶10 k、1∶50 k、1∶100 k，25℃避光環(huán)境中反應(yīng)30min，加入100μL每孔顯色液3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB），15min后顯色，最后每孔加入50μL濃度為2mol/L的H2SO4終止液終止反應(yīng)。設(shè)定酶標(biāo)儀用雙波長450/630 nm檢測，測定每孔OD值。以上每一步加樣后，都經(jīng)過多次振蕩后洗滌。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外掃描

紫外掃描光譜結(jié)果見圖1。

圖1 CL、BSA及CLEN-BSA紫外掃描圖Fig.1 Ultraviolet spectrum of CL，BSA，CLEN-BSA

由此可知，BSA、CLEN—BSA最大吸收波長都為279 nm，盡管CLEN-BSA溶液中蛋白質(zhì)的濃度與BSA溶液相同，CLEN-BSA的吸光度卻明顯比BSA的高，同時(shí)可見CLEN—BSA的紫外吸收曲線與BSA和CLEN的紫外吸收曲線相比發(fā)生明顯變化。當(dāng)偶合物吸收曲線與半抗原和載體的吸收曲線不同時(shí)，可間接說明偶聯(lián)成功。根據(jù)公式（1）計(jì)算得出CLEN-BSA的偶聯(lián)率為17[20]。同理由CLEN、OVA偶聯(lián)得CLEN-OVA紫外吸收曲線的對比可定性證明CLEN-OVA偶聯(lián)成功。

2.2 SDS-PAGE電泳圖分析

電泳圖結(jié)果見圖2，CLEN-BSA和CLEN-OVA電泳條帶與BSA、OVA條帶相比稍寬且有明顯的滯后，說明載體蛋白連接了鹽酸克倫特羅小分子，進(jìn)一步證明鹽酸克倫特羅與載體蛋白均偶聯(lián)成功。

2.3 間接ELISA法鑒定結(jié)果

圖2 SDS-PAGE電泳圖Fig.2 SDS-PAGEElectrophoresis

從間接ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看到，在相同包被濃度的前提下，隨著抗體稀釋度增加，吸光度值變小，而相同稀釋度情況下，隨著包被量濃度增加，吸光度值增加，說明了CLEN-BSA免疫原的合成，具體情況見表1。

表1 間接抑制ELISA吸光度值Table1 Absorbency of indirect inhibited ELISA

3 結(jié)論

ELISA法用于動(dòng)物性食品中藥物殘留的檢測，是基于抗原抗體特異性的免疫反應(yīng)與傳統(tǒng)的色譜分析技術(shù)相比，具有選擇性好，靈敏度高，操作簡便，易于商品化，對操作者的專業(yè)要求比較低等優(yōu)點(diǎn)。關(guān)于人工抗原的合成，首先由Landsteinerder提出小分子半抗原與大分子載體交聯(lián)，合成完全抗原，用以研究抗原抗體反應(yīng)的特異性。

通過重氮化法，合成制備了免疫原和檢測原，經(jīng)紫外掃描計(jì)算得到偶聯(lián)比為17。CLEN-BSA與載體蛋白BSA在紫外掃描圖、SDS-PAGE圖上均有明顯區(qū)別，能夠證明CLEN與載體蛋白BSA偶聯(lián)成功。間接ELISA檢測證明CLEN-BSA免疫原的合成，下一步將用獲得的免疫原刺激小鼠產(chǎn)生針對CL的抗體，為下一步的單克隆抗體的制備和ELISA試劑盒的研究提供支持。

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Synthesis and Identification of Immunogen Clenbuterol

HUANG Chen，WU Dong-xue，WAN GYu，ZHANG Jun-zhe，CHAI Ming-jun，DONG Zhi-zhen，ZHAO Xiang-ping
（Animal&Plant&Foodstuffs Inspection Center，Tianjin Import&Export Inspection and Quarantine Bureau，Tianjin 300461，China）

Clenbuterol（CLEN）which was conjugated by horseradish peroxidase（HRP）was bound to bovine serum albumin（BSA）and ovalbumin（OVA）respectively by using diazotization，which aimed to synthesize artificial immunogenic antigen CLEN-BSA and artificial detection antigen CLEN-OVA.The results of UV scan，SDS-PAGE indicated that the artificial BSA and artificial detection antigen CLEN-OVA were synthesized successfully.The results demonstrated that the CLEN-BSA conjugate has immunogenicity which is good for next monoclonal antibody preparation and the research of ELISA kit.

clenbuterol hydrochloride；diazotion；ELISA

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.06.028

2014-05-08

黃晨（1983—），女（漢），獸醫(yī)師，碩士研究生，研究方向：食品安全。