劉桂清， 嚴　盈， 王玉生， 張桂芬， 萬方浩,5*

1中國農業(yè)科學院植物保護研究所，植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京100193； 2廣東省昆蟲研究所，

廣東省野生動物保護和利用公共實驗室，廣東省農業(yè)害蟲綜合治理重點實驗室，廣東 廣州 510260；

3Department of Entomology, North Carolina State University, Campus Box 7613, Raleigh, NC 27695-7613,

USA； 4Genetic Engineering and Society Center and W.M. Keck Center for Behavioral Biology,

North Carolina State University, Raleigh, NC 27695-7613, USA；

5青島農業(yè)大學農學與植物保護學院，山東 青島 266109

?

昆蟲種群遺傳控制技術中啟動子的研究

劉桂清1,2， 嚴盈1,3，4， 王玉生1， 張桂芬1， 萬方浩1,5*

1中國農業(yè)科學院植物保護研究所，植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京100193；2廣東省昆蟲研究所，

廣東省野生動物保護和利用公共實驗室，廣東省農業(yè)害蟲綜合治理重點實驗室，廣東 廣州 510260；

3Department of Entomology, North Carolina State University, Campus Box 7613, Raleigh, NC 27695-7613,

USA；4Genetic Engineering and Society Center and W.M. Keck Center for Behavioral Biology,

North Carolina State University, Raleigh, NC 27695-7613, USA；

5青島農業(yè)大學農學與植物保護學院，山東 青島 266109

摘要:利用昆蟲遺傳轉化技術對害蟲進行遺傳控制是害蟲防治研究的新方向，該技術具有物種特異、防效高且對環(huán)境友好的特點。啟動子是基因表達調控的重要元件，選擇合適的啟動子是外源基因高效、準確表達的關鍵，對獲得高效、穩(wěn)定的遺傳修飾昆蟲品系至關重要。本文簡要介紹了昆蟲基因啟動子的結構特征，重點描述了昆蟲種群遺傳防治中組成型啟動子、性別和組織特異型啟動子、特定發(fā)育時期啟動子和誘導型啟動子的研究和應用概況，并對這幾類啟動子在害蟲遺傳控制中的應用前景進行了展望。

關鍵詞:遺傳防治； 昆蟲不育技術； 遺傳轉化； 組成型啟動子； 特異性啟動子； 誘導型啟動子

Insect gene promoters used in insect population genetic control

Gui-qing LIU1,2, Ying YAN1,3，4, Yu-sheng WANG1, Gui-fen ZHANG1, Fang-hao WAN1,5*

1StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectPests,InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgricultural

Sciences,Beijing100193,China;2GuangdongKeyLaboratoryofIntegratedPestManagementinAgriculture,GuangdongPublic

基因的表達調控是分子生物學領域的熱門課題，可以分為轉錄水平調控、轉錄后水平調控、翻譯水平調控和蛋白質水平調控等。在特定的時間內，成千上萬的真核生物基因中，只有15%左右的基因能在特定的細胞中表達有功能的RNA與蛋白質等產物(Liang & Pardee,1992)。轉錄水平調控被認為是基因表達最重要的調控方式之一。基因的轉錄受啟動子和增強子等特定的順式作用元件(Cis-acting element)和蛋白質因子等具有可擴散特性的反式作用因子(Trans-acting factor)的影響。

昆蟲是地球上種類最多的物種，對昆蟲基因表達調控機理進行解析有助于害蟲防治策略的發(fā)展。自首例遺傳轉化果蠅誕生(Rubin & Spradling,1982)后，昆蟲遺傳轉化技術成為科學家研究的熱點，利用昆蟲遺傳轉化技術獲得遺傳修飾品系對害蟲進行遺傳控制是害蟲防治研究的新方向(Alphey & Andreasen,2002; Heinrich & Scott,2000; Horn & Wimmer,2003; Ogaugwuetal.,2013； Scheteligetal.,2009; Thomasetal.,2000)。對目標害蟲進行遺傳控制，需要將遺傳修飾昆蟲品系釋放到野外，品系中外源基因穩(wěn)定、高效且有目的性地表達至關重要，因此，選擇合適的昆蟲啟動子是建立遺傳修飾昆蟲品系首先要考慮的問題。目前，關于啟動子的結構及其對基因的轉錄調控研究已有一系列進展，許多啟動子得以鑒定并應用到害蟲遺傳控制中。本文將重點綜述啟動子在昆蟲遺傳控制中的研究及應用概況。

1　昆蟲啟動子結構特征

啟動子是指RNA聚合酶及一些反式作用因子識別并與之結合從而正確有效地起始轉錄的一段特異性DNA序列。真核生物有3種RNA聚合酶，每一種都有自己特定的啟動子類型。RNA聚合酶Ⅰ只轉錄rRNA，只有一種啟動子類型。RNA聚合酶Ⅱ負責蛋白質基因和部分SnRNA基因的轉錄，其啟動子結構最為復雜，通常所說的核心啟動子(Core promoter)即指RNA聚合酶Ⅱ的啟動子。RNA聚合酶Ⅲ負責轉錄tDNA和5SrDNA，其啟動子位于轉錄的DNA序列之內，稱為下游啟動子。

啟動子是決定RNA聚合酶Ⅱ轉錄起始點和轉錄頻率的關鍵元件，由多個獨立的、具有特征性的核苷酸序列組成。昆蟲啟動子具備真核生物啟動子的典型特征，其結構如下：在5′端轉錄起始點上游約-20~-30 bp的區(qū)域存在TATA盒(TATA-box)，它對轉錄起始位點的定位十分重要，是絕大多數真核生物基因正確表達所必需的元件，一致序列為TATA(A/T)A(A/T)。在不含TATA box的啟動子中，往往由上游啟動子元件行使TATA box的功能，主要有2個部位：GC box，分布在轉錄起始位點上游-128~-23 bp的區(qū)域內，與轉錄因子的結合有關，其中常有1個以上的SP1結合位點，一致序列為GGCGGG；CAAT box，在轉錄起始位點上游 -159~-51 bp的區(qū)域內分布比較集中，一致序列為GG(C/A)CAATCT，普遍存在于生物體中，與轉錄起始頻率有關(Weaver,2002)。

啟動子具有如下特征：(1) 序列特異性，在啟動子的DNA序列中，通常含有幾個保守的序列框，序列框中堿基的變化會導致轉錄啟動滯后和轉錄速度減慢；(2) 方向性，啟動子是一種有方向性的順式調控元件，在正反2種方向中只有一種具有啟動功能；(3) 位置特性，啟動子只能位于所啟動轉錄基因的上游或基因內的前端；(4) 種屬特異性，原核生物的不同種、屬，真核生物的不同組織都具有不同類型的啟動子。但一般來說, 親緣關系越近的2種生物，其啟動子通用的可能性也越大(吳乃虎，2001； 夏江東等，2006)。

2　昆蟲啟動子研究概況

啟動子按其功能及作用方式可分為3類：組成型啟動子、特異型啟動子和誘導型啟動子，但在某些情況下，一種類型的啟動子會兼有其他類型啟動子的特性。下面將舉例說明這幾類啟動子的特性及其在昆蟲遺傳控制中的應用，并對昆蟲遺傳控制技術中應用的啟動子及其啟動的外源基因表達的遺傳修飾昆蟲進行總結(表1)。

2.1　組成型啟動子

組成型啟動子控制外源基因的表達大體恒定在一定水平，該類啟動子具有啟動效率高、甲基化程度相對較低和遺傳性狀穩(wěn)定等特點，是基因工程中應用最早、最為廣泛的一類啟動子。組成型啟動子在遺傳控制技術中的應用主要體現在以下3方面：(1)基因防治，由家蠶核型多角體病毒(Bombyxmorinucleopolyhedrovirus,Bm-NPV)引起的家蠶血液型膿病是對養(yǎng)蠶業(yè)危害最為嚴重的病害之一，該病傳染力極強，難以控制。利用昆蟲桿狀病毒極早期蛋白基因immediateearly(ie1)啟動子介導對Bm-NPV具有很強抑制作用的家蠶脂肪酶1 (Bmlipase-1)的增量表達，獲得提高宿主對疾病抵抗力的家蠶品系(Jiangetal.,2012)；(2)遺傳轉化輔助質粒helper的構建，能提高轉座酶的瞬時表達水平，對提高遺傳轉化效率十分有效(Kapetanakietal.,2002)，ie1基因啟動子在增強子hr5的協同作用下能高效表達轉座酶基因，提高轉座子piggyBac的轉座活性，廣泛用于遺傳轉化體系輔助質粒的構建(王娜等，2010)；(3)標記遺傳修飾昆蟲，由于組成型啟動子高效、穩(wěn)定表達靶標基因的特性，被廣泛用于啟動EGFP、DsRed等熒光蛋白的表達。這里以多聚泛素基因polyubiquitin(PUb)啟動子啟動DsRed在遺傳修飾斑翅果蠅DrosophilasuzukiiMatsumura中表達為例，說明組成型啟動子的作用機制。

表1　昆蟲遺傳控制中的啟動子應用概況

2.1.1PUb啟動子作用機制泛素(Ubiquitin)是一種由76個氨基酸的氨基和羧基縮合而成的小分子蛋白，相對分子質量8.6 kD，最早從牛胸腺中分離得到，幾乎在所有的真核生物中都極其保守。根據編碼泛素前體蛋白質的差異可分為多聚泛素基因(polyubiquitin)和泛素延伸基因(ubiquitinextension)。泛素基因在昆蟲中腸、脂肪體、馬氏管和飛行肌等組織中高水平表達，參與調控昆蟲生命活動的各個過程(Barrioetal.,1994)。泛素基因啟動子的結構一般包括幾個特定的基序(Sequence motifs)，+l處為轉錄起始位點(帽子位點)，一般為A，兩邊通常為嘧啶堿基；以-25位為中心的區(qū)域富含AT序列，是啟動子主要的功能性成分，可能通過一些調節(jié)蛋白直接或間接作用來控制RNA聚合酶的活性，從而特異性地轉錄出一定量的mRNA；G 框位于泛素基因啟動子-96 bp位置 ，一致序列為CACGTG，是高度保守的轉錄元件之一。目前，研究所知的多數泛素基因的起始轉錄區(qū)上游都有一段內含子序列，位于轉錄起始位點至翻譯起始密碼子之間，對目的基因的表達具有較大促進作用(Andersonetal.,2010)。

2.1.2PUb啟動子應用實例斑翅果蠅，又稱鈴木氏果蠅，寄主范圍廣，危害成熟或即將成熟的櫻桃、桃、歐洲李、葡萄、草莓、樹莓、藍莓、柿子和番茄等，幼蟲在果實內取食，給果園造成嚴重損失。該蟲1916年在日本山梨縣首先發(fā)現，20世紀80年代在美國夏威夷定殖，傳播速度非?？欤壳霸诿乐?、歐洲、非洲和亞洲等國均有發(fā)現，已成為一種世界性農業(yè)害蟲(Hauser，2011)。除加強對該蟲的檢疫外，利用昆蟲遺傳轉化技術對該蟲進行遺傳控制也是一種有效的預防或根除該蟲的方法。目前，美國北卡羅萊拉州立大學已經獲得了遺傳修飾斑翅果蠅(圖1)，Pub啟動子調控DsRed熒光蛋白在斑翅果蠅整個蟲體均有表達，而不是局限在某個組織表達。Schetelig & Handler (2013)利用Pub啟動子調控EGFP熒光蛋白的表達,獲得在整個蟲體均能檢測到綠色熒光的遺傳修飾斑翅果蠅。

圖1　多聚泛素基因啟動子Pub驅動DsRed表達的遺傳修飾斑翅果蠅

2.2　組織特異啟動子

在組織特異啟動子調控下，基因的表達往往只發(fā)生在某些特定的器官或組織部位，表現出發(fā)育調節(jié)的特性。應用昆蟲遺傳轉化技術建立遺傳修飾昆蟲品系不僅能提高現有的害蟲控制方法，也有利于開發(fā)出新的害蟲控制方法。利用性別和組織特異啟動子啟動外源基因的目的性表達是這項技術得以成功的關鍵因素之一(Handler,2002),如昆蟲不育技術中遺傳定性品系、雄性不育和精子熒光標記品系的開發(fā)。下面以精子熒光標記品系的建立為例，說明組織特異啟動子的作用機制。

2.2.1精巢特異β2-tubulin啟動子作用機制精巢特異表達基因β2-tubulin最早在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster(Meigen) 中分離并鑒定，該基因僅在幼蟲和成蟲精子形成階段發(fā)生作用，特別是其基因絲功能依賴C-端尾氨基酸基序是該基因區(qū)別保守的tubulin家族其他成員的典型特征(Hoyleetal.,1995; Raffetal.,2008)。繼黑腹果蠅之后，該基因陸續(xù)在美洲煙夜蛾Heliothisvirescens(Fabricius) (Davis & Miller,1988)、斑須按蚊AnophelesstephensiListon (Catterucciaetal.,2005)、埃及伊蚊Aedesaegypti(L.) (Smithetal.,2007)、地中海實蠅Ceratitiscapitata(Wiedemann) (Scolarietal.,2008)，以及加勒比按實蠅Anastrephasuspensa(Loew)、墨西哥按實蠅Anastrephaludens(Loew)和桔小實蠅Bactroceradorsalis(Hendel) (Zimowskaetal.,2009)等昆蟲中被分離得到。

在果蠅中，精巢特異表達基因β2-tubulin啟動子啟動外源基因在精巢特異表達。啟動子刪減試驗結果表明，該基因啟動子轉錄位點上游53 bp及下游23 bp序列足以調控外源基因在精巢的準確轉錄。體外突變試驗表明，一個在海德氏果蠅蠅Drosophilahydei(Sturtevant)和黑腹果蠅中保守的14 bp基序ATCGYAGTAGYCTA是控制β2-tubulin啟動子精巢特異表達的唯一元件(Michielsetal.,1989)。

2.2.2精巢特異β2-tubulin啟動子應用實例近年來，利用β2-tubulin啟動子驅動熒光蛋白EGFP或DsRed已在斑須按蚊 (Catterucciaetal.,2005)、埃及伊蚊 (Smithetal.,2007)、地中海實蠅(Scolarietal.,2008)和加勒比按實蠅(Zimowskaetal.,2009)的精巢中表達，并成功建立了精子熒光標記品系。以加勒比按實蠅為例，精子熒光標記品系雄蟲精巢和與熒光標記雄蟲交配后的雌蟲受精囊中均能檢測到熒光蛋白的表達(圖2，Zimowskaetal.,2009)。精子熒光標記品系的應用主要體現在以下3個方面：(1) 性別分離，借助識別不同熒光的分揀機分離雌、雄蟲，目前已開發(fā)的機械光學的熒光分揀機(COPOS，Union Biometrica)可以用于分離精子熒光標記品系的雌、雄幼蟲，已被成功用于分揀岡比亞按蚊雄蟲(Maroisetal., 2012)；(2)田間監(jiān)測，替代傳統的熒光粉標記方法，提高了SIT監(jiān)測的準確性和效果；(3)為繁殖生物學研究提供技術手段，而且精子熒光標記有利于研究精子轉移、儲存、使用和競爭等繁殖生物學的相關內容，為更好地防治害蟲提供理論依據。

圖2　β2-tubulin啟動子驅動德克薩斯紅色熒光在加勒比按實蠅雄蟲精巢特異表達

Windbichleretal.(2008)利用β2-tubulin啟動歸位核酸內切酶I-PpoI的表達，由于I-PpoI能高度特異地靶定于X染色體連鎖的28S核糖體基因重復序列，而當同源染色體中的一條具有歸位核酸內切酶時，歸位核酸內切酶將切割另一條染色體，并以前者為模板進行復制，在岡比亞按蚊AnophelesgambiaeGiles的精子發(fā)生時切割X染色體，當其轉入胚胎時還能切割母系來源的X染色體，導致后代雌蟲在胚胎期死亡，產生全部為攜帶歸位核酸內切酶的雄蚊。

2.2.3組織特異啟動子的應用進展近年來，組織特異啟動子的分離與鑒定取得了一定進展，分別體現在卵巢、脂肪體、中腸和唾液等組織中多種特異表達啟動子的鑒定與應用上。例如，黑腹果蠅中有3種卵黃蛋白基因只在雌蟲脂肪體和卵巢濾泡細胞中表達(Brennanetal.,1982; Isaac & Bownes,1982)。S?ndergaardetal.(1995)通過缺失卵黃原蛋白Vitellogenin啟動子(Vg)啟動報告基因表達,構建轉基因果蠅的方法，鑒定了卵黃原蛋白基因啟動子中與營養(yǎng)響應相關的調控區(qū)域。Heinrich & Scott(2000)和 Thomasetal.(2000)在黑腹果蠅中成功建立了利用卵黃蛋白yolk protein基因yp3和yp1啟動子驅動致死基因只在雌蟲中條件性表達的遺傳定性系統 。Kokozaetal. (2000)利用埃及伊蚊的雌性特異卵黃原蛋白Vitellogenin啟動子(Vg)調控防御素defensins A的表達，培育的埃及伊蚊通過吸血激活防御素表達，吸血24 h后防御素即在該蚊蟲脂肪體中高水平表達，而由于防御素具有殺滅細菌及潛在的抗瘧原蟲作用，所以培育的埃及伊蚊可以通過干擾病原體的傳播有效地阻斷蚊媒病的擴散。繼此之后，越來越多物種的雌性特異表達基因被分離，主要包括卵黃蛋白Vitellogenins (Rina & Savakis,1991)、絨毛膜蛋白Chorion (Vlachouetal.,1997; Vlachou & Komitopoulou,2001)和抗細菌多肽Ceratotoxins (Marchinietal.,1997; Rosettoetal.,2000)，但這些基因的啟動子和調控元件尚有待進一步鑒定。

脂肪體是營養(yǎng)和能量的儲存及供給中心，又是體內激素作用的靶組織，同時還具有貯存排泄和解毒等生理功能。在果蠅、按蚊等重要昆蟲類群中，有關脂肪體特異表達基因的啟動子的研究較為深入，并在基因功能與應用的研究中發(fā)揮了重要作用。如利用脂肪體高度特異的幼蟲血清蛋白LSP (Larval serum protein)啟動子和果蠅雙元表達系統GAL4-UAS建立的脂肪體特異表達系統可廣泛用于脂肪體相關基因功能研究(Lazarevaetal.,2007)。在雄蟲脂肪體中，特異表達的雄性特異血清蛋白MSSP (Male-specific serum protein)被分離(Christophidesetal.,2000a)，地中海實蠅中有5種MSSP被分離，其中最主要的2種是MSSP-α和MSSP-β的二聚體多肽，其他的是MSSP-α和MSSP-β的均質或異質聚體多肽(Thymianouetal.,1995)。MSSP-α2基因的2個啟動子片段α2PS和α2PL驅動目的基因如半乳糖苷酶基因LacZ，僅在雄蟲脂肪體表達，α2PL的活性強于α2PS，這2種啟動子可用于構建基于乙醇脫氫酶的遺傳性別區(qū)分品系(Christophidesetal.,2001; Komitopoulouetal.,2004)。而MSSP-β2則驅動目的基因在雌、雄蟲中腸組織中的特異表達(Christophidesetal.,2000b)。

中腸是昆蟲重要的免疫組織器官，研究中腸特異啟動子對揭示中腸特異表達基因表達調控機理、免疫應答和應用研究具有重要意義。Abrahametal.(2005)利用岡比亞按蚊圍食膜基質蛋白Peritrophin-1啟動子(Aper1)驅動磷脂酶Phospholipase A2 (PLA2)在中腸特異表達，導致瘧原蟲的卵囊形成減少約80%。Itoetal.(2002)利用斑須按蚊中腸特異的羧肽酶carboxypeptidase啟動子(CP)驅動唾腺和中腸結合多肽(SM1)表達，該種多肽與中腸結合，使瘧原蟲失去生存環(huán)境，從而阻斷其傳播。

此外，一些唾液特異表達基因如maltase-likeI(malI)、mpyrase(mpy)、30Ka和30Kb的啟動子亦被分離鑒定(Coatesetal.,1999; Mathuretal.,2010)，利用30Kb啟動子驅動Membranes no protein (Mnp)在中腸特異表達，能明顯降低埃及伊蚊經唾液和唾腺感染的登革熱病毒的流行及其致病強度(Mathuretal.,2010)。

2.3　特定發(fā)育時期啟動子

特定發(fā)育時期表達的啟動子是指在昆蟲生長發(fā)育某個階段特異表達基因的啟動子。應用廣泛的特定發(fā)育時期啟動子包括胚胎囊胚層細胞分化基因nullo和serendipityα(sryα)啟動子以及生殖細胞特異表達基因nanos和vasa啟動子。nullo和serendipityα基因是果蠅胚胎時期表達的基因(Hunteretal.,2002; Ibnsoudaetal.,1993)，這2個基因編碼的微絲網絡結構成分能促進胚胎囊胚層細胞的分化(Ibnsoudaetal.,1993)。Horn & Wimmer(2003)利用這2個基因的啟動子驅動促細胞凋亡基因hid(Headinvolutiondefective)在胚胎期大量表達，通過四環(huán)素抑制致死系統控制hid蛋白條件性地表達，建立了果蠅胚胎致死系統。Scheteligetal.(2009)通過分離地中海實蠅內源sryα啟動子，該系統被成功轉移到地中海實蠅，建立地中海實蠅胚胎致死系統。之后，Ogauguwuetal.(2013)和 Schetelig & Handler(2012)通過將該系統與性別特異剪切系統結合，成功建立了地中海實蠅和加勒比按實蠅雌性胚胎期特異致死系統。而生殖細胞特異表達基因nanos和vasa啟動子被認為在生殖不育品系的建立中有望得到應用(Adelmanetal.,2007; Papathanosetal.,2009)。

2.3.1Nanos基因啟動子作用機制Nanos基因最早在果蠅中發(fā)現，是一種母性效應基因。該基因編碼一種RNA結合蛋白，這種蛋白與pumilioRNA結合蛋白相互作用形成一種核糖核蛋白復合物，一起抑制母源hunchbackmRNA的翻譯，從而調控果蠅胚胎后腹部細胞的分化。進一步的研究表明,nanos基因的缺失將使果蠅不能形成性腺，從而產生異常生殖細胞。Nanos啟動子轉錄起始位點上游 -108 bp~+97 bp為增強子區(qū)，-108 bp~+97 bp間的啟動子片段足以調控外源基因GFP在果蠅生殖細胞中的表達(Alietal.,2010)。

2.3.2Nanos基因啟動子應用實例Nanos基因在地中海實蠅、岡比亞按蚊、斑須按蚊和埃及伊蚊中的表達模式與果蠅相同，主要在胚胎早期及雌蟲發(fā)育的卵母細胞中積累(Calvoetal.,2005; Ogaugwuetal.,2013)。Adelmanetal.(2007)利用nanos基因的啟動子區(qū)域和非編碼區(qū)驅動外源mariner轉座酶MosI編碼DNA在埃及伊蚊雌蟲生殖細胞特異轉錄，MosI mRNA在發(fā)育中的卵母細胞中積累并定位于早期發(fā)育胚胎的后極孔，并能再次將MosI整合到埃及伊蚊基因組，表明nanos啟動子有望成為基于轉座元件的基因驅動系統(TE-based gene driver system)，利用轉座子技術建立抗登革熱病毒的遺傳修飾蚊并用于蚊蟲種群替代防控策略具有較大的應用潛力。最新的基因組編輯技術CRISPR/CAS 9，利用nanos啟動子在生殖細胞中過表達了cas9酶，提高和優(yōu)化了果蠅中基因組編輯的效率(Kondoetal.,2013)。

2.4　誘導型啟動子

誘導型啟動子通常僅在特定環(huán)境條件下表現活性，這些條件可以是物理的、化學的或生物的。誘導型啟動子往往具有增強子、沉默子或類似功能的序列結構，感受誘導的序列都具有明顯的專一性。誘導型啟動子通常在某些特定的物理或化學因素的刺激下，可大幅度提高基因的轉錄水平，如果蠅熱激蛋白啟動子能夠進行熱激調節(jié)，其中hsp70啟動子的熱激活性最強，使用也最為廣泛。

2.4.1熱激蛋白基因啟動子作用機制Nover(1987)、 Pelham & Bienz(1982)和 Topoletal.(1985)通過比較果蠅的hsp83、hsp70、hsp68、hsp27、hsp26、hsp23和hsp22的啟動子序列，發(fā)現有一個14 bp的回文序列，其中10 bp為高度保守，其序列為CTnGAAnnTTCnAG，稱為HSE (Heat shock element)元件，能夠進行熱激調控，如果只配對4或5個堿基，則序列沒有熱激活性，而l或2個堿基的錯配可以被容忍，沒有特定的堿基是非必需的。HSE中存在HSF1 (Heat shock factor l) (Morimoto,1993)、CHBF (constitutive HSE-binding factor) (Mosseretal.,1988)和Ku因子(Turturici,2009)等的結合位點，這也是HSE序列能夠實現熱激調節(jié)的原因。

2.4.2Hsp70啟動子應用實例果蠅hsp70啟動子應用非常廣泛，常被用于驅動外源基因在其他昆蟲中的條件性表達(Fuetal.,2007； Gongetal.,2005)，也用于構建遺傳轉化體系的輔助質粒，驅動Minos和piggyBac等轉座酶基因的表達，提高轉座活性，其有效性已在蠅類和蚊蟲等的轉化中得以證明(Catterucciaetal.,2000; Ogaugwuetal.,2013)。研究表明，該啟動子在異質系統中能發(fā)揮作用(Atkinson & O′Brochta,1992; Bergeetal.,1985; Bienz & Pelham,1982; Voellmy & Rungger,1982)，但在非果蠅昆蟲中的表達活性相對較低(Atkinson & O′Brochta,1992; Bergeetal.,1985)，若需要獲得該基因的高表達，則需要分離hsp70的同源類似物啟動子。Conchaetal.(2012)分離并鑒定銅綠蠅hsp83、hsp70、hsp23和hsp24等基因，hsp83在銅綠蠅各個發(fā)育階段均高水平表達，熱激后，其表達水平提高2～10倍，而hsp70的表達水平相對較低，但熱激后，其表達水平有很大的提高，約230～770倍，hsp23和hsp24的表達水平則在各個發(fā)育階段有較大差異，該研究結果為組成型或條件性誘導基因的表達，建立遺傳修飾銅綠蠅奠定基礎。

3　展望

啟動子是基因轉錄調控的重要元件，決定了mRNA的時空轉錄，從而實現生物的有序分化發(fā)育過程。研究啟動子的結構和功能，對于基因表達模式和基因調控網絡等方面十分重要。根據組成型啟動子、組織特異性啟動子和誘導型啟動子的特性和作用機制的不同，各類啟動子在昆蟲遺傳控制技術中的應用也有所差別。組成型基因多為管家基因，該類啟動子已被證明能有效地用于驅動標記基因如熒光蛋白的表達，該類啟動子持續(xù)穩(wěn)定地高水平表達使遺傳修飾昆蟲的篩選工作更加切實可行。性別、組織特異性啟動子能實現外源效應基因僅在單一性別或目的組織中表達，實現遺傳控制害蟲特異性致死或將致死基因特異性傳遞。誘導型啟動子可以條件性地控制外源效應基因的表達。根據昆蟲遺傳控制策略的不同，選擇性地選擇合適的啟動子構建外源基因驅動系統是非常重要的。隨著昆蟲啟動子分離、鑒定工作的進一步完善發(fā)展，更多適合的啟動子將會被應用到昆蟲遺傳控制技術中的驅動系統，促進害蟲遺傳防治技術的發(fā)展。

參考文獻

王娜, 杜希寬, 蔣明星, 張傳溪, 程家安. 2010. 家蠶BmN細胞中8種啟動子的活性比較及利用hr5-IE1啟動子實現EGFP的穩(wěn)定表達. 昆蟲學報, 53(3): 279-285.

吳乃虎, 2001. 基因工程原理. 北京: 科學出版社.

夏江東, 程在全, 吳渝生, 季鵬章. 2006. 高等植物啟動子功能和結構研究進展. 云南農業(yè)大學學報, 21(1): 7-14.

Abraham E G, Donnelly-Doman M, Fujioka H, Ghosh A, Moreira L and Jacobs-Lorena M. 2005. Driving midgut-specific expression and secretion of a foreign protein in transgenic mosquitoes withAgAper1 regulatory elements.InsectMolecularBiology, 14: 271-279.

Adelman Z N, Jasinskiene N, Onal S, Juhn J, Ashikyan A, Salampessy M, MacCauley T and James A A. 2007.Nanosgene control DNA mediates developmentally regulated transposition in the yellow fever mosquitoAedesaegypti.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica, 104: 9970-9975.

Ali I, ur Rehman M, Rashid F, Khan S, Iqbal A, Laixin X, ud din Ahmed N and Swati A Z. 2010. Cis-regulatory elements affecting theNanosgene promoter in the germline stem cells.JournalofBiotechnology, 145: 323-329.

Alphey L S and Andreasen M. 2002. Dominant lethality and insect population control.MolecularandBiochemicalParasitology, 121: 173-178.

Anderson M A E, Gross T L, Myles K M and Adelman Z N. 2010. Validation of novel promoter sequences derived from two endogenous ubiquitin genes in transgenicAedesaegypti.InsectMolecularBiology, 19: 441-449.

Atkinson P W and O′Brochta D A. 1992. In vivo expression of two highly conservedDrosophilagenes in Australian sheep blowfly,Luciliacuprina.InsectBiochemistryandMolecularBiology, 22: 423-431.

Barrio R, del Arco A, Cabrera H L and Arribas C. 1994. Structure and expression of theDrosophilaubiquitin-80-amino acid fusion protein gene.BiochemicalJournal, 302: 237-244.

Berger E M, Marino G and Torrey D. 1985. Expression ofDrosophilahsp70-CAT hybrid gene inAedescells induced by heat shock.SomaticCellMolecularGenetics, 11: 371-377.

Berghammer A J, Klingler M and Wimmer E A. 1999. A universal marker for transgenic insects.Nature, 402: 370-371.

Bienz M and Pelham H R B. 1982. Expression of aDrosophilaheat shock protein inXenopusoocytesconserved and divergent regulatory signals.EMBOJournal, 1: 1583-1588.

Brennan M D, Weiner A J, Goralski T J and Mahowald A P. 1982. The ollicle cells are the major site of vitellogenin synthesis inDrosophilamelanogaster.DevelopmentalBiology, 89: 225-236.

Calvo E, Walter M, Adelman Z N, Jimenez A, Onal S, Marinotti O and James A A. 2005.Nanos(nos) genes of the vector mosquitoes,Anophelesgambiae,AnophelesstephensiandAedesaegypti.InsectBiochemistryandMolecularBiology, 35: 789-798.

Catteruccia F, Benton J P and Crisanti A. 2005. AnAnophelestransgenic sexing strain for vector control.NatureBiotechnology, 23: 1414-1417.

Catteruccia F, Nolan T, Blass C, Muller H M, Crisanti A, Kafatos F C and Loukeris T G. 2000. TowardAnophelestransformation: minos element activity in anopheline cells and embryos.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica, 97: 2157-2162.

Christophides G K, Livadaras I, Savakis C and Komitopoulou K. 2000a. Two medfly promoters that have originated by recent gene duplication drive distinct sex, tissue and temporal expression patterns.Genetics, 156: 173-182.

Christophides G K, Mintzas A C and Komitopoulou K. 2000b. Organization, evolution and expression of a multi-gene family encoding putative members of the odorant binding protein family in the medflyCeratitiscapitata.InsectMolecularBiology, 9: 185-195.

Christophides G K, Savakis C, Mintzas A C and Komitopoulou K. 2001. Expression and function of theDrosophilamelanogasterADH in maleCeratitiscapitataadults: a potential strategy for medfly genetic sexing based on gene-transfer technology.InsectMolecularBiology, 10: 249-254.

Coates C J, Jasinskiene N, Pott G B and James A A. 1999. Promoter-directed expression of recombinant fire-fly luciferase in the salivary glands of Hermes-transformedAedesaegypti.Gene, 226: 317-325.

Concha C, Edman R M, Belikoff E J, Schiemann A H, Carey B and Scott M J. 2012. Organization and expression of the Australian sheep blowfly (Luciliacuprina)hsp23,hsp24,hsp70 andhsp83 genes.InsectMolecularBiology, 21: 169-180.

Davis I, Girdham C H and O′Farrell P H. 1995. A nuclear GFP that marks nuclei in livingDrosophilaembryos; maternal supply overcomes a delay in the appearance of zygotic fluorescence.DevelopmentalBiology, 170: 726-729.

Davis M T B and Miller S G. 1988. Expression of a testisβ-tubulingene inHeliothisvirescensduring spermatogenesis.InsectBiochemestryandMolecularBiology, 18: 389-394.

Fu G, Condon K C, Epton M J, Gong P, Jin L, Condon G C, Morrison N I, Dafa′alla T H and Alphey L. 2007. Female-specific insect lethality engineered using alternative splicing.NatureBiotechnology, 25: 353-357.

Fu G, Lee R S, Nimmo D, Aw D Jin L, Gray P, Berendonk T U, White-Cooper H, Scaife S, Phun H K, Marinotti O, Jasinskiene, James A A and Alphey L. 2010. Female-specific flightless phenotype for mosquito control.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica, 107: 4550-4554.

Gong P, Epton M J, Fu G, Scaife S, Hiscox A, Condon K C, Condon G C, Morrison N I, Kelly D W, Dafa′alla T, Coleman P G and Alphey L. 2005. A dominant lethal genetic system for autocidal control of the Mediterranean fruit fly.NatureBiotechnology, 23: 453-456.

Handler A M. 2002. Prospects for using genetic transformation for improved SIT and new biocontrol methods.Genetica, 116, 137-149.

Handler A M, Allen M L and Skoda S R. 2009. Development and utilization of transgenic New World screwworm,Cochliomyiahominivorax.MedicalandMeterinaryEntomology, 23(S1): 98-105.

Handler A M and Harrell R A. 1999. Germline transformation ofDrosophilamelanogasterwith thepiggyBactransposon vector.InsectMolecularBiology, 8: 449-457.

Handler A M and Harrell R A. 2001a. Polyubiquitin-regulated DsRed marker for transgenic insects.Biotechniques, 31: 820-828.

Handler A M and Harrell R A. 2001b. Transformation of the Caribbean fruit fly,Anastrephasuspensa, with apiggyBacvector marked with polyubiquitin-regulated GFP.InsectBiochemistryandMolecularBiology, 31: 199-205.

Hauser M. 2011. A historic account of the invasion ofDrosophilasuzukii(Matsumura)(Diptera: Drosophilidae) in the continental United States, with remarks on their identification.PestManagementScience, 67: 1352-1357.

Hediger M, Niessen M, Wimmer E A, Dübendorfer A and Bopp D. 2001. Genetic transformation of the houseflyMuscadomesticawith the lepidopteran derived transposon piggyback.InsectMolecularBiology, 10: 113-119.

Heinrich J C and Scott M J. 2000. A repressible female-specific lethal genetic system for making transgenic insect strains for a sterile release program.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica, 97: 8229-8232.

Heinrich J C, Li X, Henry R A, Haack N, Stringfellow L, Heath A and Scott M J. 2002. Germ-line transformation of the Australian sheep blowfly,Luciliacuprina.InsectMolecularBiology, 11: 1-10.

Horn C and Wimmer E. 2003. A transgene-based, embryo-specific lethality system for insect pest management.NatureBiotechnology, 21: 64-70.

Hoyle H D, Hutchens J A, Turner F R and Raff E C. 1995. Regulation ofβ-tubulinfunction and expression inDrosophilaspermatogenesis.DevelopmentalGenetics, 16: 148-170.

Hunter C, Sung P, Schejter E D and Wieschaus E. 2002. Conserved domains of the Nullo protein required for cell-surface localization and formation of adherens junctions.MolecularBiologyoftheCell, 13: 146-157.

Ibnsouda S, Schweisguth F, de Billy G and Vincent A. 1993. Relationship between expression of serendipity alpha and cellularization of theDrosophilaembryo as revealed by interspecific transformation.Development, 119: 471-483.

Isaac P and Bownes M. 1982. Ovarian and fat body vitetlogenin synthesis inDrosophilamelanogaster.EuropeanJournalofBiochemistry, 123: 527-534.

Ito J, Ghosh A, Moreira L A, Wimmer E A and Jacobs-Iorena M. 2002. Transgenic anopheline mosquitoes impaired in transmission of a malaria parasite.Nature, 417: 452- 455.

Jiang L, Wang G H, Cheng T C, Yang Q, Jin S K, Lu G, Wu F Q, Xiao Y, Xu H F and Xia Q Y. 2012. Resistance toBombyxmorinucleopolyhedrovirus via overexpression of an endogenous antiviral gene in transgenic silkworms.ArchivesofVirology, 157: 1323-1328.

Kapetanaki M G, Loukeris T G, Livadaras I and Savakis C. 2002. High frequencies ofMinostransposon mobilization are obtained in insects by using in vitro synthesized mRNA as a source of transposase.NucleicAcidsResearch, 30: 3333-3340.

Kokoza V, Abduelaziz A, Cho W L, Jasinskiene N, James A A and Raikhei A. 2000. Engineering blood meal-activated systemic immunity in the yellow fever mosquito,Aedesaegypti.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica, 97: 9144-9149.

Komitopoulou K, Christophides G K, Kalosaka K, Chrysanthis G, Theodoraki M A, Savakis C, Zacharopoulou A and Mintzas A C. 2004. Medfly promoters relevant to the sterile insect technique.InsectBiochemistryandMolecularBiology, 34: 149-157.

Kondo S and Ueda R. 2013. Highly improved gene targeting by germline-specificCas9 expression inDrosophila.Genetics, 195: 715-721.

Labbé G M, Scaife S, Morgan S A, Curtis Z H and Alphey L. 2012. Female-specific flight-less (fsRIDL) phenotype for control ofAedesalbopictus.PLoSNeglectedTropicalDiseases, 6: e1724.

Lazareva A A, Roman G, Mattox W, Hardin P E and Dauwalder B. 2007. A role for the adult fat body inDrosophilamale courtship behavior.PLoSGenetics, 3: e16.

Liang P and Pardee A B. 1992. Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction.Science, 257: 967-971.

Lorenzen M D, Brown S J, Denell R E and Beeman R W. 2002. Transgene expression from theTriboliumcastaneumPolyubiquitin promoter.InsectMolecularBiology, 11: 399-407.

Marchini D, Marri L, Rosetto M, Manetti A G and Dallai R. 1997. Presence of antibacterial peptides on the laid egg chorion of the medflyCeratitiscapitata.BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications, 240: 657-663.

Marinotti O, Jasinskiene N, Fazekas A, Scaife S, Fu G, Mattingly S T, Chow K, Brown D M, Alphey L and James A A. 2013. Development of a population suppression strain of the human malaria vector mosquito,Anophelesstephensi.MalariaJournal, 12: 142.

Marois E, Scali C, Soichot J, Kappler C, Levashina E A and Catteruccia F. 2012. High-throughput sorting of mosquito larvae for laboratory studies and for future vector control interventions.MalariaJournal, 11: 302.

Mathur G, Sanchez-Vargas I, Alvarez D, Olson K E, Marinotti O and James A A. 2010. Transgene-mediated suppression of dengue viruses in the salivary glands of the yellow fever mosquito,Aedesaegypti.InsectMolecularBiology, 19: 753-763.

Michiels F, Gasch A, Kaltschmidt B and Renkawitz-Pohl R. 1989. A 14 bp promoter element directs the testis specificity of theDrosophilaβ2tubulingene.EMBOJournal, 8: 1559-1565.

Morimoto R I. 1993. Cells in stress-transcriptional activation of heat-shock genes.Science, 259: 1409-1410.

Mosser D D, Theodorakis N G and Morimoto R I. 1988. Coordinate changes in heat-shock element-binding activity andhsp70 gene-transcription rates in human cells.MolecularCellBiology, 8: 4716-4744.

Nover L. 1987. Expression of heat-hock genes in homologous and heterologous systems.EnzymeandMicrobialTechnology, 9: 130-144.

Ogaugwu C E, Schetelig M F and Wimmer E A. 2013. Transgenic sexing system forCeratitiscapitata(Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality.InsectBiochemistryandMolecularBiology, 43: 1-8.

Papathanos P A, Windbichler N, Miriam M, Burt A and Crisanti A. 2009. The vasa regulatory region mediates germline expression and maternal transmission of proteins in the malaria mosquitoAnophelesgambiae: a versatile tool for genetic control strategies.BMCMolecularBiology, 10: 65.

Pelham H R. 1982. A regulatory upstream promoter element in theDrosophilahsp70 heat-shock gene.Cell, 30: 517-528.

Pelham H R and Bienz M. 1982. A synthetic heat-shock promoter element confers heat-inducibility on the herpes simplex virus thymidine kinase gene.EMBOJournal, 1: 1473-1477.

Perera O P, Harrell I R and Handler A M. 2002. Germ-line transformation of the South American malaria vector,Anophelesalbimanus, with a piggyBac/EGFP transposon vector is routine and highly efficient.InsectMolecularBiology, 11: 291-297.

Pinkerton A C, Michel K, O′Brochta D A and Atkinson P W. 2000. Green fluorescent protein as a genetic marker in transgenicAedesaegypti.InsectMolecularBiology, 9: 1-10.

Raff E C, Hoyle H D, Popodi E M and Turner F R. 2008. Axoneme beta-tubulin sequence determines attachment of outer dynein arms.CurrentBiology, 18: 911-914.

Rina M and Savakis C. 1991. A cluster of vitellogenin genes in the Mediterranean fruit flyCeratitiscapitata: sequence and structural conservation in dipteran yolk proteins and their genes.GeneticsSocietyofAmerica, 127: 769-780.

Rosetto M, de Filippis T, Mandrioli M, Zacharopoulou A, Gourzi P, Manetti A G, Marchini D and Dallai R. 2000.Ceratotoxins: female-specific X-linked genes from the medfly,Ceratitiscapitata.Genome, 43: 707-711.

Rubin G M and Spradling A C. 1982. Genetic transformation ofDrosophilawith transposable element vectors.Science, 218: 348-353.

Sano H, Nakamura A and Kobayashi S. 2002. Identification of a transcriptional regulatory region for germline-specific expression ofvasagene inDrosophilamelanogaster.MechanismsofDevelopment, 112: 129-39.

Schetelig M F and Handler A M. 2012. A transgenic embryonic sexing system forAnastrephasuspensa(Diptera: Tephritidae).InsectBiochemistryandMolecularBiology, 42: 790-795.

Schetelig M F and Handler A M. 2013. Germline transformation of the spotted wing drosophilid,Drosophilasuzukii, with a piggyBac transposon vector.Genetica, 141: 189-193.

Schetelig M F, Caceres C, Zacharopoulou A, Franz G and Wimmer E A. 2009. Conditional embryonic lethality to improve the sterile insect technique inCeratitiscapitata(Diptera: Tephritidae).BMCBiology, 7: 4.

Scolari F, Schetelig M F, Bertin S, Malacrida A R, Gasperi G and Wimmer E A. 2008. Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insectCeratitiscapitata(Wiedemann; Diptera: Tephritidae).NewBiotechnology, 25: 76-84.

Smith R C, Walter M F, Hice R H, O′Brochta D A and Atkinson P W. 2007. Testis-specific expression of theβ2-tubulinpromoter ofAedesaegyptiand its application as a genetic sex-separation marker.InsectMolecularBiology, 16: 61-71.

S?ndergaard L, Mauehline D, White P E N, Wulff P and Bownes M. 1995. Nutritional response in aDrosophilayolk protein gene promoter.MolecularandGeneralGenetics, 248: 25-32.

Thomas D D, Donnelly C A, Wood R J and Alphey L S. 2000. Insect population control using a dominant, repressible, lethal genetic system.Science, 287: 2474-2476.

Thymianou S P, Chrysanthis G, Petropoulou K A and Mintzas A C. 1995. Developmentally regulated biosynthesis of two male specific serum polypeptides in the fat body of the medflyCeratitiscapitata.InsectBiochemistryandMolecularBiology, 25: 915-920.

Topol J, Ruden D M and Parker C S. 1985. Sequences required for in vitro transcriptional activation of aDrosophilahsp70 gene.Cell, 42: 527-537.

Turturici G, Geraci F, Candela M E, Cossu G, Giudice G and Sconzo G. 2009.Hsp70 is required for optimal cell proliferation in mouse A6 mesoangioblast stem cells.BiochemicalJournal, 421: 193-200.

Vlachou D, Konsolaki M, Tolias P P, Kafatos F C and Komitopoulou K. 1997. The autosomal chorion locus of the medflyCeratitiscapitata. Ⅰ. Conserved synteny, amplification and tissue specificity but sequence divergence and altered temporal regulation.Genetics, 147: 1829-1842.

Voellmy R and Rungger D. 1982. Transcription of aDrosophilaheat shock gene is heatⅡinduced inXenopusoocytes.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica, 79: 1776-1780.

Weaver R F. 2002. 分子生物學. 2版. 北京: 科學出版社.

Windbichler N, Papathanos P A and Crisanti A. 2008. Targeting the X chromosome during spermatogenesis induces Y chromosome transmission ratio distortion and early dominant embryo lethality inAnophelesgambiae.PLoSGenetics, 4: e1000291.

Zimowska G J, Nirmala X and Handler A M. 2009. Thebeta2-tubulingene from three tephritid fruit fly species and use of its promoter for sperm marking.InsectBiochemistryandMolecularBiology, 39: 508-515.

(責任編輯:郭瑩)

LaboratoryofWildAnimalConservationandUtilization,GuangdongEntomologicalInstitute,Guangzhou,Guangdong510260,

China;3DepartmentofEntomology,NorthCarolinaStateUniversity,CampusBox7613,Raleigh,NC27695-7613,USA；

4GeneticEngineeringandSocietyCenterandW.M.KeckCenterforBehavioralBiology,NorthCarolinaStateUniversity,

Raleigh,NC27695-7613,USA；5CollegeofAgricultureandPlantProtection,

QingdaoAgriculturalUniversity,Qingdao,Shandong266109,China

Abstract:Genetic control using germ-line transformation is the new trend in the research of insect pest control. It is a species-specific, highly efficient and environmental friendly pest control strategy. Gene promoter, one of the key component for gene expression regulation, is requisite for the construction of high-efficient and stable genetic modified strains for insect population genetic control. In this review, the basic structural characteristics of insect gene promoters are briefly described. The progress and application of different type promoters such as constitutive promoter, sex- and tissue-specific promoter, age-specific promoter and inducible promoter, are also introduced. Finally, the future prospect of different types of promoters used in insect population genetic control is disccused.

Key words:insect population genetic control; sterile insect technique; genetic transformation; constitutive promoter; specific promoter; inducible promoter

通訊作者*(Author for correspondence), E-mail： wanfanghao@caas.cn

作者簡介:呂志創(chuàng)， 女， 助理研究員。 研究方向： 入侵昆蟲分子生態(tài)學。 E-mail： grasslzc@163.com

基金項目:國家“973”計劃項目(2009CB119200)； 國家“十一五”科技支撐計劃課題(2006BAD08A18)； 農業(yè)部農作物病蟲害疫情監(jiān)測與防治項目(2003-2015)； 中國農科院科技創(chuàng)新工程(2013-2015); 人力資源社會保障部2014年度留學人員科技活動擇優(yōu)資助項目

收稿日期(Received)： 2014-12-16接受日期(Accepted)： 2015-01-07

DOI:10.3969/j.issn.2095-1787.2015.02.005