呂志創(chuàng)， 嚴(yán)　盈,2，3， 張桂芬， 武　強， 劉萬學(xué)， 萬方浩,4*

1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國家重點研究室，北京 100193； 2Department

of Entomology, North Carolina State University, Campus Box 7613, Raleigh, NC 27695-7613, USA；

3Genetic Engineering and Society Center and W.M. Keck Center for Behavioral Biology,

North Carolina State University, Raleigh, NC 27695-7613, USA；

4農(nóng)業(yè)部外來入侵生物預(yù)防與控制研究中心，北京 100193

?

基因組編輯技術(shù)及其在昆蟲遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用

呂志創(chuàng)1， 嚴(yán)盈1,2，3， 張桂芬1， 武強1， 劉萬學(xué)1， 萬方浩1,4*

1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國家重點研究室，北京 100193；2Department

of Entomology, North Carolina State University, Campus Box 7613, Raleigh, NC 27695-7613, USA；

3Genetic Engineering and Society Center and W.M. Keck Center for Behavioral Biology,

North Carolina State University, Raleigh, NC 27695-7613, USA；

4農(nóng)業(yè)部外來入侵生物預(yù)防與控制研究中心，北京 100193

摘要:鋅指核酸酶、類轉(zhuǎn)錄激活因子式核酸酶和CRISPR/Cas技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的3種主要基因組編輯技術(shù)，其原理都是通過在生物基因組特定位點制造DNA雙鏈斷裂損傷，從而激活機體自身的DNA 損傷修復(fù)機制，在此過程中引發(fā)各種變異?；蚪M編輯技術(shù)已在研究基因功能和基因修復(fù)中成功應(yīng)用，基于基因組編輯技術(shù)的諸多優(yōu)點，如CRISPR/Cas技術(shù)能對基因組中多個特定位點進(jìn)行編輯，其有望成為昆蟲遺傳轉(zhuǎn)化的主要策略。本文就鋅指核酸酶、類轉(zhuǎn)錄激活因子式核酸酶和CRISPR/Cas技術(shù)的基本原理及其在昆蟲中的應(yīng)用做一簡介，為今后利用基因組編輯技術(shù)進(jìn)行昆蟲遺傳轉(zhuǎn)化提供些許參考。

關(guān)鍵詞:CRISPR/Cas技術(shù)； 遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)； 基因組編輯； 類轉(zhuǎn)錄激活因子式核酸酶技術(shù)； 鋅指核酸酶技術(shù)

Genome editing techniques and their application

in insect genetic transformation

Zhi-chuang Lü1, Ying YAN1,2，3, Gui-fen ZHANG1, Qiang WU1, Wan-xue LIU1, Fang-hao WAN1,4*

害蟲遺傳防治主要經(jīng)歷了2個發(fā)展階段：基于輻射的昆蟲不育技術(shù)(Sterile insect technology,SIT)和基于基因組編輯技術(shù)的遺傳調(diào)控體系。雖然傳統(tǒng)SIT是一種環(huán)境友好的害蟲防治方法，但在實際運用中存在釋放的昆蟲競爭力降低、大規(guī)模飼養(yǎng)成本太高、難于對釋放到野外的種群進(jìn)行有效監(jiān)測等問題?；诨蚪M編輯技術(shù)的害蟲遺傳調(diào)控策略不但可以有效地避免上述問題，并且能通過對靶標(biāo)害蟲基因組特定位點的精細(xì)調(diào)控，使整個控制體系更加科學(xué)高效和透明可控。目前，基因組編輯技術(shù)主要依靠2大類核酸酶：一類是天然存在的能夠識別較長序列的核酸酶，如歸巢核酸酶(Homing endonucleases)，歸巢核酸酶有嚴(yán)格的序列識別特異性，且難以通過工程化手段來改變其靶向特異性，因此應(yīng)用較為局限(Smithetal.,2006)；另一類是人工構(gòu)建的改造核酸酶(Engineered nucleases)，即借助遺傳工程手段，將天然存在并能夠靶向DNA的蛋白和核酸內(nèi)切酶組裝，如鋅指核酸酶(Zinc finger nucleases,ZFNs)、類轉(zhuǎn)錄激活因子式核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases,ALENs)和CRISPR/Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR; CRISPR associated protein,Cas)系統(tǒng)。這3種改造核酸酶的基因組編輯技術(shù)近年來發(fā)展迅猛并得到了廣泛應(yīng)用，其原理都是通過在生物基因組特定位點制造DNA雙鏈斷裂(DNA double-strand break,DSB)損傷，從而激活機體自身的DNA 損傷修復(fù)機制，在此過程中引發(fā)各種變異。DNA損傷修復(fù)方式主要有非同源末端連接修復(fù)(Non-homologous end joining,NHEJ)和同源介導(dǎo)修復(fù)(Homology-directed repair,HDR)(Hsuetal.,2014)。NHEJ能夠快速有效地重新連接斷裂末端，在該過程中于連接位點引入小的插入或缺失，從而造成目的基因移碼突變并失去原有功能。HDR需要一個攜帶有斷裂位點兩端遺傳信息的同源DNA臂，以實現(xiàn)少數(shù)核苷酸改變基因定點矯正或定點插入一個新基因。這2種高度保守的DNA損傷修復(fù)方式可被用于ZFNs技術(shù)、TALENs技術(shù)和CRISPR/Cas技術(shù)為導(dǎo)向的基因組靶向編輯。本文著重介紹這3種技術(shù)的原理及其在昆蟲轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用(表1)。

表1　ZFN, TALEN and CRISPR/Cas介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)在果蠅和家蠶中的應(yīng)用

1　鋅指核酸酶(ZFNs)技術(shù)

鋅指(Zinc finger，ZF)是一種常見的DNA結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)基元，每個鋅指可直接特異識別3個連續(xù)的核苷酸。鋅指蛋白(Zinc finger protein，ZFP)在自然界廣泛存在，從簡單的真核生物酵母到高級的哺乳動物小鼠，以及人基因組中都含有許多編碼鋅指蛋白的基因。鋅指蛋白是一類天然存在的具有與特定DNA序列結(jié)合的特性蛋白(Klug,1999)，是重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。少量鋅指蛋白還能作用于RNA(Brown,2005; Hall,2005)、蛋白或其他小分子(Gamsjaegeretal.,2007)，具有重要的生物學(xué)功能。不同的鋅指蛋白具有類似的結(jié)構(gòu)框架，框架外關(guān)鍵位點的氨基酸變異會改變鋅指蛋白結(jié)合DNA的特異性(Klug，2010)。鋅指蛋白DNA結(jié)合域能夠使鋅指核酸酶結(jié)合特定DNA序列，并在基因組的特定位點產(chǎn)生雙鏈斷裂，隨后，通過非同源末端連接修復(fù)(NHEJ)或同源介導(dǎo)修復(fù)(HDR)的DNA損傷修復(fù)方式進(jìn)行基因組靶向編輯(圖1A)。針對已知靶基因，目前構(gòu)建人工鋅指蛋白的策略主要有模塊組裝(Modular assembly,MA)、寡聚體庫工程化篩選構(gòu)建法(Oligomerized pool engineering,OPEN)、下文依賴組裝法(Context-dependent assembly，CoDA)和雙鋅指篩選法。

圖1　內(nèi)源性DNA修復(fù)基因組編輯技術(shù)原理(Hsu et al.,2014)

經(jīng)遺傳工程改造后的限制性內(nèi)切酶FokI消除了其序列識別特異性，提高了切割效率(Bitinaiteetal.,1998)。特異鋅指核酸酶的形成包括：選擇靶標(biāo)基因的靶位點，構(gòu)建識別靶序列DNA的活性鋅指蛋白，然后將鋅指蛋白和FokI亞基融合即可。鋅指核酸酶的切割特異性取決于鋅指蛋白識別DNA靶序列的能力(Handel & Cathomen,2011)。Kimetal.(1996)首次將人工構(gòu)建的多個鋅指串聯(lián)形成的鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域與改造后的FokI限制性內(nèi)切酶的切割結(jié)構(gòu)域連接，形成具有切割特異 DNA活性的人工核酸內(nèi)切酶(Zinc finger nucleases，ZFn)，實現(xiàn)對靶序列的切割。串聯(lián)鋅指的數(shù)目與可識別的靶序列長度成正相關(guān)關(guān)系，串聯(lián)鋅指數(shù)目增加的同時也增加DNA靶向修飾的特異性(Milleretal.,1985; Wolfeetal.,2000)?；诿總€ZF單體能夠特異性地靶向3個堿基，因此理論上至少需要64種鋅指蛋白單體，以滿足針對任意序列構(gòu)建ZFNs的可能性(王躍強等，2003)。但目前開發(fā)的ZF單體不能滿足靶向任意序列，提高了ZFNs的設(shè)計與構(gòu)建難度(Carrolletal.,2006)。

由鋅指核酸酶介導(dǎo)的基因靶向編輯主要包括基因組突變和基因靶向敲入，廣泛應(yīng)用于基因治療中?；蚪M突變主要指鋅指核酸酶介導(dǎo)產(chǎn)生DNA斷裂，細(xì)胞修復(fù)DNA斷裂時隨機引入或刪除幾個堿基，從而導(dǎo)致單個基因或基因組序列的紊亂，實現(xiàn)基因突變。 Bibikovaetal.(2002)首次利用模塊組裝法設(shè)計了含有3鋅指的鋅指核酸酶，并在熱激蛋白啟動子控制下誘導(dǎo)表達(dá)鋅指核酸酶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雄性果蠅體細(xì)胞的y基因靶位點處發(fā)生了突變，同時，突變個體后腹部出現(xiàn)黃色斑點，說明突變破壞了靶基因功能。目前通過鋅指核酸酶技術(shù)在基因組水平上獲得目標(biāo)靶基因突變的研究已廣泛應(yīng)用于不同的生物，如在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster(Meigen)(Beumeretal.,2008)、斑馬魚Daniorerio(Doyonetal.,2008; Mengetal.,2008)、大鼠Rattusnorregicus、小鼠Musmusculus(Cuietal.,2010)、擬南芥Arabidopsisthaliana(L.) Heynh.(Zhangetal.,2010)和家蠶BombyxmoriL.(Takasuetal.,2010)等模式生物中成功實現(xiàn)了靶基因的敲除或定點修飾。Beumeretal.(2006)利用鋅指核酸酶作用于果蠅的胚胎，對ry和bw基因進(jìn)行突變試驗，結(jié)果表明，2.4%的雄性果蠅發(fā)生bw基因突變。在38 ℃的刺激下，89%的雌性和67%的雄性產(chǎn)生ry基因突變，子代中雌性突變率為14.0%，雄性突變率為6.8%。隨后，Beumeretal.(2008)通過在果蠅胚胎早期注射鋅指核酸酶mRNA，導(dǎo)致靶基因coil和pask的靶向修飾效率達(dá)到10%以上，所獲得的每個基因敲除的純合子個體完全喪失了靶基因的表達(dá)能力。Takasuetal.(2010)使用ZFNs技術(shù), 在家蠶基因組水平上破壞了BmBLOS2基因, 突變個體表現(xiàn)出油蠶表型,并且這種變異成功遺傳到下一代。

2　類轉(zhuǎn)錄激活因子式核酸酶(Transcriptionactivator-like effector nucleases,TALENs)技術(shù)

Bonasetal.(1989)在植物病原菌黃單胞菌Xanthomonas中分離、克隆得到類轉(zhuǎn)錄激活因子(Transcription activator-like effector nucleases,TALE)家族中的第一個成員AvrBs3基因。TALE蛋白類似于真核生物的轉(zhuǎn)錄因子，通過識別并結(jié)合特異的DNA序列調(diào)控生物內(nèi)源基因的表達(dá)，使得宿主生物對外來物的敏感性提高(Boch & Bonas,2010)。周金偉等(2013)對TALEs的結(jié)構(gòu)做了詳細(xì)明了的綜述。C-端、N-端和中間區(qū)域組成了TALE的3個主要部分(Boch & Bonas,2010; Bogdanoveetal.,2010)，通常地，C-端含有一個核定位信號(Nuclear localization signal,NLS)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(Activation domain,AD)，N-端含有轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域(translocation domain,TD)，中間區(qū)域則是能夠和DNA進(jìn)行特異性結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。中間的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域是一段由1.5~33.5個TALE單元組成的重復(fù)氨基酸序列，每個TALE單元由33~35個氨基酸殘基組成(Bochetal.,2010)。TALE蛋白的每個重復(fù)單元高度保守，除了第12和13位的氨基酸殘基可變以外, 其他的氨基酸殘基都是一樣的，稱為重復(fù)可變雙殘基(Repeat variable di-residue,RVD)，第12位氨基酸殘基主要起穩(wěn)定RVD環(huán)的作用，第13位氨基酸殘基決定TALE蛋白所識別的核苷酸(Dengetal.,2012; Maketal.,2012)。RVD決定了TALE蛋白對DNA序列的特異性識別，不同的RVD能夠特異性地識別堿基A、T、C、G中的一種或者多種。目前發(fā)現(xiàn)的RVD種類有5種，分別是氨基酸HD特異識別堿基C、氨基酸NI識別堿基A、氨基酸NN識別堿基G或A、氨基酸NG識別堿基T和氨基酸NK識別堿基A、T、C、G中的任一種(周金偉等，2013； Bochetal.,2009; Morbitzeretal.,2010； Moscou & Bogdanove,2009)。

Meckleretal.(2013)發(fā)現(xiàn)RVD對識別DNA序列的特異性能力為NG>HD~NN>>NI>NK，此外，不同的RVD識別不同堿基的能力也不一樣，如NN對G的親和性大于A，表明TALE蛋白的重復(fù)單元跟DNA堿基之間有很好的一一對應(yīng)關(guān)系。TALENs技術(shù)這種根據(jù)一個重復(fù)單元對應(yīng)一種堿基，將多個重復(fù)單元串聯(lián)在一起來決定識別序列的特異性，理論上可以人為設(shè)計能夠識別并結(jié)合任何DNA序列的TALEs蛋白。由于FokI需要形成二聚體才能發(fā)揮切割作用，因此需要一對TALEN共同作用。2個TALEN識別的DNA位點之間的長度為14~18 bp的DNA序列片段稱為spacer(Milleretal.,2011)。2個TALEN結(jié)合到各自的DNA序列上，此時，2個TALEN中ForkI核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域可在spacer處形成二聚體，對特異的DNA進(jìn)行識別和定點切割，能在特定位點產(chǎn)生DSB作用機制，產(chǎn)生的DSB能夠通過非同源末端連接修復(fù)(NHEJ)和同源介導(dǎo)修復(fù)(HDR)的高度保守的修復(fù)方式進(jìn)行修復(fù)(圖1B)，使TALENs技術(shù)在基因組靶向編輯中起作用。TALEN切割位點的特異性由2個TALEN的識別序列共同決定。因此，TALEN切割DNA的特異性高，在基因組編輯方面有廣闊的應(yīng)用前景。

成功構(gòu)建TALENs是TALE蛋白成功應(yīng)用于基因組工程學(xué)方面的前提。TALENs的構(gòu)建主要包括3個步驟：

第一，TALENs靶位點的選擇：從選定的目的基因序列中找出適合TALE蛋白結(jié)合的目標(biāo)靶點，此步驟是進(jìn)行TALE蛋白設(shè)計的關(guān)鍵。在選擇TALENs靶點時，Cermaketal.(2011)、Christianetal.(2011)和 Reyonetal.(2012)均提出了需要遵循的基本原則，如靶位點5′端的第一位堿基不能是T、靶位點的第二位堿基不能是腺嘌呤A等。此外，可借助公開網(wǎng)站幫助預(yù)測和設(shè)計TALEs靶位點，目前公開網(wǎng)站有https:∥tale-nt.cac.cornell.edu/、http:∥zifit. partners.org/ZiFiT/和http:∥idtale.kaust.edu.sa/等。

第二，TALE蛋白重復(fù)序列的構(gòu)建：制備針對目標(biāo)靶點的特異TALE蛋白，此步驟是TALENs構(gòu)建中最復(fù)雜和重要的環(huán)節(jié)。可以使用全序列人工合成構(gòu)建TALE蛋白重復(fù)序列，也可以采用酶切連接法(Restriction enzyme and ligation,REAL)(Lietal.,2012； Sanderetal.,2011)、基于質(zhì)粒載體或PCR的GG法(Lietal.,2011； Sanjanaetal.,2012； Zhangetal., 2011)、高通量TALENs合成技術(shù)FLASH(Fast ligation-based automatable solid-phase high-throughput)(Reyonetal.,2012)和組裝法(沈延等，2013； Briggsetal.,2012; Schmid-Burgketal.,2013)等方法進(jìn)行構(gòu)建。

第三，TALE蛋白序列與FokI的組裝：在TALE蛋白上選擇合適的FokI結(jié)構(gòu)域，利用分子生物學(xué)方法把TALE和FokI內(nèi)切酶序列進(jìn)行組裝，就可以構(gòu)建出完整的能夠特異性識別目的基因并進(jìn)行切割的TALENs序列。在構(gòu)建TALENs時，要考慮重復(fù)序列跟FokI內(nèi)切酶之間的距離(Milleretal.,2011)，以及TALE蛋白N-端重復(fù)序列的識別親和力比C-端強等(Meckleretal.,2013)。

自從Kayetal.(2007)發(fā)現(xiàn)TALE能夠進(jìn)入細(xì)胞核識別upa20基因的啟動子并調(diào)控upa20基因的表達(dá)，進(jìn)而能控制細(xì)胞的大小, 以及Bochetal.(2009)破譯了TALE的一個重復(fù)單元一個堿基的“密碼”以來, TALENs技術(shù)已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用。Maetal.(2012)使用TALENs技術(shù)，破壞了家蠶BmBLOS2基因，其突變個體表現(xiàn)出油蠶表型；同時還使用2組TALENs在2個位點切割，造成了靶標(biāo)位點中間片段的刪除。Watanabeetal.(2012)同時使用ZFNs技術(shù)和TALENs技術(shù)，針對蟋蟀中的Lac2基因，成功實施了定點敲除。Liuetal.(2012)使用TALENs技術(shù)敲除了果蠅yellow基因。

3　CRISPR/Cas技術(shù)

Ishinoetal.(1987)在K12大腸桿菌的堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)串聯(lián)間隔重復(fù)序列，隨后發(fā)現(xiàn)這種間隔重復(fù)序列廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌的基因組中。這種間隔重復(fù)序列被正式命名為成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)，CRISPR結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，25～50 bp的重復(fù)序列被間區(qū)序列(Spacers)間隔(Jansenetal.,2002)。研究發(fā)現(xiàn)，Cas系統(tǒng)(CRISPR-associated sequences system,CASs)在原核生物中具有某種性免疫功能(Barrangouetal.,2007； Bolotinetal.,2005)。隨后的研究表明，Cas系統(tǒng)是一種原核生物特有的針對噬菌體、質(zhì)粒等外源性遺傳物質(zhì)的免疫保護(hù)系統(tǒng)，通過序列特異的RNA介導(dǎo)，切割降解外源性DNA，從而抵抗外源DNA入侵(Terns & Terns,2011; Wiedenheftetal.,2012)。目前使用的CRISPR/Cas系統(tǒng)識別序列為23 bp，靶向序列20 bp，其識別位點最末3位NGG序列被稱作PAM(Protospacer adjacent motif)序列，該序列對于DNA切割非常重要(Jiangetal.,2013)，也是CRISPR/Cas系統(tǒng)能夠區(qū)分自身DNA和外源DNA的主要原因之一(圖1C)。

CRISPR/Cas系統(tǒng)通常分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型3種類型，每種CRISPR/Cas系統(tǒng)均包含具有核酸酶活性的Cas基因和決定切割位點特異性的2個非編碼RNA：crRNA(CRISPR RNA)和反式激活crRNA(trans-activating crRNA)(Barrangouetal.,2007; Brounsetal.,2008; Makarovaetal.,2011； Marraffinietal.,2008)。Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas系統(tǒng)需要多種蛋白形成復(fù)合物才能行使功能，而Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)組成簡單，僅需要Cas9核酸酶一種蛋白參與即可發(fā)揮功能(Makarovaetal.,2011)，目前已被改造成為基因組靶向編輯的工具。發(fā)揮作用的Cas9核酸酶復(fù)合體由Cas9蛋白、RNA-crRNA前體(RNA pre-crRNA) 和tracrRNA3個組分組成(Congetal.,2013)，即在應(yīng)用CRISPR/Cas系統(tǒng)進(jìn)行基因組編輯時，需要表達(dá)這3個組分。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)crRNA和tracrRNA的結(jié)構(gòu)特性，將crRNA和tracrRNA構(gòu)建成一條嵌合的向?qū)NA(Single guide RNA,sgRNA)，sgRNA具備crRNA：tracrRNA復(fù)合體的功能，從而將CRISPR/Cas系統(tǒng)簡化成Cas9蛋白和sgRNA2個組分(Jineketal.,2012; Malietal.,2013)，且sgRNA的構(gòu)建具有快速、簡便和成本低等優(yōu)點。Cas9蛋白與sgRNA的結(jié)合能夠?qū)崿F(xiàn)在特異位點處切割DNA，Cas9蛋白與不同的sgRNA結(jié)合能夠針對不同的位點進(jìn)行編輯(圖1C)。因此，在對多位點進(jìn)行編輯時，CRISPR/Cas系統(tǒng)具有更明顯的優(yōu)勢。

雖然CRISPR/Cas技術(shù)的應(yīng)用還處于初級階段，但該技術(shù)構(gòu)建容易、成本低、適宜多位點編輯、具有進(jìn)行大規(guī)模篩選試驗的潛力，必然具有廣闊的發(fā)展前景。目前研究人員已成功利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)(Cas9蛋白和sgRNA)對果蠅進(jìn)行靶標(biāo)突變，不同之處是如何使Cas9蛋白和sgRNA共同起作用(Bassett & Liu,2014)。Gratzetal.(2013)使用CRISPR/Cas技術(shù)，通過向果蠅胚胎聯(lián)合注射分別表達(dá)Cas9基因和sgRNA的質(zhì)粒，定點敲除了yellow基因并能傳遞到后代，但該CRISPR/Cas系統(tǒng)僅有5.9%的低突變效率；此外，該系統(tǒng)還能對果蠅進(jìn)行雙位點編輯，從而導(dǎo)致片段刪除。Bassettetal.(2013)和Yuetal.(2013)分別將在體外轉(zhuǎn)錄合成的Cas9 mRNA和sgRNA注射入果蠅早期胚胎中，分別獲得88%和80%的高突變率。由上可見，注射質(zhì)粒和mRNA獲得的突變率存在巨大差別，可能與Cas9和sgRNA表達(dá)水平，或生殖細(xì)胞在胚胎中的表達(dá)時間相關(guān)。Kondo & Ueda(2013)利用CRISPR/Cas體系進(jìn)行果蠅轉(zhuǎn)基因研究，產(chǎn)生分別表達(dá)Cas9和sgRNA的2種轉(zhuǎn)基因果蠅，當(dāng)這2種果蠅雜交時即可獲得高效率的突變體，90%以上的果蠅能產(chǎn)生突變后代；進(jìn)行雙位點編輯時可導(dǎo)致長達(dá)1.6 kb的片段刪除。

利用CRISPR/Cas技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因果蠅研究，雖然突變率高、重復(fù)性好，但分別獲得sgRNA轉(zhuǎn)基因和Cas9轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品、以及在突變后代中去除Cas9和sgRNA轉(zhuǎn)基因需要耗費大量時間。Seboetal.(2013)將編碼sgRNA的質(zhì)粒注射到表達(dá)Cas9的轉(zhuǎn)基因果蠅品系里，發(fā)現(xiàn)注射編碼sgRNA質(zhì)粒的果蠅G1后代中獲得高的突變率，但大部分不育。Renetal.(2013)注射編碼sgRNA質(zhì)粒，并使用nanos啟動子驅(qū)使Cas9表達(dá)，獲得較高比例的可育轉(zhuǎn)基因個體，并在G1后代中產(chǎn)生高的突變率。除了注射表達(dá)sgRNA的質(zhì)粒外，還可直接將體外合成轉(zhuǎn)錄本sgRNA注射到胚胎里、進(jìn)而獲得表達(dá)Cas9的果蠅品系。但是這種技術(shù)的效率如何并未得知，其構(gòu)建體系并未建立(Bassett & Liu,2014)。Bassettetal. (2014)分別使用Actin5c和U6啟動子驅(qū)使Cas9和sgRNA的表達(dá)，成功地在果蠅細(xì)胞系中實現(xiàn)Cas9載體的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高于80%的細(xì)胞產(chǎn)生了高效率的突變。

4　總結(jié)與展望

隨著高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展，越來越多的物種基因組被測序，因此解讀基因組功能顯得日益重要。ZFNs技術(shù)、TALENs技術(shù)和CRISPR/Cas技術(shù)各具不同的優(yōu)勢和局限性(王躍強等,2013; 張智輝等,2013)：

(1)ZFNs技術(shù)的出現(xiàn)使得基因打靶效率大大提高，同時可針對某些特定的序列設(shè)計ZFn，減少了隨機性進(jìn)而實現(xiàn)靶基因的修飾。但由于ZFn的識別結(jié)構(gòu)域中存在上下文依賴效應(yīng)，所以目前尚無法實現(xiàn)對任意一段序列均可設(shè)計出滿足要求的ZFn，也無法實現(xiàn)在每個基因或其他功能性染色體區(qū)段都能夠順利找到適合的ZFn作用位點。由于ZFNs技術(shù)對于DNA序列的識別特異性較低，因此，如何構(gòu)建高特異性的ZFn是目前存在的較大技術(shù)難題。此外，由于ZFn的脫靶切割容易引起細(xì)胞毒性，使得其在基因治療領(lǐng)域的應(yīng)用出現(xiàn)一定的局限性。

(2)相比ZFns技術(shù)，TALENs技術(shù)因為使用了TALE分子作為人工核酸酶的識別結(jié)構(gòu)域，因此具有較高的特異性；但由于TALE蛋白與DNA 堿基一一對應(yīng)，且對堿基的識別只由2 個氨基酸殘基決定，因此設(shè)計較簡單。不足的是TALEN構(gòu)建過程中，TALE分子的模塊組裝和篩選過程比較繁雜，需要大量的測序工作，對于普通實驗室的可操作性較低，而商業(yè)化公司構(gòu)建也需要花費上千美元，使用成本較高。

(3)CRISPR/Cas技術(shù)具有精確性高、系統(tǒng)構(gòu)建簡單和使用成本低、能同時對同一細(xì)胞多個位點進(jìn)行切割等優(yōu)勢。CRISPR/Cas9對靶序列的識別是RNA與DNA的堿基配對過程，只要有一個堿基無法配對，就不會實現(xiàn)Cas9對DNA的切割，降低了脫靶切割的幾率，減少了細(xì)胞毒性。此外，CRISPR/Cas9的構(gòu)建僅僅需要設(shè)計與靶序列互補的RNA即可，過程更為簡單和廉價，普通的實驗室也可自行完成構(gòu)建，大大提高了基因操作的效率及簡便性。并且，CRISPR/Cas9系統(tǒng)是由RNA介導(dǎo)的DNA切割，若在RNA水平上進(jìn)行分子操作，可實現(xiàn)精確且瞬時的切割，較易調(diào)節(jié)切割時間。

但CRISPR/Cas9系統(tǒng)在真核基因組編輯中也存在著一些不足，如，因為Cas9蛋白對于目標(biāo)序列的切割依靠crRNA序列和前間區(qū)序列鄰近基序(PAM)，若目標(biāo)序列周圍不存在PAM或者無法嚴(yán)格配對，則Cas9蛋白不能行使核酸酶的功能，因此CRISPR/Cas9技術(shù)不能對任意序列進(jìn)行切割。此外，由于CRISPR/Cas9系統(tǒng)所靶向的序列僅需十余個堿基對精確配對，可能降低CRISPR/Cas9系統(tǒng)切割的特異性。

目前這幾種基因組編輯技術(shù)在昆蟲遺傳轉(zhuǎn)化研究中的運用還處于初級階段，但其在基因操作方面已表現(xiàn)出較大的成功，因此可以預(yù)測，今后在昆蟲遺傳轉(zhuǎn)化方面必然具有巨大的潛力和廣闊的應(yīng)用前景，將在昆蟲遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)中產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響，也將在實現(xiàn)害蟲遺傳控制中發(fā)揮重要作用。如目前中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院在農(nóng)業(yè)害蟲桔小實蠅遺傳控制方面的研究已取得了較好的前期研究基礎(chǔ)，如已經(jīng)克隆了胚胎分化期特異表達(dá)基因sryα及母體效應(yīng)基因nanos和vasa等胚胎早期高表達(dá)基因，并分離了它們的上游潛在啟動區(qū)序列；克隆了促細(xì)胞凋亡基因hid的cDNA全長；克隆了性別決定基因transformer的cDNA全長并得到了其內(nèi)含子序列，通過分析獲得了其雌性特異剪切元件；并已利用以上分子元件構(gòu)建了雙元件胚胎致死品系所需的胚胎早期驅(qū)動載體和致死效應(yīng)載體。在這些基礎(chǔ)之上，目前正著手用考慮用 CRISPR/Cas來實現(xiàn)多個位點定點敲除，以滿足不同需求的桔小實蠅轉(zhuǎn)化品系。

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(責(zé)任編輯:郭瑩)

+同等貢獻(xiàn)作者(The two authors contributed equally to this work)。

1StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectPests,InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgricultural

Sciences,Beijing100193,China;2DepartmentofEntomology,NorthCarolinaStateUniversity,CampusBox7613,Raleigh,

NC27695-7613,USA；3GeneticEngineeringandSocietyCenterandW.M.KeckCenterforBehavioralBiology,

NorthCarolinaStateUniversity,Raleigh,NC27695-7613,USA；4CenterforManagementofInvasive

AlienSpecies,MinistryofAgriculture,Beijing100193,China

Abstract:The technologies of zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs) and CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR; CRISPR associated protein, Cas) are three major genome editing techniques that have being developed in recent years. The basic principle is to make DNA double-strand break (DSB) damaged in the genome specific sites and to activate the body′s own DNA damage repair mechanism, then causing all sorts of variation in the process. The genome editing techniques have important research prospect in the research of gene function and gene repair. They are also expected to become the main strategy of insect genetic transformation since they have many merits. For example, CRISPR/Cas can be used to edit multiple specific loci in the genome. In this paper, the basic principles of the ZFNs, activation of transcription factor type nucleic acid enzymes and CRISPR/Cas technologies and their applications in insects are briefly introduced. The information provides some references for the use of genome editing techniques in insect genetic transformation.

Key words:CRISPR/Cas technology； genetic transformation； genome editing； transcription activator-like effector nucleases； zinc finger nucleases

通訊作者*(Author for correspondence), E-mail: wanfanghao@caas.cn

作者簡介:王玉生, 男, 碩士研究生。 研究方向： 入侵昆蟲遺傳控制。 E-mail: yushengwang01@163.com； 蔡玉音, 女, 碩士研究生。 研究方向： 昆蟲生物化學(xué)與分子生物學(xué)。 E-mail: caiyuyin1990@163.com

基金項目:環(huán)保公益性行業(yè)科研專項(201409061)； 中德合作科研項目[PPP項目，留金歐(2012)6014和留金歐(2014)6013)]； 農(nóng)業(yè)部2014年農(nóng)作物病蟲鼠害疫情監(jiān)測與防治(外來入侵生物防治)項目； 科技導(dǎo)報社博士生創(chuàng)新研究資助計劃(kjdb201001-3)

收稿日期(Received)： 2015-01-10接受日期(Accepted)： 2015-02-07

DOI:10.3969/j.issn.2095-1787.2015.02.006