李 琦，廖成水*，毛福超，王曉利，張夢珂，張曉潔，張春杰，李銀聚，吳庭才，程相朝,3*

（1. 河南科技大學(xué) 動物科技學(xué)院/洛陽市活載體生物材料與動物疫病防控重點實驗室，河南 洛陽 471023；2. 河南科技大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，河南 洛陽 471023；3. 洛陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 洛陽 471099）

金黃色葡萄球菌是一種典型的食源性革蘭氏陽性菌，人類感染金黃色葡萄球菌的主要臨床癥狀為肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，嚴(yán)重時導(dǎo)致敗血癥和中毒性休克綜合征[1]。在獸醫(yī)臨床上，金黃色葡萄球菌可引發(fā)大部分動物的多種疾病，金黃色葡萄球菌易形成生物被膜，在臨床感染中較難治愈，從而嚴(yán)重?fù)p害動物健康，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。研究發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌引起的急性腸炎和中毒等癥狀與其自身分泌蛋白密切相關(guān)，其分泌蛋白的濃度直接決定了金黃色葡萄球菌的致病力[3]。

細(xì)菌分泌的胞外蛋白是多功能蛋白質(zhì)，在細(xì)菌和人類宿主之間的相互作用過程中發(fā)揮重要作用，如粘附、侵襲、復(fù)制和逃避[4]。其中，胞外蛋白包括蛋白酶、脂肪酶、膠原酶、透明質(zhì)酸酶、幾丁質(zhì)酶和核酸酶等多種酶類[5]。其中核酸酶在各種微生物中廣泛存在，主要參與機(jī)體的營養(yǎng)代謝、遺傳物質(zhì)的復(fù)制、重組和修復(fù)機(jī)制以及微生物感染、免疫等相關(guān)過程[6]。在病原菌感染宿主細(xì)胞的過程中，病原菌通過分泌各種核酸酶水解磷酸二酯鍵將DNA和RNA 消化成寡核苷酸，擴(kuò)大自身可用的核苷酸庫來提供生長優(yōu)勢。已有研究表明致病性病原體可分泌核酸酶，是細(xì)菌的重要毒力因子[7]。

探究細(xì)菌胞外分泌蛋白的特性有助于揭示病原體與宿主互作的分子機(jī)制，但目前關(guān)于金黃色葡萄球菌胞外分泌蛋白核酸酶活性的研究報道較少[8]。因此，本研究通過瓊脂糖凝膠電泳法、瓊脂擴(kuò)散法和瓊脂培養(yǎng)法檢測金黃色葡萄球菌胞外分泌蛋白的核酸酶活性，再利用瓊脂糖凝膠電泳法觀察了溫度、pH 和金屬離子對金黃色葡萄球菌胞外分泌蛋白核酸酶活性的影響，為進(jìn)一步研究金黃色葡萄球菌的致病性和免疫逃逸提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑 金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25923 由洛陽市活載體生物材料與動物疫病防控重點實驗室保存。瓊脂粉購自博奧森生物股份有限公司；瓊脂糖購自北京索萊寶科技有限公司；λDNA（0.2 mg/mL）購自德國Sigma 公司；DNase I 和10×DNase I Buffer 購自寶生物工程（大連）有限公司；BCA蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；腦心浸液培養(yǎng)基（Brian Heart Infusion，BHI）培養(yǎng)基購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；超純水購自北京索萊寶科技有限公司；核酸染料Goodview 購自北京索萊寶科技有限公司；其它化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 金黃色葡萄球菌胞外分泌蛋白的收集將-70 ℃保存的金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株于BHI 平板復(fù)蘇，取單個菌落于BHI 培養(yǎng)基中37 ℃180 r/min培養(yǎng)12 h～16 h。按1∶10 體積比轉(zhuǎn)接至新鮮BHI 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)5 h，4 ℃12 000 r/min 離心10min 后取上清液，透析得到胞外蛋白，利用BCA 蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒測定蛋白濃度，4 ℃保存。

1.3 胞外分泌蛋白的核酸酶活性的測定 采用瓊脂培養(yǎng)法測定胞外分泌蛋白的核酸酶活性，即用50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）配制1.0%瓊脂的BHI 培養(yǎng)基，高壓滅菌后加入λDNA（終濃度為50 μg/mL）和核酸染料（終濃度為1 μg/mL）制備瓊脂平板。將金黃色葡萄球菌菌液稀釋至適當(dāng)濃度，均勻涂于瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h 后利用凝膠成像系統(tǒng)觀察菌落周圍λDNA 的降解程度。

同時采用瓊脂擴(kuò)散法測定胞外分泌蛋白的核酸酶活性，即利用打孔器在該瓊脂平板上打直徑為5 mm 的孔，去除孔中殘留液體。將胞外蛋白加至孔內(nèi)，分別以DNase I 和BHI（腦心浸液肉湯）液體培養(yǎng)基作為陽性對照和陰性對照，37 ℃培養(yǎng)24 h 后于凝膠成像系統(tǒng)下觀察孔周圍λDNA 的降解程度。

采用瓊脂糖凝膠電泳法測定胞外分泌蛋白的核酸酶活性，即按下列參數(shù)配制金黃色葡萄球菌胞外 蛋 白 切 割DNA 的20 μL 反 應(yīng) 體 系：1 μL λDNA（0.1 mg/mL）、5 μL 50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH7.0）和不同濃度的胞外蛋白（終濃度分別為1 μg/mL、2 μg/mL、3 μg/mL、4 μg/mL 和5 μg/mL），補(bǔ) 充ddH2O 至總體積為20 μL，以DNaseI 為陽性對照。混勻后37 ℃水浴30 min，產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后分析。

1.4 溫度對胞外分泌蛋白核酸酶活性影響的測定按照1.3 中瓊脂糖凝膠電泳法測定胞外分泌蛋白的核酸酶活性的方法檢測不同溫度（4 ℃、16 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃、42 ℃、50 ℃和60 ℃）對金黃色葡萄球菌胞外分泌蛋白核酸酶活性的影響。此外，將胞外分泌蛋白經(jīng)65 ℃、70 ℃、75 ℃和80 ℃的溫度處理20 min 后，按照同樣方法檢測胞外分泌蛋白核酸酶活性的熱穩(wěn)定性，采用凝膠成像系統(tǒng)觀察。

1.5 pH 對胞外分泌蛋白核酸酶活性影響的測定參照1.3 中瓊脂糖凝膠電泳法測定胞外分泌蛋白的核酸酶活性的方法，分別向反應(yīng)體系中添加乙酸鹽緩沖液（pH 3.0）、甲苯酸鹽緩沖液（pH 4.0）、醋酸鹽緩沖液（pH 5.0）、檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）、磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）、Tris 緩沖液（pH 8.0）、硼酸鹽緩沖液（pH 9.0）、甘氨酸緩沖液（pH 10.0）、甲胺緩沖液（pH 11.0）和磷酸鹽緩沖液（pH 12.0）5 μL，其它參數(shù)不變，檢測pH 對胞外分泌蛋白的核酸酶活性的影響，采用凝膠成像系統(tǒng)觀察。

1.6 EDTA 對金黃色葡萄球菌胞外分泌蛋白核酸酶活性影響的測定 按1.3 中瓊脂糖凝膠電泳法測定胞外分泌蛋白的核酸酶活性的方法，配置終濃度分別為0.01 mmol/L、0.05mmol/L、0.1 mmol/L、0.5 mmol/L 和1 mmol/L EDTA 的20 μL 反應(yīng)體系，并保持其它參數(shù)不變，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，研究不同濃度的EDTA 對金黃色葡萄球菌胞外分泌蛋白核酸酶活性的影響。

1.7 金屬離子對胞外分泌蛋白核酸酶活性影響的測定按1.3 中瓊脂糖凝膠電泳法測定胞外分泌蛋白的核酸酶活性的方法，配置含終濃度分別為0.01 mmol/L、0.1 mmol/L、1 mmol/L、5 mmol/L 和10 mmol/L 的各金屬離子的20 μL 反應(yīng)體系，并保持其它參數(shù)不變，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，研究Na+、K+、Ca2+、Co2+、Ba2+、Mg2+、Ni2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+和Mn4+對核酸酶活性的影響。

2 結(jié) 果

2.1 測定胞外分泌蛋白的濃度及核酸酶活性 經(jīng)透析純化后的金黃色葡萄球菌的胞外分泌蛋白利用BCA 蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒測定蛋白濃度，結(jié)果顯示獲得的該蛋白濃度為48.5 μg/mL。新鮮培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)觀察可見，在紫外燈下菌落周圍出現(xiàn)黑色區(qū)域（圖1），表明金黃色葡萄球菌的胞外分泌蛋白可降解瓊脂中的λDNA，表現(xiàn)出核酸酶活性。

圖1 瓊脂培養(yǎng)法測定胞外分泌蛋白的核酸酶活性Fig.1 Detection of the nuclease activity of the extracellular proteins by agar culture assay

采用瓊脂擴(kuò)散法測定胞外分泌蛋白的核酸酶活性，結(jié)果顯示胞外蛋白和DNase I 陽性對照孔周圍均出現(xiàn)黑色環(huán)狀區(qū)域，而BHI 培養(yǎng)基陰性對照孔周圍未出現(xiàn)黑色圓環(huán)（圖2）。表明金黃色葡萄球菌分泌的胞外蛋白表現(xiàn)出核酸酶活性。

圖2 瓊脂擴(kuò)散法測定胞外分泌蛋白的核酸酶活性Fig.2 Detection of the nuclease activity of the extracellularproteins by agar diffusion method

將λDNA 和不同濃度的胞外分泌蛋白共孵育后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳法測定，結(jié)果顯示，λDNA與胞外分泌蛋白孵育后被降解成大小不等的DNA 片段，當(dāng)胞外分泌蛋白濃度為1 μg/mL 時λDNA 被輕微的降解，隨著金黃色葡萄球菌胞外分泌蛋白濃度的增加，降解λDNA 的能力也隨之增強(qiáng)（圖3）。結(jié)果進(jìn)一步證實金黃色葡萄球菌胞外分泌蛋白具有核酸酶活性。

2.2 溫度對金黃色葡萄球菌分泌蛋白核酸酶活性影響的檢測結(jié)果 分別于不同溫度下共孵育λDNA和胞外分泌蛋白，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測胞外分泌蛋白核酸酶活性，結(jié)果顯示，胞外蛋白在不同孵育溫度均表現(xiàn)出降解λDNA 的活性，但在較低溫度（4 ℃、16 ℃、25 ℃和37 ℃）時胞外蛋白核酸酶活性較弱，而在42 ℃、50 ℃和60 ℃時胞外蛋白核酸酶的活性較強(qiáng)，且50 ℃時表現(xiàn)出最強(qiáng)的降解λDNA 活性（圖4a）。同時，熱穩(wěn)定性檢測發(fā)現(xiàn)胞外蛋白在超過70 ℃時的核酸酶活性表現(xiàn)出失活狀態(tài)（圖4b）。表明金黃色葡萄球菌胞外分泌蛋白的核酸酶的最適溫度為50 ℃，且胞外核酸酶對70 ℃以上的耐受性較差。

圖3 瓊脂糖凝膠電泳法測定胞外分泌蛋白的核酸酶活性Fig.3 Detection of the nuclease activity of the extracellular proteins by agarose gel electrophoresis

圖4 溫度對胞外分泌蛋白核酸酶活性影響的檢測結(jié)果Fig.4 Effect of different temperature on the nuclease activity of the extracellular proteins

2.3 pH 對金黃色葡萄球菌分泌蛋白核酸酶活性影響的檢測結(jié)果 瓊脂糖凝膠電泳法觀察胞外分泌蛋白在反應(yīng)環(huán)境為pH 3.0～pH 12.0 的核酸酶活性。結(jié)果顯示，金黃色葡萄球菌胞外分泌蛋白在酸性條件下（pH 3.0～pH 6.0）切割λDNA 的活性較差，而在pH 8.0～pH 10.0 的堿性范圍具有良好的核酸酶活性，且pH 9.0 時胞外分泌蛋白切割λDNA 的能力最強(qiáng)，但當(dāng)pH達(dá)到11.0和12.0時核酸酶活性被抑制（圖5）。表明金黃色葡萄球菌胞外分泌蛋白核酸酶的最適pH 為9.0，在酸性條件的反應(yīng)環(huán)境時核酸酶的活性較弱。

圖5 pH 對胞外分泌蛋白核酸酶活性影響的檢測結(jié)果Fig.5 Effect of different pH values on the nuclease activity of the extracellular secreted proteins

2.4 EDTA 對金黃色葡萄球菌胞外分泌蛋白核酸酶活性影響的檢測結(jié)果 配置含不同終濃度EDTA 的20 μL 反應(yīng)體系，并保持其它參數(shù)不變條件下培養(yǎng)，檢測不同濃度EDTA 對金黃色葡萄球菌胞外分泌蛋白核酸酶活性影響，結(jié)果顯示，0.01 mmol/L～1 mmol/L EDTA 對金黃色葡萄球菌胞外分泌蛋白核酸酶活性未產(chǎn)生影響（圖6）。表明，胞外分泌蛋白中不含金屬離子，對實驗結(jié)果不產(chǎn)生影響。

圖6 EDTA 對胞外分泌蛋白核酸酶活性影響的檢測結(jié)果Fig.6 Detection results of EDTA on the nuclease activity of extracellular secreted proteins

2.5 金屬離子對金黃色葡萄球菌分泌蛋白核酸酶活性影響的檢測結(jié)果 在λDNA 和胞外分泌蛋白的反應(yīng)體系中添加不同濃度的金屬離子，測定不同濃度的金屬離子對胞外分泌蛋白核酸酶的影響。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，添加任何濃度（0.01 mmol/L～10 mmol/L）的Ba2+和Mg2+對胞外分泌蛋白的核酸酶活性均無影響；添加低濃度的Na+（0.01mmol/L～0.1 mmol/L）對胞外分泌蛋白的活性無影響，其它濃度的Na+促進(jìn)胞外蛋白核酸酶的活性；除0.01 mmol/L K+對胞外分泌蛋白的核酸酶活性無影響外，其它濃度的K+均有促進(jìn)胞外分泌蛋白的核酸酶活性的作用；低濃度（0.01 mmol/L～1 mmol/L）的Ni2+、Cu2+、和Mn4+提高了胞外分泌蛋白切割DNA 的活性，高濃度（5 mmol/L～10 mmol/L）對胞外分泌蛋白的核酸酶活性無影響。高濃度（5 mmol/L～10 mmol/L）的Ca2+對胞外分泌蛋白的活性具有抑制作用，其它濃度均無影響；高濃度（5 mmol/L～10 mmol/L）的Co2+、Zn2+、Fe3+均提高了胞外分泌蛋白核酸酶的活性（圖7）。表明，不同金屬離子對金黃色葡萄球菌胞外分泌蛋白切割DNA的能力具有不同的影響，其中低濃度（0.01 mmol/L～1 mmol/L）的Ca2+、Ni2+、Cu2+和Mn4+，高濃度（5 mmol/L～10 mmol/L）的Na+、K+和Fe3+可以促進(jìn)胞外核酸酶切割λDNA 的活性；添加Co2+（0.01 mmol/L～10mmol/L）可以促進(jìn)胞外分泌蛋白的核酸酶活性。

圖7 金屬離子對胞外分泌蛋白核酸酶活性影響的檢測結(jié)果Fig.7 Effect of metal ions on the nuclease activity of the extracellular secreted proteins

3 討 論

已有研究證實，微球菌核酸酶是金黃色葡萄球菌的細(xì)胞外磷酸二酯酶，這種酶可水解核糖核酸或脫氧核糖核酸，水解后產(chǎn)生3'-磷酸單核苷酸和二核苷酸，有助于無乳鏈球菌進(jìn)入先天免疫系統(tǒng)并在其中存活和增殖[9]。具有核酸酶活性的胞外分泌蛋白可能有助于金黃色葡萄球菌進(jìn)入非吞噬細(xì)胞或在吞噬細(xì)胞中存活和增殖[10]。本研究通過瓊脂糖凝膠電泳法、瓊脂擴(kuò)散法和瓊脂培養(yǎng)法證實了金黃色葡萄球菌分泌的胞外蛋白具有核酸酶活性，同時探究了溫度、pH 和金屬離子對金黃色葡萄球菌胞外分泌蛋白的核酸酶活性的影響。

溫度、pH 和金屬離子等多種因素可影響核酸酶的活性。一般情況下，微生物產(chǎn)生的核酸酶在pH 值為pH 6.0～pH 10.0 范圍內(nèi)具有活性，且在反應(yīng)環(huán)境pH 值為pH 8.0～pH 8.5 時活性最高[11]。本研究發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌胞外分泌蛋白在pH 為9.0 的堿性條件下核酸酶活性最強(qiáng)，而在pH 3.0～pH 7.0 的酸性條件下胞外分泌蛋白的核酸酶活性較弱，這說明金黃色葡萄球菌胞外分泌蛋白中不存在酸性核酸酶或者含量較少。多數(shù)微生物核酸酶在溫度35 ℃和44 ℃之間表現(xiàn)出高活性[11]，而本研究中的金黃色葡萄球菌胞外分泌蛋白在42 ℃至60 ℃溫度范圍內(nèi)表現(xiàn)出較好的核酸酶活性。如TREX1、FLAP 核酸內(nèi)切酶I（FEN I）和DNase I 等其它的核酸酶的活性最佳溫度是37 ℃，金黃色葡萄球菌胞外分泌蛋白切割DNA 的最適溫度50℃，說明金黃色葡萄球菌分泌的核酸酶可能不屬于FEN I 或DNase I。大多數(shù)核酸酶的活性至少需要Ca2+和Mg2+離子活化[12]。有意思的是，無論低濃度還是高濃度的Mg2+均不能促進(jìn)金黃色葡萄球菌胞外分泌蛋白的核酸酶活性，但低濃度（0.01 mmol/L～1 mmol/L）的Ca2+可促進(jìn)金黃色葡萄球菌胞外分泌蛋白切割DNA 的能力，而高濃度（5 mmol/L～10 mmol/L）的Ca2+對核酸酶活性無影響。一般來說，金屬離子對核酸酶具有雙重作用：既能增強(qiáng)底物對序列或結(jié)構(gòu)特異性的酶的親和力，也能直接參與磷酸氧鍵斷裂的催化作用[13]。高濃度（5 mmol/L～10 mmol/L）的Na+、K+、Co2+和Fe3+提高了金黃色葡萄球菌胞外分泌蛋白切割DNA 的活性，而低濃度（0.01 mmol/L～1 mmol/L）對胞外分泌蛋白核酸酶活性無影響；但低濃度（0.01 mmol/L～1 mmol/L）的Ni2+、Cu2+和Mn4+提高了金黃色葡萄球菌胞外分泌蛋白DNA 的活性，而高濃度（5 mmol/L～10 mmol/L）對胞外分泌蛋白核酸酶活性無影響。由此可以看出，金黃色葡萄球菌胞外分泌蛋白可能存在多種具有活性的核酸酶。

新近的許多研究證實了病原微生物通過分泌胞外核酸酶降解中性粒細(xì)胞細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)的DNA 骨架是逃避免疫殺傷的主要途徑之一[14]。如釀膿鏈球菌分泌的核酸酶A（SpnA）和Spd1、肺炎鏈球菌表面核酸內(nèi)切酶（EndA）和脫氧核糖核酸內(nèi)切酶（TatD）、無乳鏈球菌核酸酶A（NucA）、A 組鏈球菌（GAS）分泌的Sda1 和SdaD2 以及霍亂 弧 菌Dns 和Xds 都是微生物逃避中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)的重要細(xì)胞外核酸酶[15-18]。因此，金黃色葡萄球菌是否也是通過分泌核酸酶的途徑逃避先天性免疫防御值得深入研究，雖然本研究證實了金黃色葡萄球菌胞外分泌蛋白的核酸酶活性，但從核酸酶的部分酶學(xué)特性來看，金黃色葡萄球菌分泌的胞外蛋白中可能含有多種核酸酶。研究表明，金黃色葡萄球菌分泌的一種胞外核酸酶可降解中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)的DNA 骨架，從而逃避胞外誘捕網(wǎng)的捕殺[19]。但更全面得到金黃色葡萄球菌胞外蛋白胞外核酸酶的信息有助于揭示金黃色葡萄球菌的致病性和免疫逃逸。所以，下一步研究將側(cè)重于分離和鑒定金黃色葡萄球菌胞外核酸酶的種類與特性，同時探討金黃色葡萄球菌胞外核酸酶在感染中的確切作用。