黃萌萌，劉 冉，陳 平，朱金魯，衛(wèi) 東，謝 芳，李 剛，劉思國，張躍靈

（中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150069）

通過細菌表面展示系統(tǒng)展示外源抗原，是制備多聯(lián)疫苗、實現(xiàn)一苗多防的有效手段[1-2]。研究顯示，在革蘭氏陽性細菌中有一類錨定于細胞壁的LPxTG 蛋白，其N 端有信號肽（Signal peptide，SP）序列，C 端有胞壁錨定基序（Cell wall anchor motif，CWA），CWA 由LPxTG 序列（x 為任意氨基酸）和一段帶正電荷的尾巴組成。其細胞壁錨定機制如圖1 所示，全長的前體蛋白（Pre-protein）產(chǎn)生于細胞內(nèi)，信號肽酶（Signal peptidase）識別SP 并切割，產(chǎn)生中間體蛋白（Intermediate protein）。中間體蛋白被轉(zhuǎn)運至細胞膜外，但是其C 端被正電荷固定在細胞膜上。位于細胞膜上的分選酶A（Sortase A，SrtA）識別LPxTG 序列，催化T 和G 之間的肽鍵斷裂，并將產(chǎn)生的末端T共價連接到細胞壁的肽聚糖上，最終產(chǎn)生共價錨定于細胞壁的成熟蛋白（Mature protein）（圖1）[3-5]。

圖1 LPxTG 蛋白表面錨定原理及3 種蛋白狀態(tài)Fig.1 Surface anchoring principle of LPxTG protein and its three states

這種LPxTG 蛋白和錨定機制廣泛存在于革蘭氏陽性細菌中[6]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，可以利用外源蛋白替換LPxTG 蛋白的功能區(qū)（Function domain），實現(xiàn)外源蛋白在特定革蘭氏陽性菌表面的錨定[7]。利用這一機制，Dieye 等人采用乳酸菌Usp45 蛋白的SP 和化膿鏈球菌（S.pyogenes）M6 蛋白的CWA，將葡萄球菌核酸酶Nuc 展示在乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）和4 種乳桿菌（Lactobacillus）的表面[7]。這種蛋白表面展示因為是共價結(jié)合，穩(wěn)定性好，而且錨定于細胞壁，能更好地激起機體免疫反應，在表面展示外源抗原、制備多聯(lián)疫苗方面具有巨大的應用潛力。Cortes-Perez 等人發(fā)現(xiàn)，SP 或CWA 序列在蛋白表面展示方面有一定的種屬特異性，例如化膿鏈球菌M6 蛋白的CWA 無法在植物乳桿菌（L. plantarum）表面展示外源蛋白，而替換為植物乳桿菌自身LPxTG蛋白的CWA 時，則能夠?qū)崿F(xiàn)表面展示[1]。因此，要在特定革蘭氏陽性菌中展示外源蛋白，必須篩選和鑒定其自身LPxTG 蛋白的SP 和CWA 信號序列。

豬鏈球菌是一種重要的豬病病原[8-9]，且為革蘭氏陽性細菌，目前尚無豬鏈球菌表面展示外源蛋白的報道。本研究通過分析豬鏈球菌的LPxTG 蛋白及其SP 和CWA 序列，以GFP 為報告基因，構建了豬鏈球菌的蛋白表面展示系統(tǒng)，并初步觀察了其展示蛋白，為豬鏈球菌表面遞呈外源蛋白或抗原提供了新的思路和策略。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 豬鏈球菌2 型05ZYH33 菌株，為中國2005 年四川流行分離株[8]。大腸桿菌MC1061F-感受態(tài)細胞購自上海唯地生物技術有限公司；THB 培養(yǎng)基和LB 培養(yǎng)基購自美國BD 公司；LB（SPC）、THB（SPC）分別為添加100 μg/mL 壯觀霉素（SPC）的LB 和THB 培養(yǎng)基；質(zhì)粒pSET2 由Daisuke Takamatsu 教授惠贈；PrimeSTAR Max DNA 聚合酶購自寶生物工程（大連）有限公司；PCR 產(chǎn)物純化試劑盒和DNA 膠回收試劑盒購自OMEGA 公司；細菌基因組DNA 提取試劑盒、山羊抗兔IgG-HRP 和質(zhì)粒小提試劑盒購自TIANGEN 公司；限制性內(nèi)切酶和T4 DNA 連接酶購自Thermo Scientific 公司；抗GFP 抗體購自GeneTex 公司。

1.2 LPxTG 蛋白的確定及其序列分析 根據(jù)文獻報道，已經(jīng)證實SSU05_0196 為LPxTG 蛋白[10]。采用其CWA 序列，經(jīng)BLAST 分析，初步確定候選LPxTG蛋白。分別利用TMHMM Server 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）和SignalP-5.0 軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進一步分析其跨膜區(qū)和SP。C 末端的CWA 特征序列則通過觀察是否具有LPxTG 氨基酸序列和3 個以上正電荷氨基酸（精氨酸和賴氨酸）來確定。豬鏈球菌強啟動子Peno參見文獻[11]，長度為197 bp。

1.3 引物的設計與合成 根據(jù)gfp 基因和LPxTG 蛋白基因序列，設計擴增gfp、Peno-SP-10aa、10aa-CWA 序列的引物見表1，由哈爾濱博仕生物公司合成。

表1 實驗所用引物信息Table 1 Primers used in this study

1.4 SP、GFP、CWA 編碼DNA 片段的擴增和融合本研究采用的強啟動子Peno和編碼SP、GFP、CWA的DNA 片段融合策略如圖2 所示。LPxTG 蛋白的SP及其下游10 個氨基酸（SP-10aa）和CWA 及其上游10個氨基酸（10aa-CWA）的編碼序列由豬鏈球菌05ZYH33 的 基 因 組（CP000407.1）獲 得。gfp 基 因（KF410617）由BGI tech 公司合成后作為模板，以GFPXhoIF 和GFPSacIR 為引物，擴增獲得兩端含有Xho I/Sac I酶切位點的gfp基因片段。Peno序列融合于各SP-10aa編碼序列起始密碼子前，序列由BGI tech公司合成，再以表1 中相應的引物，分別擴增Peno-SP1-10aa 至Peno-SP10-10aa 的DNA 片 段。以05ZYH33 的基因組DNA 為模板，以表1 中CWA1SacIF/CWA1ERIR至CWA10SacIF/CWA10ERIR為引物，擴增獲得10aa-CWA1 至10aa-CWA10。以構建Peno-SP1-GFP-CWA1融合片段為例，膠回收gfp、Peno-SP1-10aa 和10aa-CWA1 片段，以摩爾比1∶1∶1 混合后Xho I/Sac I 雙酶切?；厥彰盖挟a(chǎn)物，采用T4 連接酶進行連接，連接產(chǎn)物作為模板，以PenoBHIF/CWA1ERIR 為引物，擴增獲得編碼Peno 控制SP1-GFP-CWA1 融合蛋白表達的DNA 片段Peno-SP1-GFP-CWA1。同樣方式，采用表1 中對應編號的引物，獲得融合DNA 片段Peno-SP2-GFP-CWA2 至Peno-SP10-GFP-CWA10，共計構建10 個Peno-SP-GFP-CWA 融合DNA 片段。

圖2 啟動子Peno和蛋白各片段融合策略Fig.2 Fragment fusion strategy for Peno promoter,SP sequence and CWA sequence

1.5 蛋白表面展示質(zhì)粒的構建 構建的Peno-SP1-GFP-CWA1 至Peno-SP10-GFP-CWA10 融 合DNA 片段經(jīng)過BamH I/EcoR I 雙酶切后分別連接同樣酶切處理的pSET2 載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC1061F-。以pSETseqF（5'-AACTGTTGGGAAGGGCGA-3'）/pSETseqR（5'-GTGGAATTGTGAGCGGATAA-3'）為引物，利用菌液PCR 鑒定陽性克隆，由BGI tech 公司測序鑒定，含有正確Peno-SP-GFP-CWA 融合DNA 片段的陽性克隆為正確構建的蛋白表面展示質(zhì)粒，根據(jù)其來源LPxTG 蛋白編號，分別命名為pSsPSD1 至pSsPSD10。

1.6 蛋白表面展示質(zhì)粒轉(zhuǎn)化豬鏈球菌05ZYH33提取上述蛋白表面展示質(zhì)粒，采用文獻[12]的方法轉(zhuǎn)化豬鏈球菌05ZYH33 菌株，涂布THB（SPC）平板，37 ℃，5%CO2過夜培養(yǎng)，獲得含有相應蛋白表面展示質(zhì)粒的豬鏈球菌05ZYH33 株。采用pSETseqF/pSETseqR 為引物進行菌液PCR 鑒定其是否含有pSsPSD1 至pSsPSD10 對應質(zhì)粒，陽性菌株根據(jù)對應質(zhì)粒編號進行命名。

1.7 豬鏈球菌05ZYH33 轉(zhuǎn)化陽性菌株的GFP 表達檢測 將蛋白表面展示質(zhì)粒轉(zhuǎn)化陽性菌株分別接種THB（SPC）液體培養(yǎng)基，37 ℃，5%CO2過夜培養(yǎng)，取5 μL 點樣THB（SPC）固體平板，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)48 h 后觀察綠色熒光。其余液體培養(yǎng)基離心，棄上清后，以轉(zhuǎn)化pSET2 載體的05ZYH33 株作為對照，通過觀察菌體綠色熒光分析GFP 表達情況。

1.8 豬鏈球菌05ZYH33 轉(zhuǎn)化陽性菌株展示蛋白的初步觀察 根據(jù)圖1 所示的原理并參考文獻報道的LPxTG 蛋白表面展示結(jié)果[7]，本研究構建的表面展示系統(tǒng)產(chǎn)生的GFP 存在3 種狀態(tài)，分別是前體蛋白、中間體蛋白和成熟蛋白。采用western blot，以胞壁錨定的成熟GFP 條帶為指標，可以初步觀察蛋白表面展示質(zhì)粒轉(zhuǎn)化陽性菌株的GFP 展示水平。本研究根據(jù)https://web.expasy.org/protparam/網(wǎng)站，計算GFP前體蛋白、GFP 中間體蛋白和GFP 成熟蛋白的分子量。將豬鏈球菌轉(zhuǎn)化陽性菌株分別接種THB（SPC）液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)至OD600nm0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 時離心收集菌體，超聲破碎。獲得的菌體蛋白測定濃度后，SsPSD1、SsPSD2、SsPSD4、SsPSD8、SsPSD9 每泳道上樣30 μg，SsPSD7、SsPSD10 每泳道上樣60 μg，以兔GFP 多克隆抗體（1∶15 000）為一抗，羊抗兔抗體IG-HRP（1∶5 000）為二抗，進行western blot 鑒定。根據(jù)計算的GFP 前體蛋白、中間體蛋白和成熟蛋白的分子量，采用ImageJ 軟件對相應蛋白條帶進行灰度分析，確定3 種狀態(tài)GFP 蛋白的量。以3 個狀態(tài)GFP 蛋白的總量粗略表示GFP 蛋白的表達總量，以GFP 成熟蛋白的量，反映GFP 表面展示水平，從而初步觀察構建的蛋白表面展示質(zhì)粒轉(zhuǎn)化陽性菌株的蛋白表面展示水平。

2 結(jié) 果

2.1 豬鏈球菌05ZYH33 株LPxTG 蛋白序列分析以SSU05_0196 的CWA 序列對豬鏈球菌05ZYH33 菌株基因組進行PHI-BLAST，根據(jù)N 端和C 端均含有跨膜區(qū)，N 端具有SP 序列和C 端具有CWA 特征序列的原則，分析獲得表2 所示的10 種LPxTG 蛋白，其中有4 種已有文獻報道了其功能，并確認其為胞壁錨定蛋白。本文依次將其標記為1～10號LPxTG蛋白。

2.2 SP、GFP、CWA 的編碼DNA 片段的擴增和融合 根據(jù)上述蛋白的基因序列和表1 的引物，分別擴增獲得gfp 基因片段（圖3A）、10 個Peno和SP 融合的片段Peno-SP-10aa（圖3B 上）和10 個CWA 片段10aa-CWA（圖3B 中），電泳檢測結(jié)果顯示各片段均與預期符合（表1）。獲得的gfp、Peno-SP-10aa 和10aa-CWA 片段進行酶切、連接后PCR融合擴增DNA片段Peno-SP-GFP-CWA，PCR 鑒定結(jié)果如圖3B 所示，各片段大小與預期的1 100 bp～1 200 bp 大小相符合，表明獲得了10 個Peno、SP、gfp 和CWA 融合片段Peno-SP1-GFP-CWA1～Peno-SP10-GFP-CWA10。

表2 通過序列分析確定的05ZYH33 株LPxTG 蛋白Table 2 LPxTG protein of strain 05ZYH33 determined by sequence analysis

圖3 DNA 片段的擴增和融合Fig.3 Amplification and fusion of DNA fragments

2.3 蛋白表面展示質(zhì)粒的構建 上述10 個Peno-SPGFP-CWA 融合DNA 片段分別膠回收后，經(jīng)BamH I和EcoR I 雙酶切克隆至pSET2 質(zhì)粒中，PCR 檢測結(jié)果顯示擴增片段大小均與預期符合（圖4），進一步測序顯示插入片段正確，表明10 個蛋白表面展示質(zhì)粒正確構建，分別命名為pSsPSD1～pSsPSD10。

根據(jù)表達策略，這10 個蛋白表面展示質(zhì)粒表達的蛋白序列GFP 上下游分別融合了10 個LPxTG 蛋白的SP 區(qū)和CWA 區(qū)，不同蛋白來源的SP 和CWA 在序列和長度上均存在顯著差異。除了SP 和CWA 序列，另外還有SP 下游10 個氨基酸和CWA 上游10 個氨基酸分別作為SP 和GFP、GFP 和CWA 之間的鉸鏈區(qū)，另外，因為加入Xho I 和Sac I 酶切位點，在GFP上游和下游各引入了2 個氨基酸（圖5）。

圖4 蛋白表面展示質(zhì)粒酶切鑒定Fig.4 Identification of protein surface display plasmids by restriction enzyme digestion

圖5 構建的豬鏈球菌蛋白表面展示質(zhì)粒表達的GFP 融合蛋白序列Fig.5 Sequence of GFP fusion proteins expressed by the constructed S.suis protein surface display plasmids

2.4 蛋白表面展示質(zhì)粒轉(zhuǎn)化豬鏈球菌05ZYH33上述蛋白表面展示質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化豬鏈球菌05ZYH33菌株，pSsPSD3 多次嘗試未獲得轉(zhuǎn)化菌株，其余9 個質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)化獲得了豬鏈球菌克隆。但是以pSETseqF/pSETseqR 為引物，菌液PCR 鑒定顯示，pSsPSD5 和pSsPSD6 無對應的陽性質(zhì)粒片段，其余7 個均含有對應的陽性質(zhì)粒片段（圖6）；經(jīng)測序驗證結(jié)果顯示這7個陽性質(zhì)粒插入序列正確。表明獲得7 個豬鏈球菌轉(zhuǎn)化陽性菌株，根據(jù)對應質(zhì)粒編號，依次命名為SsPSD1、SsPSD2、SsPSD4、SsPSD7、SsPSD8、SsPSD9、SsPSD10。

圖6 豬鏈球菌05ZYH33 轉(zhuǎn)化株PCR 鑒定Fig.6 PCR identification of S.suis 05ZYH33 transformed strain

2.5 豬鏈球菌05ZYH33 轉(zhuǎn)化陽性菌株的GFP 表達檢測 將豬鏈球菌轉(zhuǎn)化陽性菌株接種THB（SPC）液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，分別通過點樣THB（SPC）固體平板和離心收集菌體觀察綠色熒光。結(jié)果顯示，7個轉(zhuǎn)化陽性菌株的菌苔和離心菌體均能夠觀察到綠色熒光（圖7），表明在Peno 啟動子控制下，7 個轉(zhuǎn)化陽性菌株的均能有效表達GFP。

2.6 豬鏈球菌05ZYH33 轉(zhuǎn)化陽性菌株展示蛋白的初步鑒定 利用網(wǎng)站https://web.expasy.org/protparam/計算3 種狀態(tài)GFP 的分子量分別為34.9 ku～36.9 ku、32.1 ku～33.0 ku 和28.7 ku～29.0 ku（表3）。同一狀態(tài)時分子量的差異主要是不同蛋白的SP、CWA 和鉸鏈區(qū)的氨基酸組成不同造成的。

圖7 豬鏈球菌轉(zhuǎn)化陽性菌株GFP 表達的熒光觀察Fig.7 Fluorescence observation of GFP expression in S.suis transformation positive strains

表3 GFP 蛋白3 種狀態(tài)的計算分子量Table 3 Calculated molecular weights of three GFP states

采用western blot 檢測7 個豬鏈球菌陽性菌株中GFP 前體蛋白、中間體蛋白和成熟蛋白的表達情況，結(jié)果顯示，與GFP 熒光觀察結(jié)果一致，7 個豬鏈球菌陽性菌株中均能觀察到GFP 表達，并存在GFP 前體蛋白、中間體蛋白和成熟蛋白3 種狀態(tài)，大小分別對應于表3 的計算分子量（圖8）。

采用ImageJ 軟件對圖8 結(jié)果進行灰度分析，首先分析了處于不同生長時期時成熟GFP 蛋白的產(chǎn)生情況，結(jié)果顯示7 個轉(zhuǎn)化陽性菌株均表現(xiàn)為對數(shù)生長期（OD600nm0.4～0.8）成熟GFP 蛋白產(chǎn)生較多，培養(yǎng)至穩(wěn)定期（OD600nm1.2）后GFP 成熟蛋白的產(chǎn)生量明顯減少（圖8，圖9A）。比較分析OD600nm值0.6 時各轉(zhuǎn)化陽性菌株的GFP 表達總量和成熟GFP 的量，結(jié)果顯示， SsPSD1 和SsPSD9 的GFP 表達總量最高，SsPSD8、SsPSD4 和SsPSD2 次之，SsPSD7 和SsPSD10最低；成熟GFP 蛋白的量則屬SsPSD1、SsPSD8 和SsPSD9 最 高，SsPSD2 和SsPSD4 次 之，SsPSD7 和SsPSD10最低（圖9B）。表明SsPSD1、SsPSD9、SsPSD4和SsPSD8陽性轉(zhuǎn)化菌株表面展示GFP的能力最好，在豬鏈球菌表面展示外源蛋白方面具有很好的潛力。

另外，對比GFP 蛋白3 種狀態(tài)的比例，結(jié)果顯示，SsPSD1、SsPSD4、SsPSD7 和SsPSD10 呈現(xiàn)出前體蛋白（44%～66%）、中間體蛋白（19%～31%）和成熟蛋白比例（15%～21%）依次降低的趨勢，表明它們的SP 和CWA 的切割效率偏低，不能有效地將GFP 前體蛋白加工為中間體蛋白，也不能有效地將中間體蛋白加工為成熟蛋白，造成GFP 前體蛋白和中間體蛋白的積累（圖8，圖9）。SsPSD8 則中間體蛋白很少積累（11%），成熟蛋白比例較高（31%），這表明來 自LPxTG 蛋 白SSU05_1982 的CWA 易 被SrtA 識 別和切割，從而將更多的中間體蛋白加工為成熟蛋白。而SsPSD2 前體蛋白幾乎無積累（7%），中間體蛋白比例（72%）遠高過其它轉(zhuǎn)化陽性菌株（19%～31%），表明來自LPxTG 蛋白SSU05_0214 的SP 易被信號肽酶識別和切割，從而將更多的前體蛋白加工為中間體蛋白。

圖8 轉(zhuǎn)化陽性菌株不同生長期3 種不同狀態(tài)的GFP 的western blot 檢測Fig.8 Western blot detection of three different states of GFP in transformation positive strains at different growth stages

圖9 豬鏈球菌蛋白表面展示系統(tǒng)GFP 的定量分析Fig.9 Quantitative analysis of GFP in S.suis protein surface display systems

3 討 論

LPxTG 蛋白的SP 和CWA 信號表面展示外源蛋白的功能一經(jīng)發(fā)現(xiàn)，就引起了研究者廣泛的興趣，但目前嘗試較多的是將外源抗原展示于乳酸菌的表面[1,2,16]。如果將外源抗原展示于潛在疫苗菌株，則有可能實現(xiàn)制備多聯(lián)疫苗、一苗多防，是多聯(lián)疫苗菌株制備的新思路，而目前還很少有這方面的探索和報道?；谪i鏈球菌是一個重要的豬病病原，注射疫苗是預防豬鏈球菌感染的主要手段[17-18]，本研究采用豬鏈球菌LPxTG 蛋白的SP 和CWA 信號，構建了7 個豬鏈球菌蛋白表面展示系統(tǒng)，其中4 個表現(xiàn)出較高的蛋白表面展示水平，具有在豬鏈球菌表面展示外源蛋白的潛力，從western blot 中成熟蛋白的比例來看，與報道的乳酸菌表面展示水平相當[7]。

目前構建的基于LPxTG 蛋白的SP 和CWA 的蛋白表面展示系統(tǒng)將蛋白展示到表面的水平，與某些菌株內(nèi)源LPxTG 蛋白的展示水平還有很大差距。比如金黃色葡萄球菌LPxTG 蛋白之一蛋白A，western blot 結(jié)果顯示其在金黃色葡萄球菌中以成熟錨定蛋白比例最高，大約為3 種蛋白狀態(tài)總和的70%[19]，而目前的表面展示系統(tǒng)，成熟外源蛋白不足3 種狀態(tài)總和的35%[7]。這一方面可能是SP 和CWA 信號對外源蛋白的兼容性不及內(nèi)源蛋白，這需要進一步研究LPxTG 蛋白的錨定機制，全面了解LPxTG 蛋白錨定的影響因素，再對癥加以解決；另一方面可能是在SP 或CWA 和外源蛋白之間引入的鉸鏈區(qū)太短，造成信號肽酶或SrtA 識別不充分，切割效率低，這可以通過嘗試不同長度的鉸鏈區(qū)來改善[2]；再一方面，根據(jù)本研究結(jié)果，不同SP 和CWA 序列的切割效率不同，暗示可以通過重組效率高的SP 和CWA區(qū)，例如本研究中SsPSD2 的SP 和SsPSD8 的CWA，從而規(guī)避限速步驟，增加成熟蛋白的比例，提高表面展示水平。目前本實驗室正在嘗試從這幾個方面改進豬鏈球菌蛋白表面展示系統(tǒng)的展示水平。另外，本研究在制備蛋白表面展示質(zhì)粒，用于轉(zhuǎn)化豬鏈球菌時，發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒普遍產(chǎn)量偏低，尤其是pSsPSD3，嘗試數(shù)次難以獲得足量的pSsPSD3，因此未獲得pSsPSD3 的陽性轉(zhuǎn)化菌株；pSsPSD5 和pSsPSD6 雖然獲得了轉(zhuǎn)化菌株，但是檢測卻未發(fā)現(xiàn)目的片段，這3 個質(zhì)粒的制備、轉(zhuǎn)化和表面展示能力的觀察目前正在進一步的嘗試中。

最后，對于評價蛋白表面展示系統(tǒng)的方法，雖然通過western blot 檢測成熟蛋白的產(chǎn)生和產(chǎn)量被多個文獻采用[1,19]，且有一定的參考意義，但是具體的表面展示水平還要采用菌體ELISA、菌體組分western blot 以及免疫顯微技術進一步定位表面蛋白。但是由于豬鏈球菌表面存在莢膜，給表面蛋白的檢測造成了一定的困難，目前本實驗室正在進行條件摸索，以期更好地定量豬鏈球菌蛋白表面展示系統(tǒng)的展示水平。

綜上所述，本研究通過DNA 重組并轉(zhuǎn)化豬鏈球菌，得到7 個豬鏈球菌蛋白表面展示系統(tǒng)。這7 個豬鏈球菌蛋白表面展示系統(tǒng)均表現(xiàn)出一定表面展示成熟GFP 的能力，其中SsPSD1、SsPSD9、SsPSD4 和SsPSD8 蛋白表面展示水平較高。本研究為豬鏈球菌表面展示外源蛋白或抗原提供了很好的基礎和重要的參考。