譚克龍，宮愛艷

（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081）

雞傳染性喉氣管炎（Avian infectious laryngotracheitis，AILT）是由傳染性喉氣管炎病毒（Infectious laryngotracheitis，ILTV）感染引發(fā)雞的一種急性、接觸性呼吸系統(tǒng)疾病。ILTV 屬于皰疹病毒科、傳喉炎病毒屬。該病毒傳播速度快，感染率高達(dá)95%～100%，感染后難以清除。該病的致死率根據(jù)ILTV毒力不同以及雞只個體免疫力差異從10%～70%不等，ILTV 可感染所有年齡的蛋、肉、種用家禽，嚴(yán)重影響雞只的生產(chǎn)性能，是一種危害世界養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的重要傳染病[1]。當(dāng)前，防治AILT 主要依賴活病毒疫苗激發(fā)的宿主免疫應(yīng)答。然而，現(xiàn)有疫苗免疫保護(hù)力不強，ILTV 疫苗免疫過的雞場仍然不斷爆發(fā)新的疫情[2]。基于當(dāng)前AILT 防疫現(xiàn)狀，深入研究ILTV 與宿主互作過程有望為研發(fā)安全、長效的AILT免疫制劑提供新思路。

細(xì)胞粘附分子能夠參與機體多種重要的生理功能和病理過程，如組織細(xì)胞間的附著、腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移、各種細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)、作為免疫細(xì)胞識別的輔助受體和協(xié)同活化信號等。已有研究資料顯示，粘附分子可以作為特異性結(jié)合α皰疹病毒的細(xì)胞表面受體，在α皰疹病毒感染宿主的初期參與病毒與宿主細(xì)胞的相互識別，進(jìn)而促進(jìn)病毒感染過程[3]。其中，鈣粘蛋白11（CDH11）和神經(jīng)生長調(diào)節(jié)蛋白1（NEGR1）是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞粘附分子。CDH11 鈣黏附蛋白是一種單鏈跨膜糖蛋白，在細(xì)胞間連接中起到重要作用，可通過TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)細(xì)胞干性的促凋亡腫瘤抑制子[4-5]。NEGR1 是一種借由GPI錨定在細(xì)胞膜表面的蛋白，可通過調(diào)控受體酪氨酸激酶相關(guān)通路，如FGFR2-ERK 信號通路，調(diào)控細(xì)胞形態(tài)[6-7]。已有研究報道，宿主原癌基因酪氨酸蛋白激酶（Src）是ILTV 感染的關(guān)鍵宿主調(diào)控因子，可通過調(diào)控宿主細(xì)胞粘附過程而發(fā)揮作用，多功能蛋白聚糖（VCAN）是其互作主要粘附因子[8]。本研究利用ILTV 毒株感染雛雞，通過ILTV 組織嗜性以及細(xì)胞粘附相關(guān)基因CDH11、NEGR1和VCAN 的表達(dá)水平檢測，探索ILTV 感染組織嗜性與細(xì)胞粘附分子間的關(guān)系，以期為新型免疫制劑的研制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒株及實驗動物 ILTV NP-3 毒株由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所分離保存；SPF 雞由新興大華農(nóng)禽蛋有限公司提供。

1.2 主要實驗試劑 AxyPrep病毒DNA/RNA小量試劑盒購自美國Axygen 公司；One Step PrimeScript?RTPCR Kit Ⅱ（Perfect Real Time）和Premix ExTaqTM（Probe qPCR）購自TakaRa 公司；膠回收試劑盒購自O(shè)mega 公司；TRIzol 試劑購自Invitrogen 公司。

1.3 引物、探針的設(shè)計與合成 參照文獻(xiàn)[8]合成檢測編碼ILTV gC 糖蛋白基因的特異性引物和探針，以及檢測細(xì)胞粘附相關(guān)基因CDH11、NEGR1 和VCAN 特異性引物（表1），引物和探針由北京六合華大基因有限公司合成。

表1 所用的引物及探針序列Table 1 The primer and probe sequences used in this study

1.4 病毒接種動物及樣品采集 將6 只28 日齡的SPF 雞隨機分成兩組，攻毒組用病毒滴度為10-3.0TCID50的ILTV NP-3 病毒株采用滴鼻方式進(jìn)行攻毒，劑量為200 μL/只，對照組接種相同劑量的PBS。于攻毒5 d 后（33 日齡），無菌采集兩組實驗雞喉頭、氣管、哈德氏腺、骨髓、腺胃、肺臟、盲腸、腦、盲腸扁桃體、小腸、大腸、腎臟、十二指腸、胰腺、法氏囊、脾臟、胸腺、肝臟等組織樣品，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 組織中病毒載量的檢測 采用AxyPrep 病毒DNA/RNA 小量提取試劑盒提取采集的組織樣本總DNA，利用設(shè)計的引物ILTV-gC-F/R 及探針I(yè)LTVgC-Probe 對各組織中ITLV 病毒載量進(jìn)行測定。反應(yīng)程序為：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃20 s，40 個循環(huán)，計算病毒含量。

1.6 感染ILTV 雞只各組織中細(xì)胞粘附相關(guān)基因的表達(dá)水平檢測 采用TRIzol 法提取攻毒組和對照組實驗雞各組織的總RNA，利用One Step PrimeScript?RT-PCR Kit Ⅱ檢測各組織中細(xì)胞黏附相關(guān)基因CDH11、NEGR1 和VCAN 的表達(dá)水平。反應(yīng)程序為：42 ℃5 min， 95 ℃10 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，40 個循環(huán)，以18S RNA 為內(nèi)參基因，對比分析檢測結(jié)果，利用SPSS 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.7 細(xì)胞粘附相關(guān)基因表達(dá)水平與ILTV 組織嗜性相關(guān)性分析 分別采用相關(guān)性分析采用肯德爾相關(guān)性系數(shù)（Kendall correlation coefficient）和斯皮爾曼相關(guān)性系數(shù)（Spearman correlation coefficient）檢測1.5 和1.6 中兩組數(shù)據(jù)間的相關(guān)性，當(dāng)p＜0.05 時表示差異顯著。

2 結(jié)果和討論

2.1 雛雞攻毒后不同組織中ILTV 載量檢測結(jié)果利用qPCR 測定SPF 雛雞感染ILTV 后不同組織中病毒載量情況，結(jié)果顯示，喉頭和氣管中ILTV 載量最高，是病毒感染的主要部位；其次在哈德氏腺、骨髓、肺臟、盲腸、腦、盲腸、扁桃體以及小腸樣本中也檢測到ILTV 的存在，而在大腸、腎臟、十二指腸、胰腺、法氏囊、脾臟、胸腺、肝臟等組織中病毒核酸呈陰性（圖1）。以上檢測結(jié)果表明，ILTV 感染存在明顯的組織偏嗜性。

圖1 SPF 雛雞感染ILTV 不同組織中的病毒載量檢測結(jié)果Fig.1 Detection results of viral load in different tissues about SPF chicks infected with ILTV

2.2 雛雞攻毒ILTV 后不同組織中細(xì)胞粘附相關(guān)基因的表達(dá)水平檢測結(jié)果 利用RT-qPCR 檢測細(xì)胞粘附分子CDH11、NEGR1 和VCAN 的基因表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在ILTV 陰性組織中，僅胰腺中CDH11表達(dá)水平上調(diào)，除肝臟中CDH11 表達(dá)水平無顯著變化外，其它組織中均呈現(xiàn)顯著下調(diào)；在ILTV 陽性組織中，盲腸和扁桃體中的CDH11 表達(dá)水平顯著下調(diào)，腦和骨髓中的CDH11 表達(dá)水平顯著上調(diào)，而其它組織則變化不顯著（圖2）。NEGR1 的表達(dá)在ILTV陰性組織十二指腸、胰腺、脾臟和肝臟中均未檢測到，在腎臟中NEGR1 表達(dá)量顯著下調(diào)；在病毒陽性組織中，NEGR1 僅在骨髓中無表達(dá)，在喉頭、腦表達(dá)下調(diào)，其中喉頭下調(diào)顯著。VCAN 的表達(dá)除在法氏囊中顯著上調(diào)外，在其它ILTV 陰性和陽性組織中均無明顯變化。以上結(jié)果初步表明，雛雞感染ILTV后CDH11 和NEGR1 的組織表達(dá)模式與病毒的組織偏嗜性呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，而VCAN 的表達(dá)與病毒的組織偏嗜性無相關(guān)性。

圖2 細(xì)胞粘附相關(guān)基因在不同組織中的表達(dá)Fig.2 The expression of cell adhesion related genes in different tissues

2.3 相關(guān)基因表達(dá)水平與ILTV 的組織分布相關(guān)性分析 利用SPSS 16.0 軟件對影響皰疹病毒感染生物學(xué)過程相關(guān)基因的表達(dá)水平變化與ILTV 的組織分布進(jìn)行相關(guān)性分析，判定標(biāo)準(zhǔn)為0.5≤|r|＜0.8 中度相關(guān)，0.3≤|r|＜0.5 低度相關(guān)，|r|＜0.3 關(guān)系極弱，認(rèn)為不相關(guān)。結(jié)果顯示，CDH11 的表達(dá)水平與ILTV 在各組織分布呈中度正相關(guān)，NEGR1 的表達(dá)水平變化與ILTV 在各組織分布呈低度正相關(guān)，VCAN 的表達(dá)水平變化與ILTV 在各組織分布相關(guān)性并不顯著（表2），提示ILTV 在感染過程中可能需要通過宿主CDH11和NEGR1 調(diào)控宿主細(xì)胞的代謝、凋亡及細(xì)胞骨架等借由細(xì)胞粘附分子引發(fā)調(diào)控的生物學(xué)過程來促進(jìn)病毒的增殖和擴散。Kendall 和Spearman 兩種分析方法所得到的相關(guān)性結(jié)果一致。

表2 基因的表達(dá)水平變化與ILTV 在各組織分布的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of gene expression level changes and ILTV distribution in different tissues

綜上所述，本研究分析了ILTV 感染宿主后病毒在宿主體內(nèi)的組織分布與宿主細(xì)胞粘附相關(guān)基因表達(dá)水平的相關(guān)性，提示機體細(xì)胞粘附相關(guān)生物學(xué)過程可在ILTV 體內(nèi)感染中起到關(guān)鍵作用，為闡明ILTV 感染組織嗜性差異機制奠定了基礎(chǔ)。