丁海燕，馮 偉，李凌智，黃永紅，張 虹 (大慶師范學院生物工程學院，黑龍江大慶 163712)

菌落原位雜交技術在環(huán)境微生物檢測中的應用

丁海燕，馮 偉，李凌智，黃永紅，張 虹 (大慶師范學院生物工程學院，黑龍江大慶 163712)

微生物技術在處理環(huán)境污染物等方面具有成本低、無二次污染、反應條件溫和等優(yōu)點。為從根本上解決環(huán)境問題，就環(huán)境中微生物的檢測為主題，介紹了菌落原位雜交的原理以及在環(huán)境微生物檢測中的應用。

菌落原位雜交；環(huán)境微生物；檢測

20世紀70年代，Pardue 等[1]和 John等[2]成功開發(fā)了原位雜交技術，他們利用放射性同位素標記的 DNA 作探針與爪蟾卵細胞制片雜交，通過顯微放射自顯影檢測雜交信號，檢測出細胞與探針互補核酸序列。這是最初的原位雜交技術，開創(chuàng)了采用分子生物學技術研究細胞遺傳學的歷史。此后，隨著該項技術的進一步發(fā)展，原位雜交技術很快成為醫(yī)學、遺傳學、環(huán)境微生物學的重要技術[3]。

根據(jù)標記物的不同，探針可分為同位素標記探針和非同位素標記探針。常用的同位素有32P、35S、3H、125I。同位素標記探針具有靈敏性高、背底較為清晰等優(yōu)點，但其缺點是具有放射性，對人和環(huán)境有傷害。非同位素標記探針近年應用較廣泛，常用的非同位素標記物有熒光素、生物素、地高辛。按照核酸性質的不同，又可分為DNA探針、RNA探針、cDNA探針、寡核苷酸探針。隨著原位雜交技術的發(fā)展，原位雜交又逐漸細化為菌落原位雜交和組織原位雜交。筆者介紹了菌落原位雜交的原理以及在環(huán)境微生物檢測中的應用。

1 菌落原位雜交基本原理

菌落原位雜交的過程是將瓊脂平板中培養(yǎng)的細菌轉置于硝酸纖維素濾膜上，然后使培養(yǎng)的菌落裂解釋放出其中的DNA，烘干DNA固定在膜上，和標記的探針雜交，用放射自顯影或熒光顯微鏡等方法檢測菌落雜交信號，并與平板上的菌落對位。

組織原位雜交通常簡稱為原位雜交，主要是指組織或細胞層次的原位雜交。菌落原位雜交與組織原位雜交的不同是：菌落原位雜交需要裂解細菌釋放出DNA，與標記探針進行雜交；組織原位雜交是通過酶解等方法改變組織細胞的透過性，讓探針能夠進入組織細胞內與待檢測核酸序列雜交[4]。

目前，原位雜交技術多種多樣，如熒光原位雜交技術、基因組原位雜交技術等。但對于環(huán)境中存在的微生物進行測試時，菌落原位雜交仍是最常用的方法。

2 菌落原位雜交在環(huán)境微生物多樣性診斷中的應用

長期以來，純培養(yǎng)一直是研究環(huán)境微生物的主要方法，由于環(huán)境微生物中能被培養(yǎng)出來的只有很小一部分，只有 非常少的微生物能被分離和鑒定，所以進行微生物多樣性分析時，其結果通常是有局限性的。在不同環(huán)境微生物研究時發(fā)現(xiàn)，高達99%以上的微生物不能通過常規(guī)方法培養(yǎng)[5]，由于核酸序列能夠提供遺傳距離、分子雜交探針等信息，可用于自然生態(tài)系統(tǒng)中微生物的鑒定[6]。環(huán)境微生物與菌落原位雜交技術的結合，對于環(huán)境微生物組成、結構與功能的研究有極大幫助，尤其是具有特殊分層結構，多樣化代謝菌群共存與協(xié)同偶合等特性的顆粒污泥，對于深層次了解環(huán)境微生物群落結構、種群的關系和處理效率的相關性，進一步提高廢水處理效率具有極重要的理論和實用意義。利用菌落原位雜交技術研究自然環(huán)境微生物群落結構的報道很多，如海水沉積物[7]的群落，高山湖雪水[8]的浮游菌體，海水[9]和河水[10]的群落特征，土壤[11]和根系表面[12]的寄居群落。此外，新的種屬或一些未被培養(yǎng)的種屬鑒定，菌落原位雜交技術發(fā)揮了重要作用。菌落原位雜交技術[13-14]在探索菌群的生態(tài)學成分，以及外界條件對群落的動態(tài)影響方面均是非常有力的技術手段。

3 菌落原位雜交在污水微生物檢測中的應用

1914年，Ardern 和 Lockett發(fā)明了活性污泥污水處理方法。人們通過檢測特異底物的轉化率，如耗氧速率、磷吸收和釋放、硝化、反硝化、Fe3+的還原等方法，研究活性污泥中重要功能菌群的活性[15]。而菌落原位雜交技術的應用可以完整地展現(xiàn)出菌落的空間排列順序，數(shù)量的多少等一系列信息，所以利用菌落原位雜交和放射自顯影技術研究廢水處理系統(tǒng)中微生物的數(shù)目、活性和對特異底物的消耗，效果顯著。

3.1 硝化細菌微生物中硝化細菌和氨氧化菌的數(shù)目與空間分布嚴格限制硝化和反硝化過程所處的階段，因此在調控廢水脫氮的運行工藝中，生物處理系統(tǒng)中硝化細菌和氨氧化菌的研究極為重要。硝化細菌是一類化能自氧菌，傳統(tǒng)的研究方法耗時長，要經過富集、分離、分類和鑒定等步驟，又因所用的培養(yǎng)基有選擇性，使某些易于培養(yǎng)的菌株，如Nitrosomonaseuropaea和Nitrobacter winogradskyi等超過了其他硝化細菌，這樣得到的優(yōu)勢類群與樣品真實情況有明顯差異。菌落原位雜交技術的引入解決了上述難題。通過人工設計合成的硝化細菌和氨氧化菌探針，對污水污泥中硝化細菌的多樣性采用菌落原位雜交法進行了跟蹤分析，發(fā)現(xiàn)許多具有優(yōu)勢的硝化菌加以培養(yǎng)后，真正實現(xiàn)了工業(yè)污水、廢水的硝化處理。

3.2 除磷細菌除磷脫氮工藝在廢水處理工程中已被廣泛應用，特別是強化除磷(EBPR)工藝，對污水的除磷效果尤為顯著。國內外研究者對不同除磷工藝中聚磷菌的生態(tài)變化進行了分子雜交分析。菌落原位雜交技術的應用克服了除磷菌難以用常規(guī)方法培養(yǎng)的困難，對生物除磷工藝的改進起到了指導性作用。

3.3 難降解有機物功能降解菌近年來，大量學者將原位分子雜交技術應用于功能降解菌的生態(tài)變化研究中，克服了功能降解菌用常規(guī)方法培養(yǎng)的困難，真正開創(chuàng)了一個有效利用生物降解的綠色時代。

4 小結

盡管菌落原位雜交技術應用于環(huán)境微生物群落分子生態(tài)研究中還存在一些問題，如同位素的放射性對人體的傷害，試驗周期較長等，但因其高度的靈敏性和準確性，仍受到許多科研人員的歡迎，并廣泛應用于微生物檢測、菌落定位等研究領域。環(huán)境微生物學的研究可以從菌落原位雜交技術中得到大量信息，且隨著技術的不斷進步，菌落原位雜交的準確性和靈敏度將進一步提高，必將在環(huán)境微生物群落結構研究領域得到更加充分的應用，對工業(yè)廢水的污染控制作出貢獻

[1] PARDUE M L，GALL J G.Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological peparations [J].Proc Natl Acad Sci USA，1969，64：600-604.

[2] JOHN H，BIRNSTILEL M，JONES K.RNA：DNA hybrids at the cytogenetical level[J].Nature，1969，223：582-587.

[3] 呂忠進，成美英.核酸原位雜交技術及其進展[J].生物技術，1993，3(1)：1-4.

[4] 黃浩杰，張錫然，崔英霞，等.應用熒光原位雜交(FISH)技術研究復雜的染色體易位[J].遺傳學報，1996，23(5)：338-340.

[5] AMANN R I，LUDWIG W，SCHLEIFER K H.Phylogenetic identification and insitudetection of individualmicrobial cells without cultivation[J].Microbiol Rev，1995，59：143-169.

[6] PACE N R.A molecular view of microbial diversity and biosphere[J].Science，1997，276：734-740.

[7] LLOBET-BROSSA E，ROSSELLO-MORA R，AMANN R I.Microbial community composition of Wadden Sea sediments as revealed by fluorescencein situhybridization[J].Appl Environ Microbiol，1998，64：2692-2696.

[8] WEISS P，SCHWEITZER B，AMANN R，et al.Indentificationin situand dynamics of bacteria on limn etic organic aggregates(lake snow)[J].Appl Environ Microbiol，1996，62：1998-2005.

[9] ALFRIDER A，PERNTHALER J，AMANN R，et al.Community analysis of the bacterial assemblages in the winter cover and pelagic layers of a high mountain lake byin situhybridization[J].Appl Environ Microbiol，1996，62：2138-2144.

[10] KENZAKA T，YAMAGUCHI N，TANI K，et al.rRNA-targeted fluorescentin situhybridization analysis of bacterial community structure in river water[J].Microbiology，1998，144：2085-2093.

[11] FELSKE A，AKKERMANS AD L，DE VOS WM.In situdetection of an uncultured predominant Bacillu -sin dutch grassland soil[J].Appl Environ Microbiol，1998，64：4588-4590.

[12] MACNAUGHTON S J，BOOTH T，EMBLEY T M，et al.Physical stabilization and confocal microscopy of bacteria on roots using 16S rRNAtargeted fluorescentlabeled oligonucleotide probes[J].J Microbiol Methods，1996，26：279-285.

[13] 陳書琨，沈正達，胡永浩，等.一種改良的快速篩選重組DNA 噬菌體噬斑的原位雜交技術[J].生理化學與生物物理進展，1992，19(5)：382-384.

[14] 胡永浩，蔣正軍.改良菌落原位雜交快速篩選 NDV F 基因陽性克隆株[J].中國獸醫(yī)科技，1998，28(11)：20-21.

[15] 趙現(xiàn)方，陳林海，李宗義，等.流式細胞術檢測活性污泥中微生物的群落結構[J].河南師范大學學報：自然科學版，2006，34(3)：124-125.

Application of Colony in situ Hybridization in Detection of Environmental Microorganisms

DING Hai-yan, FENG Wei, LI Ling-zhi et al

(School of Biological Engineering, Daqing Normal University, Daqing, Heilongjiang 163712)

Microbial technology in the treatment of environmental pollutants has the advantages of low cost, no two pollution, mild reaction conditions etc. In order to fundamentally solve the environmental problems, this paper introduces the principle of colony in situ hybridization and its application in the environmental detection of microorganism.

Colony in situ hybridization; Environmental microorganism; Detection

黑龍江省教育廳科學技術研究項目(12513004)；大慶師范學院科學研究基金項目(12ZR04)。

丁海燕(1973- )，女，黑龍江大慶人，副教授，從事生物技術研究。

2015-03-27

S 188；X 172

A

0517-6611(2015)14-025-02