劉浩，梁香麗，張宗山

(1．寧夏農(nóng)林科學(xué)院植物保護研究所，寧夏植物病蟲害防治重點實驗室，寧夏 銀川 750002;2．賀蘭縣林木檢疫站，寧夏 賀蘭 750200)

寧夏回族自治區(qū)是寧夏枸杞Lycium barbarum L．的主要產(chǎn)區(qū)，枸杞種植是自治區(qū)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展的四大支柱產(chǎn)業(yè)之一。2013年全區(qū)枸杞種植面積達到6．13萬hm2，干果總產(chǎn)量突破15萬t，總產(chǎn)值超過50億元。

枸杞蚜蟲Aphis sp．屬同翅目Homoptera蚜總科Aphidoidea，是寧夏枸杞三大害蟲之一，在整個生長季節(jié)均能造成危害，全國枸杞種植區(qū)均有分布。枸杞蚜蟲多聚集在嫩葉、嫩芽、花、果實上刺吸汁液，致使嫩梢呈褐色枯萎狀，甚至死亡;發(fā)生嚴(yán)重時葉片上覆蓋油漬狀蚜蟲分泌物，不僅影響光合作用，使樹勢衰弱，還嚴(yán)重影響枸杞的開花結(jié)果，造成大量落花落果、減產(chǎn)20%左右，給茨農(nóng)造成巨大的經(jīng)濟損失。

防治枸杞蚜蟲可采用的方法很多［1］。其中使用面積最大的是化學(xué)藥劑防治方法［2］，防治效果較好，但是會殺傷益蟲、致使害蟲產(chǎn)生抗藥性、造成殘留安全隱患［3］;高殘留化學(xué)農(nóng)藥也降低了枸杞的品質(zhì)，增加了產(chǎn)品進入國際市場的難度［4］。雖然近年也有生物農(nóng)藥如Bt［5］、吡蟲啉［6-7］、扁蓄Polygonum aviculare等提取物［8-12］防治枸杞蚜蟲，但仍不能達到持續(xù)控制枸杞蚜蟲的效果。因此，找出更加安全有效、環(huán)境友好的防治方法是枸杞蚜蟲防治的關(guān)鍵;探尋新的生物防治途徑是寧夏枸杞生產(chǎn)單位的期盼，也是植物保護研究的發(fā)展方向。劉浩 等曾探索應(yīng)用蠟蚧輪枝菌Lecanicillium lecanii防治枸杞蚜蟲［13］，本文作者研究寧夏本地球孢白僵菌Beauveria bassiana菌株對枸杞蚜蟲的致病性和影響致病性的環(huán)境因素，以期為寧夏枸杞蚜蟲無公害防治提供更多選擇和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 球孢白僵菌對枸杞蚜蟲高致病性菌株的篩選

1.1.1 供試菌株 2009—2013年，從寧夏的石嘴山市惠農(nóng)區(qū)、銀川市西夏區(qū)、賀蘭縣、中衛(wèi)市中寧縣、吳忠市同心縣、固原市西吉縣采集枸杞與農(nóng)田土壤樣品，通過大蠟螟Galleria mellonella L．幼蟲誘集、分離、純化，得到球孢白僵菌菌株56株。通過比較，選擇生長速度快、孢子產(chǎn)量高及環(huán)境抗逆性強的4個菌株，用于篩選對枸杞蚜蟲高致病性的菌株(表1)。

表1 用于對枸杞蚜蟲高致病性篩選的4株球孢白僵菌

1.1.2 高致病性菌株的篩選方法

1.1.2.1 孢子懸浮液的配制 用0．003 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液收集PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)好的球孢白僵菌分生孢子，過濾后，用0．1%吐溫-80無菌水配成濃度分別為1．0×108，1．0×107，1．0×106，1．0×105，1．0×104孢子/mL的孢子懸浮液各50 mL備用(孢子萌發(fā)率95%以上)。

1.1.2.2 接種與觀察 將健康、個體大小基本一致的無翅成蚜連同枸杞葉浸入配制好的球孢白僵菌分生孢子懸浮液中，2 s后迅速取出;將處理過的枸杞蚜蟲連同枸杞葉放入鋪有潮濕濾紙的培養(yǎng)皿中，另放入新鮮枸杞葉片飼養(yǎng)，培養(yǎng)皿用帶有小孔的保鮮膜覆蓋;用含0．1%吐溫-80的無菌水作空白對照。每個處理3個重復(fù)。將各處理置于24℃、光照條件為12L∶12D的人工氣候箱中。連續(xù)觀察7 d，每天定時觀察記載蚜蟲死亡情況。蟲尸保濕培養(yǎng)，蟲體表面長出白色菌絲或分生孢子時用顯微鏡檢查以確定是否為球孢白僵菌感染致死。

1.1.2.3 數(shù)據(jù)分析 計算球孢白僵菌侵染枸杞蚜蟲的死亡率和校正死亡率。

用幾率值分析法，將蟲體平均累計校正死亡率進行幾率值轉(zhuǎn)換后，采用DPS軟件進行新復(fù)極差統(tǒng)計分析，分別對劑量和時間作線性回歸分析，建立直線回歸模型，計算致死中濃度LC50和致死中時間LT50。

1.2 環(huán)境因子對球孢白僵菌致病性的影響

1.2.1 溫度對球孢白僵菌致病性影響的測定 將枸杞蚜蟲浸泡在球孢白僵菌1．0×106孢子/mL孢子懸浮液中3 s，用濾紙吸干表面的水分，接種在新鮮枸杞葉片上，以0．1%吐溫-80的無菌水作為對照，每個處理3個重復(fù)，每重復(fù)50頭供試枸杞蚜蟲。分別置于19，22，25，28，31℃共5個溫度梯度下，在光照條件16L∶8D、相對濕度＞90%的培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)。每3 d換1次新鮮葉片，每天檢查試蟲生長情況，連續(xù)觀察10 d，記錄死亡數(shù)量，計算校正死亡率。

1.2.2 濕度對球孢白僵菌致病性影響的測定 將枸杞蚜蟲浸泡在球孢白僵菌1．0×106孢子/mL孢子懸浮液中3 s，用濾紙吸干表面的水分，接種在新鮮枸杞葉片上，以0．1%吐溫-80的無菌水作為對照，分別放入40%，45%，50%，55%，90%5個濕度梯度處理的密閉干燥器中。每處理3個重復(fù)，每重復(fù)50頭供試枸杞蚜蟲。在干燥器的下面放不同的鹽溶液，形成不同的濕度環(huán)境，具體如下:相對濕度40%，NaOH 315．8 g/L;相對濕度45%，NaOH 298．6 g/L;相對濕度50%，NaOH 281．6 g/L;相對濕度55%，NaOH 246．2 g/L;相對濕度90%，水。將干燥器置25℃恒溫箱中，每3 d換1次新鮮葉片，每天檢查試蟲生長情況，觀察10 d，記錄死亡數(shù)量，計算校正死亡率。

1.2.3 紫外線對球孢白僵菌孢子存活率影響的測定 用0．1%吐溫-80的無菌水配制球孢白僵菌分生孢子懸浮液，濃度以在顯微鏡400倍視野下，血球計數(shù)板上每小格4～8個孢子為宜。用滅菌培養(yǎng)皿裝5 mL分生孢子懸浮液，在磁力攪拌下用紫外燈(30 W，出廠時紫外線輻射強度＞100 LW/cm2，照射距離為20 cm)照射，紫外線照射時間分別為1，2，3，4，5 min。照射后采用PDA培養(yǎng)液載片懸滴法，在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，鏡檢，檢查孢子萌發(fā)率，調(diào)查視野1000個孢子，每個處理5個重復(fù);計算紫外光對孢子的殺傷率。

2 結(jié)果與分析

2.1 高致病性菌株致死中時間、致死中濃度篩選的4株寧夏本地球孢白僵菌菌株對枸杞蚜蟲的致死中濃度由低到高依次為2號，1號，4號，3號菌株(表2)。致死中時由短到長依次為2號，1號，3號，4號菌株(表3)。

表2 4株球孢白僵菌對枸杞蚜蟲的致死中濃度

表3 4株球孢白僵菌對枸杞蚜蟲的致死中時

2.2 環(huán)境因子對球孢白僵菌致病性的影響

2.2.1 溫度對球孢白僵菌致病性影響 球孢白僵菌對枸杞蚜蟲的侵染校正死亡率在19～31℃條件下，隨著溫度的升高逐漸升高。在22～28℃內(nèi)，校正死亡率的升高速率最快，在31℃下，校正死亡率最高，最有利于白僵菌侵染枸杞蚜蟲(圖1)。

圖1 不同溫度下白僵菌寄生枸杞蚜蟲致死曲線

2.2.2 濕度對球孢白僵菌致病力影響 在相對濕度40%～90%條件下，隨著濕度的升高，球孢白僵菌對枸杞蚜蟲的侵染校正死亡率逐漸升高，相對濕度90%最有利于白僵菌侵染枸杞蚜蟲(圖2)。

2.2.3 紫外線對球孢白僵菌孢子萌發(fā)的影響 在照射不同時間條件下，隨著紫外線照射時間的延長，球孢白僵菌孢子萌發(fā)抑制率升高;通過擬合直線回歸方程和計算，在孢子萌發(fā)抑制率達50%時，紫外線照射時間為3．18 min(圖3)。

圖2 不同濕度條件下白僵菌對枸杞蚜蟲的致死率

圖3 紫外線對白僵菌孢子萌發(fā)的抑制回歸線

3 結(jié)論與討論

篩選高致病性球孢白僵菌菌株為防治枸杞蚜蟲提供了優(yōu)質(zhì)菌種，LD50為1．7×106孢子/mL，LT50為4．46 d(1．0×106孢子/mL)，達到田間應(yīng)用的要求。相對濕度90%時球孢白僵菌防治枸杞蚜蟲的校正死亡率極顯著高于其他濕度條件的死亡率，為將來生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

寧夏屬于溫帶大陸性氣候，生產(chǎn)季節(jié)多數(shù)時間田間濕度低于相對濕度60%，只有夜間、雨后短時間能夠達到或超過相對濕度90%，能否充分利用濕度合適期開展防治，是該項技術(shù)能否大面積發(fā)揮作用的關(guān)鍵。

紫外線影響因素的研究結(jié)果，為應(yīng)用球孢白僵菌防治枸杞蚜蟲提供了技術(shù)參數(shù);田間施用應(yīng)當(dāng)避開日光強烈時段，或者在白僵菌孢子懸浮液中加入光穩(wěn)定劑，避免紫外線的傷害，以提高防治效果。試驗設(shè)計中，未將觀察時間延長至36 h或更長，缺乏對菌株孢子光修復(fù)和暗修復(fù)能力的考慮，將在今后的試驗中補充完善。

寧夏本地蟲生真菌球孢白僵菌的發(fā)現(xiàn)、研究和防治應(yīng)用，開啟了地區(qū)生物防治害蟲的新篇章，對于今后枸杞蚜蟲無公害防治、枸杞有機產(chǎn)品生產(chǎn)等具有重要意義。

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