竇海波，文秀麗

體育運(yùn)動中結(jié)締組織生長因子對肌腱干細(xì)胞分化的影響

竇海波，文秀麗

肌腱是連接骨骼和肌肉的結(jié)締組織，在神經(jīng)的支配下可完成有效的動作。肌腱主要由成纖維細(xì)胞和胞外基質(zhì)組成，本身為致密結(jié)締組織，其胞外基質(zhì)主要由I型和II型膠原組成，是致密而平行排列的膠原纖維束，纖維之間由少量的蛋白多糖與糖胺聚糖相連接。以往的研究認(rèn)為肌腱是一種惰性組織，代謝并不活躍。然而，近來的多項(xiàng)研究表明，肌腱內(nèi)同樣存在著活躍的代謝過程，運(yùn)動可對肌腱的組織形態(tài)、力學(xué)性能和代謝過程產(chǎn)生重要的影響［1］。其中，肌腱成纖維細(xì)胞起著重要作用，其可將肌腱組織所承受的力學(xué)負(fù)荷轉(zhuǎn)化為電信號，并將力學(xué)刺激在細(xì)胞間傳遞，從而調(diào)控對肌腱的動態(tài)更新和平衡1。

隨著干細(xì)胞研究的深入，肌腱干細(xì)胞可以從人、大鼠、小鼠等一系列哺乳動物的肌腱中分離獲得。肌腱干細(xì)胞相比成纖維細(xì)胞體型較小，呈靜電的鵝卵石狀，表達(dá)包括OCT4、SSEA-4、CD29、CD44等多種干細(xì)胞表面標(biāo)記物2。且有研究發(fā)現(xiàn)CD44是多種組織損傷后修復(fù)期的標(biāo)志［2］。同時(shí)，肌腱干細(xì)胞通過不對稱分裂，有效的補(bǔ)充肌腱內(nèi)成纖維細(xì)胞，保持整個(gè)肌腱的動態(tài)活性平衡，因而對整個(gè)肌腱起著至關(guān)重要的作用。研究表明，肌腱干細(xì)胞具有多向分化潛能，可以向骨、軟骨、脂肪和肌腱成纖維細(xì)胞分化3。對于調(diào)控肌腱干細(xì)胞定向分化的信號機(jī)制及誘導(dǎo)因素并不十分明確，但是細(xì)胞生長的微環(huán)境及各種外界刺激對干細(xì)胞的分化方向有重要的影響。目前有研究表明肌腱干細(xì)胞可以受力學(xué)刺激、生物活性因子等影響，從而進(jìn)行分化、胞外基質(zhì)分泌和促進(jìn)肌腱組織形成［3］。

在體育運(yùn)動中，急性和慢性的肌腱損傷比較常見，由于肌腱自身再生能力較差，肌腱損傷后恢復(fù)后比較緩慢，而傳統(tǒng)治療再生的肌腱主要是瘢痕組織構(gòu)成，很難恢復(fù)結(jié)構(gòu)的完整性及滿足生理活動所需的強(qiáng)度2。因而尋求有效的治療方法，促進(jìn)肌腱干細(xì)胞向肌腱成纖維細(xì)胞分化是一種迫切的辦法。因此，尋求有效的治療方法尤為重要。促進(jìn)肌腱干細(xì)胞向肌腱成纖維細(xì)胞分化是一種迫切的辦法。結(jié)締組織生長因子（Connective tissue growth factor,CTGF）是1991年首先在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，由349個(gè)氨基酸組成。最初發(fā)現(xiàn)CTGF對成纖維細(xì)胞具有趨化及促進(jìn)有絲分裂的作用，后來的研究發(fā)現(xiàn)，CTGF可對不同的細(xì)胞具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和分化等作用［4］。由于它們在創(chuàng)傷修復(fù)中的特殊意義，尤其是人CTGF可以啟動一系列介導(dǎo)組織創(chuàng)傷修復(fù)和再生的生物學(xué)過程4，故具有潛在的應(yīng)用前景5。近年來，也有研究者發(fā)現(xiàn)CTGF對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成纖維細(xì)胞分化的作用，發(fā)現(xiàn)其有促進(jìn)干細(xì)胞向成纖維細(xì)胞分化的作用［5］。因此將從大鼠肌腱中分離肌腱干細(xì)胞，并研究CTGF對其向肌腱成纖維細(xì)胞分化的影響。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

研究對象是結(jié)締組織生長因子在體育運(yùn)動中對肌腱干細(xì)胞分化的影響。

1.2 研究方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)法

1）實(shí)驗(yàn)材料。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自GIBCO公司；Trizol試劑盒以及所有的反轉(zhuǎn)錄試劑均購自北京Invitrogen生物技術(shù)服務(wù)有限公司；PCR引物由北京賽百盛生物有限公司合成；鼠抗人CD44、CD29抗體購自Bethyl Laboratories公司；兔抗人GAPDH和羊抗大鼠多克隆tenascin C抗體（1：100），小鼠抗大鼠多克?、裥湍z原抗體（1∶100）抗體、辣根過氧化物酶偶聯(lián)的IgG抗體購自SantaCruz公司。

2）細(xì)胞分離及培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)取1只150g雄性大鼠，腹腔麻醉后，取大鼠雙側(cè)跟腱組織，提取周圍結(jié)締組織并將其剪碎至大小為1mm×1mm×1mm，然后將組織平鋪至培養(yǎng)皿，加入含100u/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)。3天后，細(xì)胞從組織塊周圍遷移出來，繼續(xù)培養(yǎng)5-7天，待細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)，胰酶消化、傳代。取P2-P3代進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

3）CD44、CD29細(xì)胞免疫熒光染色。取P2代細(xì)胞爬片，以2×104個(gè)/mL密度接種于24孔板，加300μL10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)60% -70%時(shí)，取兩孔細(xì)胞，行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測細(xì)胞表型抗原標(biāo)記CD44、CD29，方法如下：PBS洗3次，4%多聚甲醛固定30min，PBS洗3次，加入含0.5%Triton100和1%羊血清的PBS，冰上滲透10m in；再用含1%羊血清的PBS封閉，然后兩孔分別加鼠抗人CD44、CD29，一抗4℃過夜。去除一抗，PBS沖洗，加FITC標(biāo)記山羊抗小鼠二抗反應(yīng)液，室溫1 h，避光。去除二抗，PBS沖洗。甘油封片，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞膜。

4）肌腱干細(xì)胞多向分化能力鑒定。取P3代細(xì)胞接種于6孔板，每孔分別加入2m l的成脂和成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)至14天和21天，然后分別進(jìn)行油紅和茜素紅染色，觀察其成脂和成骨情況。同時(shí)收集一部分分離提取的肌腱干細(xì)胞，3 000rpm，離心10min，去上清，并用成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液重懸，制成細(xì)胞團(tuán)。誘導(dǎo)28天，進(jìn)行阿利斯藍(lán)染色觀察軟骨形成情況。備注：成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液含DMEM、10%FBS、1%PSN、0.1μmol/L地塞米松、0.2mmol/L維生素C及10mmol/Lβ甘油磷酸。成軟骨分化：含無血清DMEM、0.1μmol/L地塞米松、0.2mmol/L維生素C、1mmol/L丙酮酸鈉、1∶100胰島素-鐵傳遞蛋白-硒稀釋液、10ng/mLTGF-β1。成脂分化：含DMEM、10%FBS、1%PSN、1×10-6 mol/L地塞米松、0.5mmol/L甲基異丁基黃嘌呤及50μmol/L吲哚美辛。

5）總RNA的提取。收集未處理的肌腱干細(xì)胞和分化后的肌腱細(xì)胞，用PBS洗1遍后吸去，加1mLTrizol后，用槍吹打后吸入EP管中。室溫放置5min，使其充分裂解。按200μL氯仿/ mLTrizol加入氯仿，振蕩混勻后室溫放置15min。4℃12 000g離心15min。吸取上層水相至另一離心管中。按0.5mL異丙醇/ mLTrizol加入異丙醇混勻，室溫放置5-10min。4℃12 000g離心10min，棄上清，RNA沉于管底。按1mL 75%乙醇/mLTrizol加入75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。4℃8 000g離心5min，盡量棄上清。室溫晾干干燥5-10min。用50μLDEPC水溶解RNA樣品，55-60℃，5-10min。測O.D值定量RNA濃度。

6）實(shí)時(shí)定量PCR。取500ngRNA根據(jù)First Strand cDNA kit的方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將獲得的cDNA稀釋10倍。然后，用qPCR試劑盒SYBR premix Ex Taq進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。βactin上游引物：5′-ATCGTGGGCCGCCCTAGGCA-3′；下游引物：5′-TGGCCTTAGGGTTCAGAGGGG-3′。

Tenascin C 上 游 引 物 ：5′-CAGAAGCTGAACCGGAAGTTG-3′；下游引物：5′-GGCTGTTGTTGCTATGGCQCT-3′。Ⅰ型膠原 （Collagen type I）上游引物：5′-CTGGATCATATTGCACA-3'；下游引物：5′-CATCGGTGGTACTAAC-3′。上述引物均由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。取之前合成的cDNA作為模板，上游引物下游引物各取0.4μl，SYBRμ-Green Master Mix 10.2μl。將上述樣品加入到專用的PCR管中，PCR反應(yīng)條件為：95℃15min，94℃15s，55℃30s，70℃30s，40 ycles。利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀（CFX96，BiO Rad公司）進(jìn)行反應(yīng)，后對其熔解曲線進(jìn)行分析，并計(jì)算出基因表達(dá)的相對量。

7）Western印跡。收集未處理的肌腱干細(xì)胞和分化后的肌腱細(xì)胞，加入SDS加樣緩沖液，煮沸10m in，離心后取上清液進(jìn)行SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用5%脫脂奶粉于4℃封閉1h，加入用5%脫脂奶粉1∶1 000稀釋的I型膠原抗體和 1∶1 000稀釋的 Tenascin-C抗體或 1∶10 000稀釋的GAPDH抗體，室溫輕搖1h，TBST洗膜3次，每次7min，加入用5%脫脂奶粉稀釋的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG，室溫輕搖1h，TBST洗膜3次，每次7min，用化學(xué)發(fā)光法顯色5min，壓片顯影。

1.2.2 數(shù)理統(tǒng)計(jì)法

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組之間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 肌腱干細(xì)胞的分離和鑒定

分離得到的組織細(xì)胞呈梭狀，如圖1A所示。同時(shí)免疫熒光染色檢測顯示，細(xì)胞表面抗原CD29和CD44呈陽性反應(yīng)，如圖1B所示。表明提取的組織細(xì)胞為肌腱干細(xì)胞。

圖1 分離出的肌腱干細(xì)胞圖

2.2 肌腱干細(xì)胞可向脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞分化

圖2肌腱干細(xì)胞分化圖

肌腱干細(xì)胞在分化14天后，大量的細(xì)胞開始分泌油滴，油紅染色可見明顯脂質(zhì)空泡形成，如圖2A所示，表明分離的肌腱干細(xì)胞具有向脂肪細(xì)胞分化的能力；同時(shí)肌腱干細(xì)胞在分化21天后，茜素紅染色顯示可見明顯鈣結(jié)節(jié)形成，如圖2B所示，表明大量的細(xì)胞可以分化為成熟的成骨細(xì)胞；同時(shí)細(xì)胞球內(nèi)的細(xì)胞開始分泌大量的軟骨胞外基質(zhì)，阿爾新藍(lán)染色可見細(xì)胞外有明顯的軟骨樣基質(zhì)生成并呈藍(lán)染，如圖2C所示，表明大量的細(xì)胞可以分化為成熟的軟骨細(xì)胞。

2.3 結(jié)締組織生長因子可促進(jìn)肌腱干細(xì)胞向成纖維細(xì)胞分化

I型膠原和Tenascin-C是成纖維細(xì)胞的蛋白標(biāo)志物。我們將結(jié)締組織生長因子刺激肌腱干細(xì)胞14天，用熒光定量PCR儀檢測上述兩種標(biāo)志物的mRNA的含量。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，I型膠原的 mRNA水平含量升高了 5.3倍，Tenascin-C升高了2.1倍（P<0.01），如圖3A；同時(shí)，用Western Blot檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，I型膠原的表達(dá)升高了3.3倍，Tenascin-C的表達(dá)升高了1.8倍（P<0.05），如圖3。以上結(jié)果表明，結(jié)締組織生長因子可以有效的促進(jìn)肌腱干細(xì)胞向肌腱成纖維細(xì)胞分化。

圖3 分化后的肌腱干細(xì)胞

3 討論

隨著越來越多的人參與到體育鍛煉和競技活動中，運(yùn)動損傷也越來越多，其中韌帶肌腱損傷占50%以上。雖然目前臨床上有自體移植、同種異體移植和假體材料修復(fù)等技術(shù)，但這些手術(shù)仍存在著并發(fā)癥、疾病傳播、免疫排斥等缺陷。因此，采用人體自身干細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)無疑是更好的辦法。目前多種細(xì)胞因子已被證明可用于肌腱修復(fù)，如TGF-b1，IGF等，被證明可以有效提高損傷肌腱的修復(fù)。在機(jī)體中，CTGF可以刺激結(jié)締組織細(xì)胞，使其胞外基質(zhì)的再生作用加強(qiáng)創(chuàng)傷處纖維填充、毛細(xì)血管生長加快等［6］。肌腱中分離出來的干細(xì)胞不僅能像骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞一樣具有干細(xì)胞特性，并在特定誘導(dǎo)條件下分化為脂肪、骨、軟骨、心肌等多種組織細(xì)胞。

本研究分離獲取的肌腱干細(xì)胞鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)呈梭狀，經(jīng)過成骨、成軟骨及成脂誘導(dǎo)后可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，且在結(jié)締組織生長因子的刺激下可以向肌腱細(xì)胞分化。肌腱細(xì)胞分化的特異標(biāo)記物為tenomodulin、scleraxis、tenascin C，而Ⅰ型膠原是肌腱組織的主要成分。本研究發(fā)現(xiàn)分化后的肌腱細(xì)胞中tenascin C和Ⅰ型膠原mRNA水平和蛋白表達(dá)水平是均有升高，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此確定了提取的肌腱干細(xì)胞可以向肌腱細(xì)胞分化。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)針對肌腱干細(xì)胞，成功證明了結(jié)締組織生長因子對肌腱干細(xì)胞的刺激分化作用，此種生長因子可以直接應(yīng)用之損傷局部，包括注射及局部包裹生長因子的封閉劑或指甲等從而可以為細(xì)胞因子療法提供一個(gè)新的選擇。然而，直接注射存在生長因子半衰期較短等缺陷，因而未來可以采用生物材料緩釋載體來解決這一問題。同時(shí)還有研究表明，這種干細(xì)胞參與了多種肌腱修復(fù)的活動如血小板富集療法。因此，針對肌腱干細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)療法的研究將成為未來的一個(gè)方向。

［1］安小團(tuán).運(yùn)動訓(xùn)練對肌腱細(xì)胞外間質(zhì)及IGFIMRNA和蛋白表達(dá)的影響［D］.蘇州:蘇州大學(xué),2009.

［2］宋海新，陳 曉,李建華.激活肌腱干細(xì)胞：啟動肌腱再生的條件［J］.中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2012,27（5）:485-488.

［3］Bi Y，Ehirchiou D，Kilts TM，et al.Identification of tendon stem/ progenitor cellsand the role of the extracellularmatrix in theirniche ［J］.NatMed,2007,13（10）:1 219-1 227.

［4］Igarashi A,OkochiH,Bradham H,et al.Regulation of connective tissue growth factor gene expression in human skin fibroblasts and duringwound repair［J］.Mol BiolCell,1993,4:637-645.

［5］李琦涵,趙紅玲,王 炯.結(jié)締組織生長因子的基因克?。跩］.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào),2000,22（1）:48-51.

Effectsof Connective Tissue Growth Factor on Cells Differentiation of Tendon in Sports

DOU Haibo，WEN Xiuli

運(yùn)用實(shí)驗(yàn)法和數(shù)理統(tǒng)計(jì)法探究體育運(yùn)動中結(jié)締組織生長因子對肌腱干細(xì)胞分化產(chǎn)生的影響。將周圍結(jié)締組織從活體中進(jìn)行細(xì)胞分離及培養(yǎng)；取P2代細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測細(xì)胞表型抗原標(biāo)記CD44、CD29。取P3代細(xì)胞進(jìn)行肌腱干細(xì)胞多向分化能力鑒定，收集未處理的肌腱干細(xì)胞和分化后的肌腱細(xì)胞，分別用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western印跡檢測I型膠原和Tenascin-CmRNA和蛋白水平的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：細(xì)胞免疫熒光染色CD44、CD29陽性，表明我們分離提取的組織細(xì)胞為肌腱干細(xì)胞；肌腱干細(xì)胞可以向脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞分化；分化后的肌腱細(xì)胞，I型膠原的mRNA水平含量升高了5.3倍，Tenascin-C升高了2.1倍（P<0.01），I型膠原的蛋白表達(dá)升高了3.3倍，Tenascin-C的表達(dá)升高了1.8倍（P<0.05）。結(jié)論：結(jié)締組織生長因子可以促進(jìn)肌腱干細(xì)胞分化。

體育運(yùn)動；肌腱；干細(xì)胞；分化；結(jié)締組織；生長因子

To investigate the effect of Connective tissue growth factor（CTGF）on the differentiation of tendon stem/progenitor cells（TSPCs）in sports,this paper uses the experimentalmethod and mathematical statistics method.Cells were isolated from the surrounding connective tissue of the living；the protein expressions of CD44、CD29 were detected by immunocy to chemistry staining from the cells at passage 2.Cells at passage 3 were used to demonstrate themulti-differentiation potential of the TSPCs,themRNA expression of tenascin C and collagen type Iwere determined by real-time PCR,and the protein expressions of tenascin C and collagen type Iwere determined byWestern blot.Results indicates that immunocy to chemistry staining showed that the protein expressions of CD44、CD29 were detected in cells we isolated；chondrogenic,osteogenic,and adi pogenic differentiation assays were used to demonstrate themulti-differentiation potential of the TSPCs；the mRNA expressions of collagen type Iand Tenascin-Cwere 5.3 and 2.1 times higher than that in cellswith no differentiation（P<0.01）,the protein expressions of tenascin C and collagen type Iwere 3.3 and 1.8 times higher than that in cellswith no differentiation（P<0.05）.Conclusion:Connective tissue growth factor（CTGF）can be used to promote tenogenic differentiation of the TSPCs?in vitro.

sports；muscle tendon；stem cells；differentiation；connective tissue；growth factor

G804.5

A

1003-983X（2015）03-0217-04

2015-01-05

北京市青年英才計(jì)劃（YETP0407）；教育部中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)（FRFBR13038）

竇海波（1981-），男，河南鄧州人，博士，講師，研究方向：高校競技體育.

北京科技大學(xué)體育部，北京100083 Physical Education Department,University of Science and Technology Beijing,Beijing,100083