謝晨燁，張 鳳，程 卉，蘇婧婧，李慶林

（安徽中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心 省部共建教育部新安醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230038）

乳腺癌是全球發(fā)病率居首位的女性惡性腫瘤。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，乳腺癌同樣是我國(guó)女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)［1］。目前，對(duì)于乳腺癌的治療仍以化學(xué)治療為主，作為臨床一線(xiàn)治療乳腺癌的藥物，蒽環(huán)類(lèi)抗腫瘤抗生素阿霉素（adriamycin，ADM）及其衍生物的應(yīng)用越來(lái)越普遍。然而化學(xué)治療藥物易出現(xiàn)耐藥性，進(jìn)而導(dǎo)致用藥劑量加大，毒性和不良反應(yīng)增加等不利因素。目前臨床治療已逐漸采用聯(lián)合用藥方案，以期提高療效的同時(shí)不增加藥物毒性，同時(shí)減少耐藥性［2］。故本實(shí)驗(yàn)選用新藤黃酸（gambogennic acid，GNA）與 ADM作為目標(biāo)藥物進(jìn)行研究，探討其聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF－7凋亡的影響。

1 材料

1．1 細(xì)胞株 人乳腺癌細(xì)胞 MCF－7，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1．2 藥物 GNA為亮黃色結(jié)晶粉末，純度＞99．0%，批號(hào)2012120101，由安徽中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心GNA課題組提供；ADM：浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)120901。

1．3 主要試劑 達(dá)爾伯克培養(yǎng)基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）干粉：Gibco公司，批號(hào) 1218594；特級(jí)胎牛血清（fatal bovine serum，F(xiàn)BS）：天津市灝洋生物制品科技責(zé)任有限公司，批號(hào)20150530；Trypsin胰蛋白酶：Sigma公司，批號(hào)20120711125；甲 基 噻 唑 基 四 唑 （methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）：Sigam公司，批號(hào) M2128；二甲基亞 砜 （dimethyl sulfoxide，DMSO）：Amresco 公司，批號(hào) 20120210；4′，6－二脒基－2－苯基吲哚（4′，6－diamidino－2－phenylindole，DAPI）染色液：碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)c1002；膜聯(lián)蛋白Ⅴ（annexinⅤ，AV）－異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）／碘化丙啶（propidium iodide，PI））細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒：上海貝博生物公司，批號(hào)BB140041；其他試劑均為分析純。

1．4 主要儀器 MCO－175CO2培養(yǎng)箱：日本Sanyo公司；LD4－8型低速離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠；96孔和6孔平底培養(yǎng)板：美國(guó)Corning costar公司；SPECTRA max M2e酶標(biāo)儀：美國(guó) Molecular Devices公司；JW2502電子分析天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；Olympus CKX41倒置顯微鏡以及Olympus BX51熒光顯微鏡：日本 Olypus公司；FACS Calibur流式細(xì)胞儀：美國(guó)Becton Dickinson公司。

2 方法

2．1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人乳腺癌細(xì)胞MCF－7接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基為DMEM（含10%FBS、青霉素100 U／ml和鏈霉素100U／ml），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，相對(duì)飽和濕度的條件下培養(yǎng)。細(xì)胞呈單純貼壁生長(zhǎng)，隔2～3d換液，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%的密度，用不含乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）的胰酶消化傳代，每2～3d傳代一次。

2．2 MTT比色法測(cè)定細(xì)胞活力 消化收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF－7細(xì)胞并調(diào)整成濃度為4×104／mL的單細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔接種100μL，接種24h后處理。倒置顯微鏡下觀察確認(rèn)細(xì)胞貼壁狀態(tài)良好。加藥組每孔分別加入100μL培養(yǎng)液配制的藥物，使GNA終濃度分別為0．125、0．25、0．5、1、2、4μmol／L，ADM 終濃度則為0．5、1、2、4、8、16μmol／L。每一濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，并設(shè)空白對(duì)照組，加入100μL培養(yǎng)液。培養(yǎng)24h后，棄上清，每孔加5mg／mL的 MTT 20μL，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育4h，吸去上層液體，以150μL DMSO溶解藍(lán)紫色顆粒同時(shí)置于搖床上振搖至溶解完全，在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上室溫避光振蕩混勻并于490nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔的光密度（optical density，OD）值，計(jì)算單獨(dú)用藥時(shí)細(xì)胞的存活率。并以此為基礎(chǔ)，結(jié)合中效原理［3］檢測(cè)兩種藥物不同劑量聯(lián)合配伍后的MTT細(xì)胞活力。細(xì)胞存活率＝實(shí)驗(yàn)組OD值／對(duì)照組OD值×100%。

2．3 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài) 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF－7細(xì)胞消化收集并調(diào)整成濃度為2×105／mL的細(xì)胞懸液，接種于6孔板中，每孔2mL。細(xì)胞置于37℃恒溫、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至70%時(shí)換用含有1μmol／L GNA、4μmol／L ADM、1μmol／L GNA＋4μmol／L ADM 的新鮮培養(yǎng)液，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24h后于倒置顯微鏡下觀察并拍照。

2．4 DAPI細(xì)胞核染色 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF－7細(xì)胞接種到6孔板中，每孔分別加入2mL細(xì)胞培養(yǎng)基。種板后24h，吸棄各孔中的舊培養(yǎng)液，加藥組各孔中分別加入含 GNA 1μmol／L、ADM 4μmol／L、GNA 1μmol／L＋ADM 4μmol／L的培養(yǎng)基2mL，未給藥組各孔中加入完全培養(yǎng)基2 mL。置37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育24h后，棄各孔中原有培養(yǎng)液，以每孔1mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）輕洗細(xì)胞1次；再加入1mL 2%多聚甲醛固定15min，棄多聚甲醛，PBS 1mL漂洗細(xì)胞；再加入DAPI在室溫下避光作用10min，最后PBS輕洗細(xì)胞1次，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2．5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)AV／PI雙染 MCF－7細(xì)胞常規(guī)傳代于培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞密度約為70%～80%時(shí)，加藥組各瓶中分別加入含 GNA 1μmol／L、ADM 4μmol／L、GNA 1μmol／L＋ADM 4μmol／L的培養(yǎng)基4mL，未給藥組中加入完全培養(yǎng)基4mL。24h后常規(guī)收集各組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，用PBS輕洗2次后，胰酶消化并吹散細(xì)胞轉(zhuǎn)移置離心管中，2 000 r／min，離心5min，棄上清液。每管加1mL PBS輕洗2次，再次離心。400μL AV結(jié)合液重懸，分別加入5μL AV－FITC和10μL PI溶液，混勻細(xì)胞，避光孵育15min后，過(guò)篩至流式專(zhuān)用管內(nèi)，1h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，連續(xù)型變量用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）”進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述。多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，均數(shù)之間多重比較采用LSD法。P＜0．05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3．1 GNA與ADM單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)細(xì)胞活力的抑制作用 GNA和ADM單獨(dú)作用于MCF－7細(xì)胞24h后，結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，GNA和ADM均能明顯抑制細(xì)胞增殖（P＜0．01）。而GNA和ADM作用 MCF－7細(xì)胞24h后的半數(shù)抑制率（inhibition concentration 50，IC50）分別為 3．115、9．304μmol／L。根據(jù)中效原理計(jì)算驗(yàn)證后選擇1μmol／L GNA＋4μmol／L ADM 作為聯(lián)合用藥濃度。結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。

3．2 GNA與ADM單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響 倒置顯微鏡下觀察可見(jiàn)，空白對(duì)照組細(xì)胞貼壁牢固，細(xì)胞邊緣清晰，體積較大，幾乎無(wú)懸浮細(xì)胞。與空白對(duì)照組比較，1μmol／L GNA作用于 MCF－7細(xì)胞24h后，部分細(xì)胞邊緣發(fā)亮，細(xì)胞固縮變圓，體積變小，少數(shù)細(xì)胞貼壁不牢，呈半貼壁狀態(tài)。而4 μmol／L ADM 作用于 MCF－7細(xì)胞24h后，可觀察到多數(shù)細(xì)胞固縮變圓，漂浮于培養(yǎng)液中。1μmol／L GNA和4μmol／L ADM 聯(lián)合用藥組作用 MCF－7細(xì)胞24h后，與單獨(dú)用藥組比較，其大多數(shù)細(xì)胞均漂浮于培養(yǎng)液中，部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡或細(xì)胞破裂呈壞死狀。見(jiàn)圖3。

3．3 GNA與ADM單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡 細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，染色質(zhì)發(fā)生固縮［4］，DAPI可快速穿透細(xì)胞膜與細(xì)胞核內(nèi)DNA鏈結(jié)合，同時(shí)對(duì)活細(xì)胞和凋亡細(xì)胞進(jìn)行核染。本組實(shí)驗(yàn)中，熒光顯微鏡下可見(jiàn)空白對(duì)照組正常細(xì)胞核呈現(xiàn)均一暗淡的藍(lán)色，而GNA與ADM單獨(dú)用藥24h后，部分細(xì)胞核呈藍(lán)白色，碎塊狀致密濃染，少數(shù)細(xì)胞核可見(jiàn)細(xì)胞核內(nèi)碎裂，具有明顯凋亡特征。而聯(lián)合用藥組凋亡細(xì)胞數(shù)量較單獨(dú)給藥組明顯增加，亮度趨向亮藍(lán)白色。結(jié)果見(jiàn)圖4。

3．4 GNA與ADM單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響 GNA與ADM單獨(dú)和聯(lián)合用藥分別作用于MCF－7細(xì)胞24h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，與未給藥組比較，單獨(dú)用藥組細(xì)胞凋亡率均顯著上升（P＜0．01），而1μmol／L GNA＋4μmol／L ADM聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率較單獨(dú)用藥組顯著升高（P＜0．01）。結(jié)果表明，GNA與ADM 聯(lián)合用藥誘導(dǎo)MCF－7細(xì)胞凋亡的作用顯著優(yōu)于單獨(dú)用藥，兩藥聯(lián)用具有協(xié)同效應(yīng)。見(jiàn)表1、圖5。

表1 GNA與ADM單獨(dú)和聯(lián)合應(yīng)用對(duì)MCF－7細(xì)胞凋亡率的影響（±s，n＝3）

表1 GNA與ADM單獨(dú)和聯(lián)合應(yīng)用對(duì)MCF－7細(xì)胞凋亡率的影響（±s，n＝3）

注：含有相同右上標(biāo)符號(hào)的組別相比較，P＞0．05；不含相同右上標(biāo)符號(hào)的組別相比較，P＜0．05。

空白對(duì)照 2．37±0．32＊1μmol／L GNA 40．36±3．17＃4μmol／L ADM 42．06±3．03＃1μmol／L GNA＋4μmol／L ADM 聯(lián)合用藥 69．89±5．11△

4 討論

乳腺癌發(fā)病率高，且頗具侵襲性，是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一［5］。近年來(lái)，隨著手術(shù)、放射治療、化學(xué)治療、內(nèi)分泌治療和分子靶向治療及中醫(yī)中藥等各種治療方法的改進(jìn)，乳腺癌患者的存活率有了一定程度的提高，因此，多學(xué)科綜合治療備受關(guān)注。臨床已出現(xiàn)多種聯(lián)合用藥方案，其中以蒽環(huán)類(lèi)與其他藥物聯(lián)用為主［6］。

聯(lián)合用藥是指為了達(dá)到治療目的而采用的兩種或兩種以上藥物同時(shí)或先后應(yīng)用，以期提高療效而不增加毒性，并減少耐藥性的出現(xiàn)。聯(lián)合用藥時(shí)應(yīng)選擇作用機(jī)制不同的藥物聯(lián)用，從而發(fā)揮其協(xié)同作用［7］?；瘜W(xué)治療藥物單獨(dú)使用時(shí)毒性和不良反應(yīng)嚴(yán)重，劑量稍大則容易對(duì)機(jī)體正常細(xì)胞功能產(chǎn)生影響，長(zhǎng)期使用后惡性腫瘤容易對(duì)藥物產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致療效降低。這些均是妨礙各種惡性腫瘤治療的難題，也是使得乳腺癌化學(xué)治療失敗的重要原因。聯(lián)合用藥方案則可結(jié)合傳統(tǒng)中藥和臨床常用西藥不同的作用機(jī)制，從而達(dá)到全面抑制惡性腫瘤發(fā)展，增加療效并降低不良反應(yīng)的目的。

GNA是一種傳統(tǒng)中藥，具有作用強(qiáng)、毒性低、穩(wěn)定性好和抗癌譜廣等特點(diǎn)。研究［8］發(fā)現(xiàn)GNA體外能夠抑制多種類(lèi)型的癌癥細(xì)胞增殖，其抗腫瘤作用機(jī)制與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程有關(guān)［9－12］。ADM 是一種蒽環(huán)類(lèi)化學(xué)治療藥物，對(duì)機(jī)體可產(chǎn)生廣泛的生物化學(xué)效應(yīng)，具有強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性作用。其作用機(jī)制主要是嵌入DNA后抑制核酸的合成，可抑制RNA和DNA的合成。ADM抗瘤譜較廣，對(duì)多種腫瘤均有作用，屬細(xì)胞周期非特異性藥物，對(duì)各種生長(zhǎng)周期的腫瘤細(xì)胞都有殺滅作用［13］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GNA和ADM單用或聯(lián)合用藥都能誘導(dǎo)人乳腺癌 MCF－7細(xì)胞的凋亡。MTT結(jié)果顯示，兩藥單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用均可對(duì)乳腺癌MCF－7細(xì)胞造成生長(zhǎng)抑制，并呈一定的劑量依賴(lài)性。而從DAPI細(xì)胞核染色實(shí)驗(yàn)觀察得知，與單獨(dú)用藥組比較，GNA及ADM聯(lián)合應(yīng)用時(shí)能夠顯著誘導(dǎo)MCF－7細(xì)胞的凋亡，細(xì)胞核碎裂，具有明顯凋亡特征。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果則進(jìn)一步證明了GNA與ADM聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo) MCF－7細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象。從本實(shí)驗(yàn)可以看出：兩藥合用時(shí)，不僅對(duì)MCF－7細(xì)胞的凋亡效應(yīng)增加，而且各自的需用量均比單用要小。這也充分說(shuō)明這兩種藥物聯(lián)合用藥具有協(xié)同增效的作用，符合聯(lián)合用藥增效減毒的原則。

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