程巧菊 許苔希

·實驗研究·

OXA-23型酶介導的鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素耐藥分子傳播機制

程巧菊 許苔希

目的 探討OXA-23酶在介導鮑曼不動桿菌碳青霉烯類抗生素耐藥過程中的傳播機制。方法 對2010年9月至2012年3月58株產(chǎn)OXA-23型碳青霉烯酶鮑曼不動桿菌進行深入研究，所有菌株運用PCR mapping方法對blaOXA-23基因的周圍結(jié)構(gòu)進行擴增及測序分析；根據(jù)PFGE型別挑選不同克隆的菌株，進一步采用S1-PFGE以及ApaI-PFGE聯(lián)合Southern blot雜交法對blaOXA-23基因進行定位分析。結(jié)果 58株菌中有47株菌的blaOXA-23基因周圍結(jié)構(gòu)為Tn2009轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)、11株為Tn2008轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)；58株菌屬于8個不同的克隆型別（A、B、C、D、E、F1、F2、G和H克隆），其中E克隆的blaOXA-23基因存在2個拷貝，分別位于質(zhì)粒及染色體上，質(zhì)粒大小為78.2kb左右；其余克隆菌blaOXA-23基因定位于染色體上，所在片段大小為310.1kb左右，其中D克隆存在2個染色體拷貝。結(jié)論 轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)是導致blaOXA-23基因迅速在鮑曼不動桿菌中轉(zhuǎn)移的重要元件，導致鮑曼不動桿菌碳青霉烯類抗生素耐藥傳播和擴散。

OXA-23酶 碳青霉烯類 耐藥傳播 鮑曼不動桿菌

近年來，我國鮑曼不動桿菌臨床分離率逐年升高［1～3］。多重耐藥鮑曼不動桿菌（MDRAB）菌株和碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌（CRAB）已呈世界性流行，在我國現(xiàn)已成為院內(nèi)感染的重要病原菌［4］。Ambler D類碳青霉烯酶中的D組絲氨酸苯唑西林酶（OXA）是介導鮑曼不動桿菌成為CRAB的主要碳青霉烯酶，鮑曼不動桿菌中＞90%的碳青霉烯酶基因為blaOXA基因，根據(jù)氨基酸序列以及酶對碳青霉烯類抗生素的水解活性［5］。OXA酶中具備水解碳青霉烯類能力的D類酶稱為CHDLs，包括blaOXA-23、blaOXA-24、blaOXA-58等［5］。CRAB最主要的耐藥機制就是獲得了blaOXA-23基因［6］。然而，目前有關該基因的研究仍處于探索階段。本實驗擬對發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)OXA-23酶鮑曼不動桿菌進行深入研究，探討blaOXA-23基因的分子流行病學傳播規(guī)律。報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 本實驗菌株來源于2010年9月至2012年3月收集自浙江省臨海市中醫(yī)院和浙江省臺州醫(yī)院分離的60株 CRAB，經(jīng)聚合酶鏈式反應（PCR）擴增blaOXA-23基因，明確為blaOXA-23基因陽性的菌株納入本實驗，共計58株CRAB［7，8］。

1.2 主要儀器及試劑 PCR擴增儀為ABI Applied公司產(chǎn)品；CHEF Mapper XA型脈沖場凝膠電泳儀、電泳儀及凝膠成像儀均為美國Bio-rad公司產(chǎn)品；恒溫水平搖床為美國Thermo公司產(chǎn)品。PCR試劑盒購自TaKaRa公司。引物由上海生工生物工程有限公司合成；PCR產(chǎn)物測序由杭州鉑尚測序公司完成，測序儀為美國ABI公司產(chǎn)品ABI Prism 3730。

1.3 blaOXA-23周圍結(jié)構(gòu)的研究 運用PCR mapping技術，根據(jù)文獻報道blaOXA-23周圍結(jié)構(gòu)的序列特點設計用于擴增Tn2006、Tn2008及Tn2009的PCR mapping引物。PCR擴增條件：95℃，5min；95℃解鏈45s，60℃退火30s，72℃延伸1.5min，35個循環(huán)；72℃，10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定是否有目的條帶以及條帶的特異性。引物的相對位置見圖1，引物序列見表1。

圖1 blaOXA-23基因周圍轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)及引物相對位置

表1 blaOXA-23周圍結(jié)構(gòu)引物列表

1.4 菌株的同源性分析 根據(jù)前期PFGE實驗結(jié)果，對58株菌重新進行ApaI-PFGE分析，明確菌株的同源性以便挑選菌株進行blaOXA-23基因的定位分析［9］。Apa-PFGE分析酶切條件為運用ApaI核酸內(nèi)切酶37℃處理4～6h，在脈沖場凝膠電泳儀上進行電泳，PFGE條件：0.5×TBE、14℃、電壓6V/cm、電場夾角120°、電流轉(zhuǎn)換時間5～20s、電泳22h。電泳結(jié)束后采用GelRed染料對膠進行染色，并用凝膠成像儀拍攝結(jié)果。以腸炎沙門菌H9812菌株經(jīng)Xba I酶切片段作為分子量標準。

1.5 blaOXA-23基因定位分析 挑選PFGE型別不同的菌株進行blaOXA-23基因定位實驗。制備包埋有細菌基因組的小膠，以S1核酸內(nèi)切酶對細菌基因組進行酶切，37℃處理40min；在脈沖場凝膠電泳儀上進行電泳，PFGE條件：0.5×TBE、14℃、電壓6V/cm、電場夾角120°、電流轉(zhuǎn)換時間2.13～63.6s、電泳18h。以blaOXA-23基因為探針進行Southern blot雜交試驗，將PFGE膠經(jīng)DNA脫嘌呤及變性處理，利用虹吸原理將膠上DNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，以地高辛標記的單鏈blaOXA-23基因DNA作為探針與膜上DNA進行雜交，明確該基因是否定位于質(zhì)粒上［10］。對于S1-PFGE定位實驗失敗的細菌進一步進行ApaI-PFGE電泳后，blaOXA-23基因Southern blot雜交試驗，確定blaOXA-23基因是否定位于染色體上。

2 結(jié)果

2.1 blaOXA-23基因周圍結(jié)構(gòu)結(jié)果 PCR mapping及測序比對結(jié)果顯示58株blaOXA-23陽性菌株中有11株blaOXA-23周圍的轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)為Tn2008，47株為Tn2009轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)。見表2。

表2 blaOXA-23定位分析結(jié)果

2.2 菌株同源性分析結(jié)果 PFGE結(jié)果顯示入選菌株的PFGE型別來源于8個克隆，分別為A、B、C、D、E、F1、F2、G和H克隆，見圖2。

2.3 blaOXA-23基因定位分析結(jié)果 對不同克隆型的細菌進行blaOXA-23基因的Southern blotting雜交定位試驗，結(jié)果顯示：9種型別的菌株僅有1株存在一個拷貝blaOXA-23基因定位于質(zhì)粒上，質(zhì)粒大小為78.2kb左右（圖3），該菌同時在染色體上亦存在一個拷貝；9株菌株blaOXA-23基因均存在定位于染色體上的拷貝，其中3號菌存在兩個大小不同的染色體拷貝（圖4）。

圖2 菌株同源性分析結(jié)果

圖3 菌株blaOXA-23基因質(zhì)粒雜交定位結(jié)果

圖4 菌株blaOXA-23基因染色體雜交定位結(jié)果

3 討論

近年來，CRAB呈全球流行，臨床有效抗菌藥物的效果較局限，已經(jīng)成為住院患者的嚴重威脅［11］。鮑曼不動桿菌發(fā)展成為CRAB的主要機制是細菌通過水平轉(zhuǎn)移獲得具有編碼碳青霉烯類抗生素水解活性酶的基因，其中OXA-23碳青霉烯酶為鮑曼不動桿菌中的最主要的D類碳青霉烯酶。本文通過對收集的58株blaOXA-23基因的周圍結(jié)構(gòu)以及基因的定位進行研究，發(fā)現(xiàn)Tn2009轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)以及質(zhì)粒廣泛存在于CRAB菌株中，揭示了CRAB流行及播散的規(guī)律。

碳青霉烯類抗生素是目前公認的對革蘭陰性菌具有良好抗菌活性的藥物，CRAB的出現(xiàn)及流行無疑給臨床治療帶來了嚴重困難，亦成為院感防控的難點。OXA-23-likeβ-內(nèi)酰胺酶（OXA-23 β-lactamase）是一類具有碳青霉烯類抗生素水解活性的β-內(nèi)酰胺酶，包括OXA-23，OXA-27等19種不同的亞型；該酶于1985年首次在英國被報道，由鮑曼不動桿菌產(chǎn)生；產(chǎn)酶菌株對亞胺培南的MICs值高達16μg/ml，直接與耐藥相關。研究顯示blaOXA-23基因廣泛為不動桿菌屬的多種細菌攜帶，亦存在于不同遺傳背景的鮑曼不動桿菌中，是CRAB產(chǎn)生最重要原因之一。blaOXA-23基因定位于質(zhì)粒上，且能隨質(zhì)粒在不同菌種間傳遞，這種攜帶blaOXA-23基因的可轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒是導致CRAB在醫(yī)院范圍內(nèi)的廣泛流行重要危險因素［12］。研究顯示blaOXA-23基因的周圍結(jié)構(gòu)具有相似性，2011年我國學者在49株鮑曼不動桿菌中檢測到blaOXA-23基因周圍穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)—Tn2008，該結(jié)構(gòu)由ISAba1-blaOXA-23-ΔATPase三個基因組成，并通過對ISAba1周圍序列進行分析提出ISAba1具有介導blaOXA-23基因轉(zhuǎn)移的能力的觀點［13］。研究顯示pAZJ221質(zhì)粒以及Tn2009轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)是導致我國blaOXA-23基因廣泛存在于不動桿菌屬細菌，導致CRAB產(chǎn)生的主要原因，從而進一步從基因水平揭示CRAB流行的機制［10］。但本資料結(jié)果顯示質(zhì)粒并非承載blaOXA-23基因的主要移動元件，作者僅發(fā)現(xiàn)一個克隆型的細菌攜帶有blaOXA-23質(zhì)粒（大小為78.3kb）；亦發(fā)現(xiàn)Tn2009轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)及Tn2008轉(zhuǎn)座結(jié)果同時是blaOXA-23基因的重要攜帶者，較有可能參與該基因在鮑曼不動桿菌中的轉(zhuǎn)移，是CRAB產(chǎn)生的重要威脅。ST92型鮑曼不動桿菌是全球流行的CRAB型別，而克隆播散是導致該ST型別流行的主要原因之一，本結(jié)果進一步證實除克隆播散以外，基于轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)的blaOXA-23基因的轉(zhuǎn)移元件亦參與CRAB的產(chǎn)生及播散，揭示了CRAB醫(yī)院感染（尤其是對于ICU患者）流行及擴散的規(guī)律。

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Objective To illustrate the molecular transmission mechanism of carbapenem-resistance mediated by OXA-23 type carbapenemase in A. baumannⅡ. Methods Fifty-eight strains collected from September 2010 to March 2012 were involved in our study. PCR mapping method followed by sequencing was used to analysis the surrounding structure of the blaOXA-23gene. Those isolates originating from different clones according to PFGE analysis were picked out to detect the gene location of the blaOXA-23with S1-PFGE and ApaI-PFGE followed by Southern blotting method. Results 47 in 58 strains harbored the blaOXA-23gene in Tn2009 transposon structure，while 11 in Tn2008. Only one type of PFGE clone strain （Clone E） harbors the blaOXA-23gene both in plasmid （ranging around 78.2kb） and in chromosome. The blaOXA-23gene was located in chromosome in the rest types of clones，in which two copies of clones were found in Clone D. Conclusion Both transposon was the main factors mediated the blaOXA-23gene transmission among A. baumannⅡ，which was also the molecular basis leading to the epidemic of carbapenem-resistant A. baumannⅡ.

OXA-23 type carbapenemase Carbapenems Resistant transmission A. baumannⅡ

317000 浙江省臨海市中醫(yī)院檢驗科（程巧菊）

317000 浙江省臺州醫(yī)院檢驗科（許苔希）