劉玲琳 徐海濱 胡祖健 何俊玲 楊慧芬 劉勝?

卡培他濱聯(lián)合不同歸經(jīng)引經(jīng)藥抗乳腺癌肺轉(zhuǎn)移療效研究

劉玲琳 徐海濱 胡祖健 何俊玲 楊慧芬 劉勝?

目的 探討卡培他濱聯(lián)合不同歸經(jīng)引經(jīng)藥（桔梗、川牛膝）對(duì)小鼠4T1乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型中原位瘤、肺轉(zhuǎn)移灶的療效差異。方法 建立Balb/c小鼠4T1乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型，隨機(jī)分為桔梗組、川牛膝組、卡培他濱+桔梗組、卡培他濱+川牛膝組、卡培他濱組（西醫(yī)陽(yáng)性藥對(duì)照）和空白對(duì)照組。繪制各組給藥期間原位瘤體積生長(zhǎng)曲線，給藥結(jié)束后比較各組瘤重、瘤重抑制率及肺轉(zhuǎn)移情況。結(jié)果 各藥物組在給藥中后期對(duì)4T1小鼠原位瘤均有一定的抑制作用。給藥結(jié)束后，與對(duì)照組比較，卡培他濱、卡培他濱+桔梗、卡培他濱+川牛膝組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中與單藥卡培他濱組比較，卡培他濱+桔梗組抑瘤作用更強(qiáng)（P＜0.05）。在瘤重和瘤重抑制率方面，與對(duì)照組比較，僅卡培他濱+桔梗組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。在肺轉(zhuǎn)移方面，卡培他濱+川牛膝組顯示出一定的促進(jìn)作用，余組均顯示出不同程度的抑制作用。與對(duì)照組比較，卡培他濱組與卡培他濱+桔梗組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），且后者抗肺轉(zhuǎn)移作用更佳。結(jié)論 與單藥卡培他濱比較，卡培他濱聯(lián)合桔?？蛇M(jìn)一步抑制4T1荷瘤小鼠原位瘤及肺轉(zhuǎn)移灶的發(fā)生發(fā)展，而卡培他濱聯(lián)合川牛膝在原位瘤抑制方面弱于單藥卡培他濱，在肺轉(zhuǎn)移方面則觀察到有促進(jìn)作用，提示卡培他濱配伍不同歸經(jīng)引經(jīng)藥（桔梗、川牛膝）在乳腺癌特異性肺轉(zhuǎn)移中存在療效的差異性和靶器官的選擇性。

乳腺癌 肺轉(zhuǎn)移 引經(jīng)藥 桔梗

肺轉(zhuǎn)移是乳腺癌最常見(jiàn)的內(nèi)臟轉(zhuǎn)移之一，乳腺癌肺轉(zhuǎn)移是乳腺癌治療中的重點(diǎn)和難點(diǎn)［1］。本研究通過(guò)觀察卡培他濱聯(lián)合不同歸經(jīng)引經(jīng)藥（桔梗、川牛膝）在4T1乳腺癌特異性肺轉(zhuǎn)移模型中的療效差異，以期為中醫(yī)藥抗乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的臨床實(shí)踐提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物 Balb/c小鼠60只，雌性，18g左右，由中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物訂購(gòu)至上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心后，無(wú)特定病原體（SPF）環(huán)境飼養(yǎng)，常規(guī)飲水，飼料供應(yīng)，飼養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠4T1乳腺癌細(xì)胞株購(gòu)自ATCC，由上海中醫(yī)藥大學(xué)科技實(shí)驗(yàn)中心保存，培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 Unit/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)用藥及試劑儀器 （1）藥物：桔梗、川牛膝（購(gòu)自上海養(yǎng)和堂中藥飲片有限公司），卡培他濱片（希羅達(dá)）（上海羅氏制藥有限公司）。（2）試劑及儀器：RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Gibco）；Bouin固定液：苦味酸飽和液（1.22%）75ml、福爾馬林25ml、冰醋酸5ml；HF1200 A2型生物安全柜（力新儀器上海有限公司）；XDS-B型倒置顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）；3110 Thermo型 CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)熱電）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millpore）；HISTOSTAT-820切片機(jī)（美國(guó)RMC）；EVOS大屏幕數(shù)碼倒置顯微鏡 （美國(guó)AMG）；NIKON 4500數(shù)碼相機(jī)（日本NIKON）。

1.4 乳腺癌肺轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型建立 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期體外培養(yǎng)的小鼠4T1細(xì)胞株（肺高轉(zhuǎn)移潛能），采用無(wú)血清的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整單細(xì)胞懸液濃度為1×107/ ml。無(wú)菌條件下，接種于Balb/c小鼠右側(cè)第二乳頭的脂肪墊上，接種量為0.1 ml/只（細(xì)胞數(shù)為1×106/只）。1.5 分組與給藥 共分6組，分別為桔梗組、川牛膝組、桔梗+卡培他濱組、川牛膝+卡培他濱組、卡培他濱組（西醫(yī)陽(yáng)性藥對(duì)照）和空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物原位瘤長(zhǎng)徑至2mm后，隨機(jī)分組，每組10只，給藥劑量按人鼠等效劑量換算，給藥周期4周。

1.6 觀察指標(biāo) （1）給藥期間瘤體積生長(zhǎng)曲線：給藥期間，每4d予游標(biāo)卡尺測(cè)其原位瘤長(zhǎng)、短徑，計(jì)算瘤體積，公式如下：V=1/2ab2（a為長(zhǎng)徑，b為短徑）。（2）瘤重、瘤重抑制率：給藥結(jié)束后，稱量裸鼠體重后脫頸處死裸鼠，摘除腫瘤、剔除筋膜，記錄瘤重、計(jì)算瘤重抑制率，公式如下：瘤重抑制率（%）=［（對(duì)照組平均瘤重-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重）/對(duì)照組平均瘤重］×100%。（3）腫瘤肺轉(zhuǎn)移評(píng)價(jià)：①肺臟病理切片制作與評(píng)價(jià)：每組隨機(jī)選6個(gè)肺組織（右肺）經(jīng)生理鹽水沖洗后，置于10%福爾馬林液中固定。經(jīng)不同濃度酒精逐級(jí)脫水、石蠟包埋、連續(xù)切片，制成4μm切片，蘇木精、伊紅染色，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。顯微鏡下攝影，并評(píng)價(jià)腫瘤轉(zhuǎn)移情況及其它可見(jiàn)的病理改變。②肺結(jié)節(jié)定量：每組隨機(jī)選8個(gè)肺組織（右肺）經(jīng)生理鹽水沖洗后，置于Bouin固定液中。固定1周后，樣本正常肺組織呈黃色，肺部結(jié)節(jié)（腫瘤轉(zhuǎn)移灶）不被染色呈白色，根據(jù)結(jié)節(jié)的大?。ㄖ睆剑┡c數(shù)量進(jìn)行評(píng)分：1分為＜1mm，2分為1mm，3分為2mm，4分為≥3mm。統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品的評(píng)分總數(shù)，評(píng)價(jià)腫瘤轉(zhuǎn)移情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 給藥期間各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物原位瘤體積變化 各藥物組在給藥中后期對(duì)4T1荷瘤小鼠原位瘤均有一定的抑制作用。給藥結(jié)束后，與對(duì)照組比較，卡培他濱組、卡培他濱+桔梗祖、卡培他濱+川牛膝組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。與單藥卡培他濱組比較，卡培他濱+桔梗組顯示出更好的抑瘤作用（P＜0.05），提示“引經(jīng)上行”中藥桔梗與卡培他濱協(xié)同使用，可提高卡培他濱的抗癌活性。見(jiàn)圖1。

2.2 原位瘤實(shí)體形態(tài) 見(jiàn)圖2。

圖1 給藥期間各組4T1乳腺癌原位瘤體積變化

圖2 各組原位瘤實(shí)體形態(tài)

2.3 瘤重 給藥結(jié)束后，與對(duì)照組比較，只有卡培他濱+桔梗組在瘤重方面差異明顯（P＜0.05），提示桔梗配伍卡培他濱比單藥卡培他濱抑瘤作用好，見(jiàn)圖3。

圖3 各組瘤重

2.4 瘤重抑制率 在瘤重抑制率方面，各藥物組對(duì)原位瘤均有一定程度的抑制作用，但僅卡培他濱+桔梗組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖4。2.5 肺臟病理 見(jiàn)圖5。

圖4 各組瘤重抑制率

圖5 4T1乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型各組肺轉(zhuǎn)移灶病理

2.6 肺結(jié)節(jié)定量 在4T1荷瘤小鼠肺轉(zhuǎn)移方面，卡培他濱+川牛膝組顯示出一定的促進(jìn)作用。余藥物組均顯示出一定的抑制作用，其抑制肺轉(zhuǎn)移作用由低到高依次為：牛膝組、桔梗組、卡培他濱組、卡培他濱+桔梗組。其中與對(duì)照組比較，卡培他濱組與卡培他濱+桔梗組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），且卡培他濱+桔梗組抑制肺轉(zhuǎn)移作用優(yōu)于單藥卡培他濱組，見(jiàn)圖6。

圖6 各組肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)

3 討論

乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤，已居我國(guó)城市女性惡性腫瘤發(fā)病率首位［2，3］。肺轉(zhuǎn)移是乳腺癌最常見(jiàn)的內(nèi)臟轉(zhuǎn)移之一，目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)針對(duì)乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的治療采用以化療為主的綜合治療，如何進(jìn)一步提高乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的臨床療效是醫(yī)學(xué)界持續(xù)探討的熱點(diǎn)問(wèn)題。

本研究選擇中醫(yī)學(xué)藥物桔梗為引藥上行的肺經(jīng)經(jīng)典引經(jīng)藥，《本草求真》中論述“桔梗系開(kāi)肺氣之品，可為諸藥舟楫，載藥上浮”，具有引藥入肺，提高療效的作用?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，桔梗具有抗炎鎮(zhèn)痛、祛痰鎮(zhèn)咳、降脂降糖、抑制胰酶活性、改善胰島素抵抗、促進(jìn)膽酸分泌、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等廣泛的生物學(xué)活性［4～6］。桔梗水提物或甲醇提取液具有較強(qiáng)的抗癌活性［7］。而桔梗皂苷是良好的表面活性劑，能增加其他藥物的吸收［8］。川牛膝則具有引藥下行的作用，《寒溫條辨》中有云“牛膝，生用其性下走如奔，破血癥，通經(jīng)閉，引諸藥下行”，現(xiàn)代藥理研究顯示，牛膝多糖能顯著提高S180荷瘤小鼠脾細(xì)胞誘生殺傷細(xì)胞（LAK）活性和腫瘤壞死因子β（TNF-β），具有廣泛殺傷腫瘤細(xì)胞和異質(zhì)細(xì)胞的能力，且與化療藥物環(huán)磷酰胺有協(xié)同抗腫瘤作用［9］。研究發(fā)現(xiàn)，川牛膝多糖能增強(qiáng)正常小鼠特異性和非特異性免疫功能，并對(duì)環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的白細(xì)胞數(shù)量減少具有一定的減毒作用［10］。本資料選用川牛膝作為桔梗的中醫(yī)藥對(duì)照，比較卡培他濱聯(lián)合桔?；虼ㄅＯピ诳谷橄侔┨禺愋苑无D(zhuǎn)移治療中是否存在療效的差異性和靶器官的選擇性。

本資料結(jié)果顯示，各藥物組在給藥中后期對(duì)4T1荷瘤小鼠原位瘤均有一定的抑制作用。給藥結(jié)束后，與對(duì)照組比較，卡培他濱組、卡培他濱+桔梗祖、卡培他濱+川牛膝組均顯示出一定的抑瘤抗癌活性。而與單藥卡培他濱比較，卡培他濱聯(lián)合引藥上行中藥“桔?！焙罂蛇M(jìn)一步提高4T1荷瘤小鼠原位瘤及肺轉(zhuǎn)移灶的抑制作用。而卡培他濱聯(lián)合引藥下行中藥“川牛膝”在原位瘤抑制作用方面弱于單藥卡培他濱，在肺轉(zhuǎn)移方面觀察不僅無(wú)抑制作用，而且具有促進(jìn)肺轉(zhuǎn)移的作用。而單味藥桔梗和川牛膝比較，川牛膝在4T1荷瘤小鼠原位瘤的抑制作用優(yōu)于桔梗，而桔梗在肺轉(zhuǎn)移抑制方面則優(yōu)于川牛膝，提示卡培他濱配伍不同歸經(jīng)引經(jīng)藥（桔梗、川牛膝）在乳腺癌特異性肺轉(zhuǎn)移中確實(shí)存在療效的差異性和靶器官的選擇性。本研究從實(shí)驗(yàn)角度佐證中醫(yī)引經(jīng)藥及歸經(jīng)理論在中醫(yī)藥抗乳腺癌及轉(zhuǎn)移性乳腺癌治療中的科學(xué)性和合理性。

在抗乳腺癌轉(zhuǎn)移有效的西藥卡培他濱基礎(chǔ)上聯(lián)合肺經(jīng)引經(jīng)藥桔梗可進(jìn)一步提高抑制4T1荷瘤小鼠原位瘤及肺轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展的作用，為抗乳腺癌肺轉(zhuǎn)移有效復(fù)合制劑的研發(fā)提供思路和方法，從而為中醫(yī)藥防治乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的臨床治療提供新的選擇。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步深入研究卡培他濱聯(lián)合桔梗發(fā)揮良好抗乳腺癌肺轉(zhuǎn)移作用的可能機(jī)制是值得繼續(xù)研究的方向。

1 Andre F, Slimane K, Bachelot T, et al． Breast cancer with synchronous metastases: trends in survival during a 14-year period． J Clin Oncol, 2004, 22(16): 3302～3308．

2 鄭瑩,吳春曉,張敏璐．乳腺癌在中國(guó)的流行狀況荷疾病特點(diǎn)．中國(guó)癌癥雜志,2013,23(8):561～569．

3 趙平, 陳萬(wàn)青, 孔靈芝． 中國(guó)癌癥發(fā)病與死亡2003-2007．北京: 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社,2012．121．

4 付文衛(wèi),竇德強(qiáng),裴月湖．桔梗的化學(xué)成分和生物活性研究進(jìn)展．沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2006,23(3):184～189．

5 武博,劉萍．桔梗的現(xiàn)代研究進(jìn)展．中國(guó)藥物應(yīng)用與檢測(cè),2008,5(2): 48～50．

6 郭文杰,許旭東,魏建和,等．桔梗中三萜皂苷類化學(xué)成分研究進(jìn)展．中國(guó)藥學(xué)雜志,2008,43(11):801～804．

7 Choi C K,Kim J Y,Kim Y S,et al．Augmentatation of macrophage functions by an aqueous extact isolated from Platycodon grandiflorun．Cancer Lett, 2001,166(1):17～25．

8 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所編．中草藥現(xiàn)代研究(第二卷)．北京:北京醫(yī)科大學(xué)中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社,1996．202．

9 余上才,章育正．牛膝多糖抗腫瘤作用及免疫機(jī)制實(shí)驗(yàn)研究．中華腫瘤雜志,1995,17(4):275～278．

10 王劍,付田,浦薔,等．川牛膝多糖的體內(nèi)免疫活性研究．中藥藥理與臨床．2007,23(6):31～33．

Objective To observe the different efficacy of capecitabine plus different meridian-guiding herbs（platycodon grandiflorum、radix cyathulae）for the treatment of lung metastasis from breast cancer in vivo. Methods Establishment of 4T1 breast cancer lung metastasis Balb/ c mice model.60 mice were randomly assigned to 6 groups：platycodon grandiflorum、radix cyathulae、capecitabine plus platycodon grandiflorum、capecitabine plus radix cyathulae、capecitabine and control group. Description of tumor growth curve during the administration，calculation of tumor weight、inhibition rate of tumor weight and quantitative analysis of inhibition in lung metastasis. Results Capecitabine、 capecitabine plus platycodon grandiflorum and capecitabine plus radix cyathulae groups indicated some degree of inhibition effect in tumor growth（P＜0.05），capecitabine plus platycodon grandiflorum played a better inhibition in primary tumor compared with capecitabine（P＜0.05）.Only capecitabine plus platycodon grandiflorum demonstrated efficacy at tumor weight and inhibition rates of tumor weight compared with control group（P＜0.05）.Capecitabine plus radix cyathulae group promoted lung metastasis，while other groups inhibited lung metastasis compared with control group（P＜0.05，P＜0.01）. Conclusion Capecitabine plus platycodon grandiflorum played a better inhibition both in primary tumor and lung metastasis，while capecitabine plus radix cyathulae showed weaker suppression in primary tumor and promoted lung metastasis compared with control group. The study indicated that capecitabine plus different meridian-guiding herbs showed different inhibition efficacy in lung metastasis of breast cancer.

Breast cancer Lung Metastasis Meridian-guiding herb Platycodon grandiflorum

浙江省中醫(yī)藥科學(xué)研究基金計(jì)劃（2011ZB113）；杭州市科技局項(xiàng)目（20110733Q28）；杭州市衛(wèi)生局項(xiàng)目（2011Z015）

310007杭州市中醫(yī)院乳腺外科（劉玲琳 徐海濱 胡祖健 何俊玲 楊慧芬）

200032上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院乳腺外科（劉勝）

*通訊作者