劉 宇，雷澤華△，杜 波，王志旭，高峰畏，王 清，張建新

(1.四川省樂山市人民醫(yī)院普外科 614000；2.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇鎮(zhèn)江 212001)

論著·基礎(chǔ)研究

TLR9對胰腺癌裸鼠增殖生長及化療耐藥性的研究

劉 宇1，雷澤華1△，杜 波1，王志旭1，高峰畏1，王 清1，張建新2

(1.四川省樂山市人民醫(yī)院普外科 614000；2.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇鎮(zhèn)江 212001)

目的 觀察TLR9在不同的活化狀態(tài)下對人胰腺癌裸鼠移植瘤生長及藥物抗性的影響。方法 建立人胰腺癌PANC-1細(xì)胞裸鼠移植腫瘤模型，并隨機(jī)分為6組：無菌生理鹽水組、TLR9激動劑、TLR9抑制劑組、吉西它濱組、TLR9抑制劑+吉西它濱組、TLR9激動劑+吉西它濱組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。游標(biāo)卡尺記錄腫瘤體積大小及生長情況，采用免疫組化方法檢測腫瘤TLR9受體表達(dá)情況，核磁共振成像(MRI)觀察腫瘤生長、轉(zhuǎn)移及周圍組織侵犯情況。結(jié)果 吉西他濱組、TLR9激動劑+吉西它濱組、TLR9抑制劑+吉西它濱組腫瘤摘除后體積及生長速度明顯小于其他組(P<0.05)，TLR9激動劑+吉西它濱組生長速度及腫瘤摘除后體積明顯大于TLR9抑制劑+吉西它濱組及吉西他濱組(P<0.05)，TLR9抑制劑+吉西它濱組與吉西他濱組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TLR9激動劑組、TLR9抑制劑組及生理鹽水組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。種植后7周小鼠在MRI下觀察，瘤成橢圓形，境界清楚，周圍組織未見明顯轉(zhuǎn)移及對周圍組織的侵犯；檢測腫瘤組織中并鑒定表面明確有TLR9的表達(dá)。結(jié)論 胰腺癌裸鼠移植瘤中確有TLR9的陽性表達(dá)，TLR9的激活可以明顯降低胰腺癌對吉西他濱化療的敏感性，增加腫瘤的耐藥性，相反促進(jìn)腫瘤生長。

胰腺腫瘤；裸鼠；吉西他濱；TLR9

胰腺癌是一種臨床常見消化道惡性腫瘤，據(jù)最新流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)，美國每年有45 220例新發(fā)現(xiàn)的胰腺癌病例，同時(shí)有38 460例胰腺癌的患者死亡，而世界范圍內(nèi)的胰腺癌年發(fā)病的病例達(dá)277 668例，年死亡病例達(dá)266 029例[1]。胰腺癌雖然不是高發(fā)病例，但由于其發(fā)病隱匿，惡性程度高，手術(shù)切除率低等原因，發(fā)病率與病死率相近[2]。目前國內(nèi)外惟一公認(rèn)對胰腺癌有化療作用的吉西他濱，也隨著胰腺癌化療耐藥性的增加，治療效果逐漸降低，所以探尋降低胰腺癌對吉西他濱的耐藥性成為研究提高治療胰腺癌效果的方向。近年來有研究表明，胰腺癌中存在TLR9表達(dá)，且TLR9的表達(dá)及活化水平與腫瘤細(xì)胞生長情況呈正相關(guān)[3]。但尚未見在不同的活化狀態(tài)下TLR9對人胰腺癌裸鼠移植瘤生長及藥物耐藥性的影響的相關(guān)試驗(yàn)研究，尤其是動物體內(nèi)試驗(yàn)。

本研究通過吉西他濱、TLR9激動劑OND1826及抑制劑0ND2088干預(yù)，觀察TLR9在不同的活化狀態(tài)下人胰腺癌裸鼠移植瘤生長、轉(zhuǎn)移以及對周圍組織的侵犯情況，并研究其對胰腺癌的吉西他濱耐藥性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 胰腺癌PANC-1細(xì)胞由上海中山醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心惠贈，BALB /c裸鼠3～5周齡，體質(zhì)量18～21 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司[動物許可證編號:SCXK(滬)2007-0005]，飼養(yǎng)于江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心屏障環(huán)境(SPF級)，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購、青鏈雙抗購自Gibco公司，ODN1826(Invivogen公司)、ODN2088(Invivogen公司)，吉西他濱購于禮來公司，TLR-9(SANTA CRUZ公司)，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(SANTA CRUZ公司)，核磁共振儀由江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院放射科提供。

1.2 人胰腺癌荷瘤鼠模型的建立 培養(yǎng)PANC-1細(xì)胞至對數(shù)生長期后，收集細(xì)胞并用PBS液調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至1×108個(gè)/mL。隨機(jī)選取5只裸鼠，碘伏消毒裸鼠右側(cè)前腋下皮膚，每只裸鼠皮下注射0.2 mL細(xì)胞懸液( 2×107個(gè)細(xì)胞) 。接種5 d左右后可見接種部位皮下長出豌豆大小硬結(jié)，10 d時(shí)皮下移植瘤長成約0.7 cm×0.8 cm×0.8 cm，約3周后頸椎脫臼法處死裸鼠。處死裸鼠后，摘除腫瘤后用PBS沖洗，修剪腫瘤塊大小約1 mm3左右，隨機(jī)選擇40只裸鼠，用顯微外科鑷子夾取腫瘤塊于接種針頭內(nèi)(20#腹穿針)，接種于裸鼠右側(cè)前腋皮下，以皮下腫瘤結(jié)節(jié)長至出現(xiàn)0.5 mm×0.5 mm硬結(jié)，變成肉色為標(biāo)準(zhǔn)，10 d左右成瘤[4]，成瘤率97.5%。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及給藥干預(yù) 當(dāng)右側(cè)前腋下皮下腫瘤結(jié)節(jié)長至出現(xiàn)0.5 mm×0.5 mm硬結(jié)，成肉色時(shí)。隨機(jī)于39只成瘤老鼠中選取36只分成6組：無菌生理鹽水組(腹腔注射生理鹽水)、TLR9激動劑組(腹腔注射)、TLR9抑制劑組(腹腔注射)、吉西它濱組(生理鹽水稀釋后以25 mg/kg,3天/次,共4次)、TLR9激動劑+吉西它濱組(給予吉西他濱25 mg/kg,3天/次,共4次，吉西它濱最后1次給藥后4 d開始腹腔注射TLR9激動劑,7天/次,共6次)、TLR9抑制劑+吉西它濱組(給予吉西他濱25 mg/kg，3天/次，共4次,吉西它濱最后一次給藥后4 d開始腹腔注射TLR9抑制劑，7天/次，共6次)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 腫瘤生長情況觀察 36只裸鼠完成實(shí)驗(yàn),未出現(xiàn)意外死亡，分組后給藥干預(yù)，以游標(biāo)卡尺每隔4 d記錄腫瘤大小，腫瘤體積(mm3)=1/2×AB2(A、B 分別為經(jīng)過中心點(diǎn)的腫瘤最大徑和最小徑)[5]，繪制腫瘤生長曲線，觀察結(jié)束后小鼠用于MRI成像，而后以頸椎脫臼法處死，摘除腫塊甲醛固定，用于病理學(xué)檢測。

1.5 MRI了解腫瘤對周圍組織的侵襲及轉(zhuǎn)移情況 將小鼠帶于江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院放射科，鹽酸氯氨酮腹腔注射麻醉后，于小鼠固定器上給予MRI的拍攝，觀察對周圍組織的侵犯及轉(zhuǎn)移情況。

1.6 檢測裸鼠皮下胰腺癌移植瘤組織中TLR9的表達(dá):取下各組裸鼠胰腺癌瘤塊后以4%福爾馬林固定，石蠟包埋，取生理鹽水組腫瘤作TLR-9免疫組織化學(xué)染色，顯微鏡下觀察，拍片。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 裸鼠予皮下種瘤后，各組小鼠生長良好，未出現(xiàn)死亡，給藥干預(yù)后，各組老鼠無特殊異常，正常進(jìn)食，活動好。

2.2 腺癌裸鼠皮下腫瘤體積 當(dāng)腫瘤生長約豌豆大小硬結(jié)，各組給藥干預(yù)，游標(biāo)卡尺測量腫瘤生長情況，最后1次給藥7 d后瘤塊大小見圖1。吉西他濱組、TLR9激動劑+吉西它濱組、TLR9抑制劑+吉西它濱組腫瘤塊體積明顯較其他組小(P<0.05)，TLR9激動劑+吉西它濱組體積(814.56±529.70)mm3比TLR9抑制劑+吉西它濱組體積(301.48±109.51)mm3及吉西他濱組(561.06±277.43)mm3腫瘤塊大(P<0.05)，TLR9抑制劑+吉西它濱組與吉西他濱組比較(P<0.05)；TLR9激動劑組、TLR9抑制劑組及生理鹽水組腫瘤大小差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

A:無菌生理鹽水組;B:TLR9激動劑組;C:TLR9抑制劑組;D:吉西它濱組;E:TLR9激動劑+吉西它濱組;F:TLR9抑制劑+吉西它濱組。

圖1 各組胰腺癌腫瘤摘除后比較

2.3 人胰腺癌裸鼠皮下腫瘤模型生長情況 可見給藥干預(yù)以后，TLR9激動劑+吉西它濱組及TLR9抑制劑+吉西它濱組明顯較對照組生理鹽水組的生長速度減慢，見圖2。TLR9激動劑+吉西它濱組及TLR9抑制劑+吉西它濱組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，TLR9抑制劑+吉西它濱組的生長速度也較TLR9激動劑+吉西它濱組減慢。

A:無菌生理鹽水組;B:TLR9激動劑組;C:TLR9抑制劑組;D:吉西它濱組;E:TLR9激動劑+吉西它濱組;F:TLR9抑制劑+吉西它濱組。

圖2 各組小鼠腫瘤生長曲線

2.4 MRI了解腫瘤對周圍組織的侵襲及轉(zhuǎn)移情況 分別選取各組7周腫瘤老鼠在MRI下觀察，可見7周腫瘤成橢圓形，境界清楚，周圍組織未見明顯轉(zhuǎn)移，肝腎未見明顯轉(zhuǎn)移，見圖3。

A:無菌生理鹽水組;B:TLR9激動劑組;C:TLR9抑制劑組;D:吉西它濱組;E:TLR9激動劑+吉西它濱組;F:TLR9抑制劑+吉西它濱組。

圖3 各組裸鼠在MIR下的影像觀察

2.5 各組裸鼠處死后摘除腫瘤體質(zhì)量、體積及抑瘤率 生理鹽水組、TLR9激動劑組、TLR9抑制劑組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，吉西他濱組的抑瘤率為77.9%，吉西它濱+TLR9激動劑組抑瘤率為66.7%，吉西它濱+TLR9抑制劑組抑瘤率為87.7%，見表1。

表1 各組腫瘤生長抑制作用比較

2.6 腫瘤組織表面TLR9的表達(dá)檢測 免疫組化結(jié)果顯示胰腺癌組織TLR9表達(dá)陽性，成棕黃色，主要位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞間質(zhì)，見圖4。

圖4 裸鼠胰腺癌組織TLR9表達(dá)(×400)

3 討 論

胰腺癌是人常見的惡性腫瘤，近20年我國的發(fā)病率有增加的趨勢，已從第16位躍升至第6位，其發(fā)病隱匿，惡性程度高，手術(shù)切除率低，預(yù)后極差[6]。對于胰腺癌患者，目前治愈的惟一方法是手術(shù)切除，但是胰腺癌局部的浸潤，強(qiáng)烈的結(jié)締組織增生反應(yīng)常會累及周圍重要的臟器，減少這些腫瘤完整切除的機(jī)會[7]。大多數(shù)患者確診時(shí)局部已不能手術(shù)或已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，只有20%～30%的患者可以接受手術(shù)切除。即使在這部分手術(shù)的患者中，腫瘤復(fù)發(fā)率很高，5年生存率只有15%～20%[8]，中位生存時(shí)間15～19個(gè)月。目前的許多方法如化療、放療、酶抑制劑等對于治療胰腺癌效果不佳。因此，基因治療胰腺癌始終是這一領(lǐng)域的焦點(diǎn)。有研究結(jié)果表明Toll樣受體和TLR9誘導(dǎo)及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腫瘤的發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[9]；有學(xué)者已指出TLR9在胰腺癌組織、胰腺癌旁組織及正常胰腺癌組織都有表達(dá)，且在胰腺癌中表達(dá)最多，癌旁組織次之，正常胰腺組織最少[10]；發(fā)現(xiàn)TLR9與胰腺癌增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移有密切聯(lián)系，通過本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)它還與胰腺癌耐藥有關(guān)，未來在臨床治療中，TLR9的研究可能可以為腫瘤的化療和免疫治療提供新的治療方案。

吉西他濱是目前公認(rèn)的胰腺癌抗腫瘤藥物,其機(jī)理為藥物進(jìn)入細(xì)胞后代謝成為有活性的二磷酸鹽和三磷酸鹽,并在細(xì)胞內(nèi)聚集,競爭性摻入DNA雙鍵,從而抑制腫瘤細(xì)胞的DNA合成。即便如此，單獨(dú)靜脈使用吉西他濱仍然效果有限。最新報(bào)道單獨(dú)靜脈使用吉西他濱的臨床受益率為23.8 %,中位生存期5.7個(gè)月,6個(gè)月累積生存率46%,9個(gè)月累積生存率24%,中位疾病進(jìn)展時(shí)間2.1個(gè)月[11]。這一現(xiàn)象提示胰腺腫瘤細(xì)胞對抗癌藥物具有耐藥性。

作者前期體外試驗(yàn)中已證實(shí)TLR9的激活可以增加胰腺癌細(xì)胞對吉西他濱的耐藥。為進(jìn)一步證明TLR9對胰腺癌的化療耐藥性影響，本研究中通過建立裸鼠胰腺癌腫瘤模型，并觀察記錄分析腫瘤生長情況。本研究結(jié)果顯示，吉西他濱組、TLR9激動劑+吉西它濱組、TLR9抑制劑+吉西它濱組腫瘤體積及生長速度明顯小于其他組(P<0.05)；TLR9激動劑+吉西它濱組生長速度及體積明顯大于TLR9抑制劑+吉西它濱組及吉西他濱組(P<0.05)；TLR9抑制劑+吉西它濱組與吉西他濱組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TLR9激動劑組、TLR9抑制劑組及生理鹽水組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。免疫組織化學(xué)顯示移植瘤中有明顯TLR-9表達(dá)，主要位于細(xì)胞質(zhì)及間質(zhì)中，MRI觀察顯示腫瘤種植7周后，腫瘤周圍組織及血管未見明顯侵犯。上述結(jié)果提示，TLR-9受體的活化可增加胰腺癌細(xì)胞對吉西他濱的耐藥作用，降低胰腺癌對化療的敏感性，促進(jìn)腫瘤生長，相關(guān)則抑制生長。

綜上所述，TLR-9的激活可以明顯增加胰腺癌細(xì)胞對化療的耐藥性，降低其對吉西他濱誘導(dǎo)的凋亡的敏感性。但胰腺癌中TLR-9受體所介導(dǎo)的化療耐藥性機(jī)制仍不明，有待進(jìn)一步研究。

[1]Mantoni TS,Lunardi S,Al-Assar O,et al.Pancreatic stellate cells radioprotect pancreatic cancer cells through β1-integrin signaling[J].Cancer Res,2011,71(10):3453-3458.

[2]Wu HQ,Wang B,Zhu SK,et al.Effects of CPG ODN on biological behavior of PANC-1 and expression of TLR9 in pancreatic cancer[J].World J Gastroenterol,2011,17(8):996-1003.

[3]Shankar S,Marsh L,Srivastava RK.EGCG inhibits growth of human pancreatic tumors orthotopically implanted in Balb C nude mice through modulation of FKHRL1/FOXO3a and neuropilin[J].Mol Cell Biochem,2013,372(1/2):83-94.

[4]Tanahashi K,Natsume A,Ohka F,et al.Assessment of tumor cells in a mouse model of diffuse infiltrative glioma by Raman spectroscopy[J].Biomed Res Int,2014(2):860241.

[5]Philips P,Li Y,Martin RC.Low-energy DC current ablation in a mouse tumor model[J].Methods Mol Biol,2014,1121(1121):257-265.

[6]Lepage C,Capocaccia R,Hackl M,et al.Survival in patients with primary liver cancer,gallbladder and extrahepatic biliary tract cancer and pancreatic cancer in Europe 1999-2007:results of EUROCARE-5[J].Eur J Cancer,2015,51(51):2169-2178.

[7]盧曠逸，范昕，馬小艷，等．TLR9激動劑在胰腺星狀細(xì)胞介導(dǎo)的胰腺癌耐藥中的作用[J]．江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2012，22(3)：223-226．

[8]孫運(yùn)良，徐燦，蘇長青，等．靶向重組腺病毒介導(dǎo) Hsp70 基因表達(dá)對大鼠胰腺癌移植瘤的抑制作用[J]．世界華人消化雜志，2012，20(1)：15-21．

[9]Wu HQ,Wang B,Zhu SK,et al.Effects of CPG ODN on biological behavior of PANC-1 and expression of TLR9 in pancreatic cancer[J].World J Gastroenterol,2011,17(8):996-1003.

[10]Zambirinis CP,Levie E,Nguy S,et al.TLR9 ligation in pancreatic stellate cells promotes tumorigenesis[J].J Exp Med,2015,212(12):2077-2094.

[11]Bruckner H.Phase Ⅰ and Ⅱ studies of intravenous Rexin-G as monotherapy for stage Ⅳb gemcitabine-resistant pancreatic cancer[J].Br J Surg,2014,63(2):162-165.

Research on influence of TLR9 on pancreatic cancer nude mouse model growth and resistance to chemotherapy*

LiuYu1,LeiZehua1△,DuBo1,WangZhixu1,GaoFengwei1,WangQing1,ZhangJianxin2

(1.DepartmentofGeneralSurgery,LeshanMunicipalPeople′sHospital,Leshan,Sichuan614000，China；2.AffiliatedHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang,Jiangsu212001,China)

Objective To observe the effects of TLR9 on the nude mouse transplanted tumor growth of human pancreatic cancer and its drug resistance.Methods The nude mouse transplated tumor of human pancreatic cancer PANC-1 was established and randomly divided into 6 groups for conducting the experiment:sterile normal saline group,TLR9 agonist,TLR9 inhibitor group,gemcitabine group,TLR9 inhibitor plus gemcitabine Bin group,TLR9 agonist plus gemcitabine.The tumor size and growth situation were recorded by the vernier caliper.The immunohistochemical method was used to detect tumor TLR9 receptor expression.The tumor growth,metastasis and paracancerous tissue invasion situation were observed by the magnetic resonance imaging (MRI).Results The volume and growth speed of resected tumor mass in the gemcitabine group,TLR9 agonist + gemcitabine group,TLR9 inhibitor plus gemcitabine group was significantly smaller than those in other groups (P<0.05),which in the TLR9 agonist + gemcitabine group were significantly greater than those in the TLR9 inhibitor plus gemcitabine group and gemcitabine group (P<0.05),the difference between the TLR9 inhibitor plus gemcitabine group and gemcitabine group had statistical significance (P<0.05),while the difference among the TLR9 agonist group,TLR9 inhibitor group and normal saline group had no stastistical significance (P>0.05).The tumor in mice at 7 weeks after planting showed oval shape with clear boundary by MRI observation,no obvious metastais and paracancerous invasion were seen in paracancerous tissues no statistically significant,5 weeks,6 weeks after planting,seven weeks mice observed in MRI,the tumor into an,state clearly that the transfer of the surrounding tissue,no significant vascular invasion,heart,liver,kidney disease.The TLR9 expression on the surface of tumor tissue was detected and identified.Conclusion Pancreatic cancer nude mouse transplated tumor has definitely positive expression of TLR9,TLR9 activation can significantly decrease the sensitivity of pancreatic cancer to chemotherapy,increases the drug resistance of tumor,on contrary promotes the tumor growth.

pancreatic neoplasms;nude mouse;gemcitabine;TLR9

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.16.003

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81070287)。作者簡介：劉宇(1986-)，碩士，醫(yī)師，主要從事肝膽外科工作?！?/p>

，E-mail：leitsehua@126.com。

R735.9

A

1671-8348(2017)16-2167-03

2017-01-14

2017-03-18)