馬振國 歐承剛 劉莉潔 趙志偉 莊飛云

（農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學與種質創(chuàng)制重點實驗室，中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

胡蘿卜品種資源遺傳多樣性及親緣關系研究

馬振國 歐承剛 劉莉潔 趙志偉 莊飛云*

（農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學與種質創(chuàng)制重點實驗室，中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

結合表型和SSR標記對29份中國胡蘿卜地方資源、40份橘色栽培品種以及1份土耳其紫色品種進行遺傳多樣性和親緣關系研究。田間農(nóng)藝性狀多樣性分析表明，除葉長、根長、根粗外，春秋兩季胡蘿卜橘色栽培品種的多樣性指數(shù)平均值低于地方資源。主成分分析結果表明，中國橘色地方資源和橘色栽培品種表型在秋季較為相似，但在春季差異較大。利用38對SSR引物對胡蘿卜品種進行擴增，共擴增出133個多態(tài)性位點，其中中國地方資源與橘色栽培品種的平均多態(tài)性位點數(shù)分別為4.2和2.9個。中國地方資源的多態(tài)性信息含量值（0.74±0.06）明顯高于橘色栽培品種（0.42±0.03）。聚類分析將供試胡蘿卜材料分為2組，第I組包括所有橘色栽培品種和橘色地方資源B0241，第Ⅱ組包含其他地方資源和紫色品種L1。

胡蘿卜；表型；SSR；聚類分析；遺傳多樣性；親緣關系

胡蘿卜（Daucus carota L.）是傘形科中種植最廣泛的蔬菜作物，含有豐富的α和β胡蘿卜素。但我國一些胡蘿卜種植基地黑腐病、黑斑病、軟腐病及根結線蟲等病蟲害發(fā)生日趨嚴重（歐承剛 等，2009），同時國內(nèi)冬春大棚栽培、早春露地栽培規(guī)模不斷擴大，先期抽薹現(xiàn)象也極為嚴重，因此挖掘胡蘿卜抗逆資源、培育優(yōu)良品種越發(fā)重要，但我國關于胡蘿卜資源的遺傳多樣性報道較少（莊飛云等，2006），對胡蘿卜病蟲害及抗性資源篩選研究也非常薄弱。國外對于這些研究極為重視，有研究表明，Brasilia品種對黑斑病及根結線蟲具有一定的抗性（Boiteux et al.，1993；Vieira et al.，2003）。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)中國也存在抗根結線蟲品種資源，而且基因位點不同于Brasilia（Ali et al.，2013）。

普遍認為，栽培胡蘿卜起源于10世紀前亞洲中部阿富汗等周邊地區(qū)，最早馴化的胡蘿卜類型為紫色、黃色和紅色，13世紀傳播到中國。中國關于胡蘿卜最早的記載出現(xiàn)在王繼先《紹興校定經(jīng)史證類備急本草》（1159年），該書記載胡蘿卜已作為常用蔬菜，而且廣泛用于生產(chǎn)，說明栽培胡蘿卜在12世紀以前就已出現(xiàn)在中國，這與國外學者提出的觀點不同，但沒有提及根色。而在李時珍《本草綱目》（1578年）中提到了黃色和紅色兩種。最新研究表明，中國胡蘿卜地方資源與阿富汗等周邊地區(qū)資源親緣關系較近，但這些報道只提及中國少量資 源（Iorizzo et al.，2013；Grzebelus et al.，2014；Rong et al.，2014）。橘色胡蘿卜是全世界最主要的種植類型，是類胡蘿卜素積累形成的胡蘿卜演化歷史的一個重要（Iorizzo et al.，2013），最早記載橘色栽培胡蘿卜的歷史文獻出現(xiàn)于15、16世紀（Banga，1957；Stolarczyk & Janick，2011）。Banga（1957）認為橘色胡蘿卜是從黃色胡蘿卜中選育得到的，而Heywood（1983）認為橘色胡蘿卜是由歐洲栽培種和野生種雜交形成的。目前大多認為中國橘色胡蘿卜品種是由19世紀末引入的日本橘色品種逐漸演化形成的，但至今沒有直接證據(jù)。

我國收集保存了389份胡蘿卜地方品種資源，遍布29個省、市和自治區(qū)，包括黃色、紅色、紫紅色和橘色等不同類型資源（朱德蔚 等，2008）。本試驗篩選了有代表性的中國地方資源以及國內(nèi)外引進推廣的橘色栽培品種，通過田間農(nóng)藝性狀鑒定和SSR標記分析中國地方品種資源與橘色栽培品種之間的親緣關系，為研究中國胡蘿卜的演化及抗性資源篩選奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所國家蔬菜種質資源中期庫篩選了29份中國胡蘿卜地方資源，來源于19個省、市和自治區(qū)（莊飛云 等，2006）；篩選了40份國內(nèi)外市場銷售的胡蘿卜橘色栽培品種，包括20份一代雜種（F1）和20份常規(guī)品種（open-pollinated），以及1份土耳其紫色地方品種（表1），均通過商業(yè)購買獲得。2013年7月25日（2013-秋）、2014年3月10日（2014-春）分別在本所順義基地進行露地播種，常規(guī)管理。

1.2 田間農(nóng)藝性狀調查及數(shù)據(jù)分析

田間農(nóng)藝性狀調查主要包括葉著生角度、葉面茸毛、葉型、葉色、葉基部花青素、根肩型、根肩綠色程度、根型、根尖型、根表皮顏色、根肉色、根心柱顏色、抽薹率、葉長、根長、根粗等16項。

葉長、根長和根粗為連續(xù)性變異，分別計算其平均值（X）和標準差（σ），進行10級分類，1級＜X-2σ，10級≥X+2σ，中間每級別差0.5σ（王述民等，2002），每個性狀的多樣性指數(shù)的計算公式為：H’=-Σ piln pi，其中H’為Shannon-Weaver多樣性指數(shù)，pi為某性狀第i級材料份數(shù)占總份數(shù)的百分比。其他13項農(nóng)藝性狀采用賦值后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，賦值依據(jù)胡蘿卜種質資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準（莊飛云和朱德蔚，2007）。利用R3.1.1軟件對春秋兩季田間農(nóng)藝性狀進行主成分（principle component，PC）分析（Detlef et al.，2013），通過第一、第二主成分系數(shù)構建PC圖。

表1 供試胡蘿卜品種資源

1.3 SSR標記分析

每份試材隨機選取6～10株植株幼嫩葉片混合取樣，冷凍抽干，-80 ℃冰箱貯存。研碎后取約100 mg放入2 mL離心管，參照Doyle和Doyle（1987）改良的CTAB法提取DNA，工作液濃度稀釋至30 ng·μL-1。參照Cavagnaro等（2011）發(fā)表的304對SSR引物，利用胡蘿卜品種C3、C37、L1、B0214篩選出38對條帶清晰、位點多態(tài)性明顯的SSR引物。PCR反應體系為10 μL，包括2 μL （30 ng·μL-1）DNA，0.4 μL（2.5 mmol·L-1）dNTPs，上下游引物各0.25 μL（10 μmol·L-1），10×PCR Buffer（ 含 Mg2+）1 μL和 0.1 μL（2.5 U·μL-1）Tap酶，在MultiGene PCR儀中（Labnet，美國）進行擴增。反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性20 s，50～60 ℃退火 （參考不同引物）45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)后72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物4 ℃保存。6 %聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色。根據(jù)Cavagnaro等（2011）發(fā)表的引物擴增片段大小，統(tǒng)計電泳圖譜上的條帶，在同一位置出現(xiàn)的條帶記為“1”，無條帶記為“0”。

用PowerMarker V3.25軟 件 進 行 UPGMA（unweighted pair-group method using arithmetic averages）聚類分析（Liu & Muse，2005）。遺傳多態(tài)性分析采用多態(tài)性信息含量（polymorphism information content，PIC）指標，按照Anderson等（1993）的計算方法，標記i的PIC值計算公式為：PICi=1–ΣPij2，其中Pij表示標記i第j種帶型出現(xiàn)的頻率，本試驗統(tǒng)計帶型為“0”和“1”。PIC值范圍為0～1，0表示無多態(tài)性，1表示具有多態(tài)性。

2 結果與分析

2.1 春秋兩季胡蘿卜田間農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)分析

在調查的13個田間農(nóng)藝性狀中（表2），2013年秋季橘色栽培品種葉色的多樣性指數(shù)為1.09，高于地方資源的0.84，其余12個性狀中，地方資源多樣性指數(shù)均高于橘色栽培品種。2014年春季橘色栽培品種葉著生角度、葉面茸毛、葉型、根肩型、根型、根尖型的多樣性指數(shù)高于地方資源。橘色栽培品種抽薹率春秋兩季之間存在顯著差異，秋季抽薹率多樣性指數(shù)為0，而春季為0.53。綜合比較兩季13個性狀的多樣性指數(shù)平均值，地方資源均高于橘色栽培品種。

春秋兩季之間橘色栽培品種和地方資源的葉長變異較大（表3），橘色栽培品種2013年秋季、2014年春季平均葉長分別為62.4 cm和52.5 cm，變幅分別為40.8～80.2 cm和33.2～73.0 cm，變異系數(shù)和多樣性指數(shù)相似；地方資源2013年秋季、2014年春季的平均葉長分別為50.7 cm和70.0 cm，變幅分別為38.3～69.4 cm和50.2～91.0 cm，變異系數(shù)和多樣性指數(shù)存在較大差異。橘色栽培品種和地方資源的根長和根粗在春秋兩季之間差異不明顯，但地方資源的根長和根粗變異系數(shù)要明顯高于橘色栽培品種，而兩者多樣性指數(shù)則相似。

表2 橘色栽培品種和地方資源田間農(nóng)藝性狀多樣性指數(shù)（H’）比較

表3 橘色栽培品種和地方資源數(shù)量性狀比較

2.2 田間農(nóng)藝性狀主成分分析

通過田間農(nóng)藝性狀主成分分析，春秋兩季材料分布存在明顯差異（圖1）。秋季前9個性狀主成分累計方差貢獻率為72.9%，第一主成分為根表皮顏色、根肉色，第二主成分為葉長，第三主成分為根心柱顏色。春季前7個性狀主成分累計方差貢獻率為76.6%，第一主成分為根心柱顏色、抽薹率，第二主成分為葉基部花青素，第三主成分為葉長、根粗（數(shù)據(jù)未列出）。秋季胡蘿卜栽培橘色地方資源與橘色栽培品種重疊區(qū)域較多，即秋季兩者表型相似品種較多，但橘色地方資源變異范圍較大（圖1-A）。春季橘色地方資源和橘色栽培品種表型特征差異較大，只有少部分重疊（圖1-B），部分分布在其他根色資源品種之間。紅色和黃色地方資源在春秋兩季均形成自身分布區(qū)域，兩者之間沒有重疊。橘黃色品種B0089在兩季均介于橘色和紅色地方資源之間。紫色品種L1在兩季均分布在外圍。

圖1 春秋季田間農(nóng)藝性狀主成分分析

2.3 SSR標記聚類分析

表4顯示38對SSR引物共擴增出133個多態(tài)性位點，平均多態(tài)性位點3.5個。其中地方資源的多態(tài)性位點數(shù)（122個）與橘色栽培品種（116個）相當，但是地方資源平均多態(tài)性位點數(shù)（4.2）高于橘色栽培品種（2.9），特有位點數(shù)（12個）也多于橘色栽培品種（7個）。而且地方資源的多樣性信息含量值（0.74±0.06）明顯高于橘色栽培品種（0.42±0.03）。

聚類結果顯示胡蘿卜材料可分為2組（圖2），第I組包括所有橘色栽培品種和中國橘色地方資源B0241，而第Ⅱ組包含其他地方資源和紫色品種L1。I組中又可分為2個亞組，Ⅰa由來自俄羅斯的C27、C31、C33、C34、C36、C38和C39，加拿大的C20和C21，荷蘭的C24、C22和中國臺灣的C15等組成；Ib主要包括國內(nèi)育種公司引進推廣的橘色栽培品種，包括日本、韓國的黑田類型，其中B0241、C10、C40、C29、C25分布在最外圍。Ⅱ組也可分為2個亞組，Ⅱa包括中國大部分地方橘色資源、紅色B0059、橘黃色B0089和紫色L1，Ⅱb由其他橘色、紅色以及黃色中國地方資源組成，而且這些不同顏色資源呈相間分布。

表4 胡蘿卜品種資源SSR位點多態(tài)性分析

圖2 SSR標記聚類結果

3 結論與討論

中國是胡蘿卜種植面積最大的國家，近十年間生產(chǎn)面積3 不斷結增論長與，我討國論胡蘿卜產(chǎn)業(yè)正處于數(shù)量快速增長向質量中發(fā)國展是的胡轉蘿型卜期種，植但面品積種最單大一的、國病家蟲，害近泛濫、缺于少數(shù)適量應快現(xiàn)速有增栽長培向模質式量品發(fā)種展等的成轉為型制期約，我但國品胡蘿卜產(chǎn)種業(yè)等發(fā)成展為的制主約要我問國題胡，蘿篩卜選產(chǎn)抗業(yè)逆發(fā)性展資的源主和要培問育優(yōu)良品胡種蘿是卜目發(fā)前展我的國首胡要蘿任卜務發(fā)。本展試的驗首通要過任對務。29本份試驗通過間對農(nóng)2藝9性份狀中變國異地和方多資樣源性和分40析份發(fā)橘現(xiàn)色，栽胡培蘿品卜種春秋兩方季資田源間差農(nóng)異藝不性大狀，變但異綜和合多比樣較性其分余析1發(fā)3個現(xiàn)性，胡蘿卜橘種色，栽說培明品中種國葉地長方、資根源長表、型根多粗樣多性樣豐性富指。數(shù)通

與地方資源差異不大，但綜合比較其余13 個性狀，地方資源多樣性指數(shù)平均值高于橘色栽培品種，說明中國地方資源表型多樣性豐富。通過表型性狀主成分分析，發(fā)現(xiàn)春秋兩季橘色栽培品種分布集中，表型較為一致，遺傳背景較為單一；而地方資源品種分布較分散，黃色、紅色資源形成獨立的區(qū)域，表型變異較大，并且我國橘色地方資源介于其他資源之間，表型變異較橘色栽培品種大。結合表型多樣性指數(shù)分析結果，說明我國胡蘿卜地方資源表型具有豐富的多樣性。通過SSR 標記研究發(fā)現(xiàn)中國胡蘿卜地方資源的多態(tài)性位點數(shù)、特有位點數(shù)以及多樣性PIC值均高于橘色栽培品種，與表型鑒定結果一致，這為深入開展抗性資源篩選提供了依據(jù)。

通過聚類分析發(fā)現(xiàn)，市場上銷售的所有橘色栽培品種聚到了第I組，包含加拿大丹佛斯類型品種C16和南特斯類型品種C17、C18、C19，俄羅斯阿姆斯特丹類型C37等常規(guī)品種，以及荷蘭Bejo、韓國世農(nóng)等育種公司推廣的C1、C25、C40等雜交品種，說明國內(nèi)外橘色胡蘿卜栽培品種親緣關系較近。Ⅱ組由橘色、紅色以及黃色資源組成，而且在Ⅱb亞組這些不同顏色資源呈相間分布，說明中國橘色資源可能來自于本地紅色或黃色資源的突變，這與Banga（1957）和Iorizzo等（2013）提出的橘色胡蘿卜可能選自黃色栽培品種的觀點較為相似。同時，土耳其地方品種L1與中國橘色地方資源聚到了一起，這與Rong等（2014）結果一致。綜上所述，中國胡蘿卜品種可能存在自身獨特的馴化過程，其中橘色資源并不是從日本黑田類型演化形成的，實際上日本黑田類型品種是由歐洲引進的品種與亞洲資源雜交選育而成的（Simon et al.，2008）。

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Abstract：Genetic diversity and relationship between 29 Chinese carrot landraces，40 orange varieties and 1 Turkey purple cultivar were investigated using phenotypic and SSR markers. Phenotypic result showed that diversity index of orange varieties was lower than Chinese landraces except for leaf length，root length and root diameter. Principal component analysis showed that Chinese orange landraces had similar phenotypic variation with orange varieties in the autumn，but different in the spring. 133 polymorphic loci were amplified from 38 pairs of SSR primers. The average number of polymorphic loci of Chinese carrot landraces and orange varieties were 4.2 and 2.9，respectively. PIC value of Chinese carrot landraces（0.74±0.06）was obviously higher than that of orange varieties（0.42±0.03）. All accessions were divided into 2 groups: group I including orange varieties and orange B0241，and group Ⅱ containing other landraces and purple cultivar L1.

Studies on Genetic Diversity and Relationship of Carrot Varieties and Germplasm Resources

MA Zhen-guo，OU Cheng-gang，LIU Li-jie，ZHAO Zhi-wei，ZHUANG Fei-yun*
（Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops，Beijing 100081，China）

Carrot；Phenotype；SSR；Cluster analysis；Genetic diversity；Relationship

馬振國，男，碩士研究生，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種，E-mail：mazhenguo2015@163.com

*通訊作者（Corresponding author）：莊飛云，男，博士，副研究員，碩士生導師，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種，E-mail：zhuangfeiyun@caas.cn

2015-04-15；接受日期：2015-06-01

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項（2060302-2），國家科技支撐計劃項目（2013BAD01B04），國家自然科學基金項目（31272162），中國農(nóng)業(yè)科學院創(chuàng)新工程項目