蒲全明任雪松高啟國*劉豫東張林成朱利泉

施松梅1劉曉歡1張 瑩1畢云龍2

（1西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，南方山地園藝學(xué)教育部重點實驗室，重慶 400716；2西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，重慶 400716）

研究論文

結(jié)球甘藍葉片卷曲過程中6個生長素相關(guān)基因的克隆與表達分析

蒲全明1任雪松1高啟國1*劉豫東1張林成1朱利泉2

施松梅1劉曉歡1張 瑩1畢云龍2

（1西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，南方山地園藝學(xué)教育部重點實驗室，重慶 400716；2西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，重慶 400716）

生長素在結(jié)球甘藍球葉向上、向內(nèi)自然卷曲的過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。為挖掘重要的影響結(jié)球甘藍葉片卷曲的生長素相關(guān)基因，通過對結(jié)球甘藍蓮座期葉片與結(jié)球期葉片的轉(zhuǎn)錄組進行對比分析，篩選出6個顯著差異表達的生長素相關(guān)基因，分別為調(diào)控生長素動態(tài)平衡的BoILL6、BoASA1基因，控制極性運輸?shù)腂oSF21、BoPIN4基因，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的BoARF8、BoGH3.5基因。對上述6個基因進行同源克隆，分別獲得全長cDNA序列，序列分析發(fā)現(xiàn)6個基因均含有生長素相關(guān)的結(jié)構(gòu)域。分子進化樹分析發(fā)現(xiàn)各基因與蕪菁的對應(yīng)基因遺傳關(guān)系最近，擬南芥次之。熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，BoILL6、BoASA1與BoSF21的表達量變化最為顯著，結(jié)球期葉片相對蓮座期葉片的表達量差異均高達12倍以上，變化趨勢與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果基本一致，說明這3個基因可能與結(jié)球甘藍葉片的卷曲發(fā)育密切相關(guān)。

結(jié)球甘藍；葉片卷曲；生長素相關(guān)基因；基因克?。槐磉_分析

結(jié)球甘藍（Brassica oleracea L. var. capitata L.）屬十字花科蕓薹屬，其營養(yǎng)生長主要經(jīng)過幼苗期、蓮座期和結(jié)球期3個階段。幼苗期和蓮座期葉片主要進行平展性擴張生長，而結(jié)球期葉片向上、向內(nèi)卷曲抱合發(fā)育形成碩大的葉球。葉球質(zhì)量和緊實度作為結(jié)球甘藍的兩個重要農(nóng)藝性狀，受球葉數(shù)及卷曲程度的直接影響（李曙軒，1990）。結(jié)球甘藍的葉片進入結(jié)球期會發(fā)生自然的向上、向內(nèi)卷曲，這種卷曲球葉為探索葉片卷曲的調(diào)控機制提供了理想材料，目前對甘藍葉片卷曲發(fā)育的研究報道較少。

葉片的分化和卷曲生長過程受到激素的影響（Ito，1957）。生長素作為重要的植物激素，在葉片分化、生長及形態(tài)發(fā)育中具有重要的調(diào)控作用（Cheng et al.，2007；李朝霞 等，2013）。早期研究發(fā)現(xiàn)，煙草葉片涂抹外源生長素，可使葉片偏上性生長（Keller & van Volkenburgh，1997）；擬南芥生長素合成缺陷突變體spl-D和ptl-D都出現(xiàn)葉片偏下生長的表型（Li et al.，2008），而生長素過量表達突變體rooty、yucca、iaaM則呈現(xiàn)出葉片偏上生長的表型（King et al.，1995；Romano et al.，1995；Zhao et al.，2001）。擬南芥生長素信號突變體axr1表現(xiàn)出葉片偏上性生長（Lincoln et al.，1990），而nph4/arf7導(dǎo)致葉片偏下性生長（Harper et al.，2000）。最近的研究表明，生長素對葉片形態(tài)發(fā)育起著決定性作用（Barkoulas et al.，2008）。在擬南芥中，生長素濃度升高與分布不均衡會導(dǎo)致葉片小而卷曲（林瑩瑩 等，2015）；生長素極性運輸?shù)鞍譇tPIN的功能缺失將導(dǎo)致葉片變態(tài)發(fā)育形成有粗壯葉脈的融合葉或主葉脈分叉的寬大葉片（Sawchuk et al.，2013）。由此可見，涉及生長素動態(tài)平衡調(diào)控、極性運輸及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的相關(guān)基因?qū)θ~片形態(tài)發(fā)育均藍球葉卷曲發(fā)育的分子調(diào)控機制還知之甚少。

本試驗基于對結(jié)球甘藍結(jié)球期葉片與蓮座期葉片的轉(zhuǎn)錄組對比分析以及差異表達基因功能注釋，篩選出結(jié)球甘藍中顯著差異表達的生長素動態(tài)平衡相關(guān)基因BoASA1（Niyogi & Fink，1992）、BoILL6（Bartel & Fink，1995），極性運輸相關(guān)基因BoSF21（Kr?uter-Canham et al.，1997）、BoPIN4（G?lweiler et al.，1998），參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因BoGH3.5（Wright et al.，1987）、BoARF8（Ulmasov et al.，1997），分別對上述6個基因的編碼序列進行克隆和生物信息學(xué)分析；并利用熒光定量PCR技術(shù)進一步分析這6個生長素相關(guān)基因在結(jié)球甘藍不同時期葉片中的表達情況，以期為篩選生長素相關(guān)基因中參與甘藍葉片卷曲調(diào)控的重要基因以及探討生長素調(diào)控甘藍葉片卷曲的分子機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料519為結(jié)球性好的中熟甘藍品系，由西南大學(xué)園藝園林學(xué)院十字花科課題組提供。2012年7月底在西南大學(xué)十字花科蔬菜研究所實驗農(nóng)場播種，育苗30 d后移栽到大田。依據(jù)《中國蔬菜栽培學(xué)》（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，2009）闡述的結(jié)球甘藍各個時期的葉片數(shù)以及田間形態(tài)觀察和數(shù)據(jù)統(tǒng)計，519在18～30片真葉時為蓮座期；30～45片真葉時為過渡期；45片真葉以上（中間葉球大小如乒乓球，即葉球直徑4 cm左右）即進入結(jié)球期。

2012年9～12月，分別于結(jié)球甘藍蓮座期（總?cè)~數(shù)為21片）、結(jié)球期（總?cè)~數(shù)為50片）取長1 cm左右的葉片，用于總RNA的提取和轉(zhuǎn)錄組測序。2012年12月至2013年4月，分別于結(jié)球甘藍蓮座期（總?cè)~數(shù)為24片）、蓮座期到結(jié)球期的過渡階段（總?cè)~數(shù)為40片）、結(jié)球期（總?cè)~數(shù)為60片）取長1 cm左右的葉片，-80 ℃保存，用于總RNA的提取與基因表達分析。

1.2 用于轉(zhuǎn)錄組分析的葉片卷曲指數(shù)測定

分別將蓮座期和結(jié)球期選取的葉片隨機分成3組，每組3片，精確測量并計算卷曲指數(shù)。葉片上卷時，側(cè)卷指數(shù)（TC）=lm/pw-1，縱卷指數(shù)（LC）=縱卷指數(shù)（LC）=1-tb/pl。其中，lm為葉片自然狀態(tài)下的葉寬，pw為葉片壓平后的葉寬，tb為葉片自然狀態(tài)下的葉長，pl為葉片壓平后的葉長。

1.3 總RNA的提取

參照植物總RNA提取試劑盒（Tiangen，DP432）說明書提取上述各時期葉片的總RNA，利用NanoVue plus超微量分光光度計（GE，美國）測定RNA濃度；參照PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一條鏈，利用NanoVue plus超微量分光光度計測定后將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋至同一濃度，用于熒光定量PCR分析。

1.4 基于轉(zhuǎn)錄組的差異基因篩選及基因克隆驗證

首先，分別將蓮座期和結(jié)球期葉片混合提取總RNA，送北京百邁克公司用HiSeq 2000進行轉(zhuǎn)錄組測序，利用Trinity軟件對各樣品數(shù)據(jù)進行Unigenes組裝，通過RPKM值來反映Uigenes表達豐度，利用IDEG 6軟件進行差異表達基因檢測，以log2（不同時期RPKM比值）絕對值≥2為標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計差異表達基因，利用Blast軟件將前期轉(zhuǎn)錄組所得的差異表達Unigenes序列（張林成 等，2014）與Swissport、TrEMBL、NR、NT、GO、COG和KEGG數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得Unigenes的蛋白功能注釋信息，依據(jù)功能及其表達差異大小篩選與生長素相關(guān)的基因。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序組裝所得的Unigenes序列，結(jié)合蕓薹屬數(shù)據(jù)庫（http://brassicadb.org/brad/）比對獲得各基因的cDNA序列，運用Primer primer 6.0軟件設(shè)計擴增基因引物（表1）?；蚩寺CR體系為25 μL，以結(jié)球期葉片cDNA為模板，按高保真DNA聚合酶PrimeSTAR說明書操作。擴增程序為：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，退火溫度（表1）30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收純化目的條帶，擴增產(chǎn)物連接pEASY-Blunt載體，轉(zhuǎn)化Trans1-T1大腸桿菌感受態(tài)，通過藍白斑篩選白色陽性菌落，經(jīng)PCR驗證陽性克隆子后送深圳華大基因科技有限公司測序。

1.5 基因的生物信息學(xué)分析

基于已完成的轉(zhuǎn)錄組測序和數(shù)據(jù)分析，通過同源PCR擴增的方法獲得各基因全長cDNA序列后，利用Clustalxl 8.0軟件對所得序列進行比對分析，利用DNAStar軟件推導(dǎo)基因編碼序列相應(yīng)氨基酸序列，利用在線軟件SignalP（http://www.cds. dtu.dk/services/）對信號肽的存在情況進行分析，通過ExPASy（http://expasy.org/tools//）在線分析氨基酸的理化性質(zhì)，利用Swiss-model在線工具（http:// www.swissmodel.expasy.org/）、PROSITE（http://www. expasy.org/prosite）、InterProScan（http://www.ebi. ac.uk/interpro/scan.html）以及Predict Protein（http:// www.predictprotein.org/）預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和功能位點，利用NCBI中Blast（http://www.ncbi.nlm. nih.gov/）在線分析結(jié)球甘藍生長素相關(guān)基因和其他物種的同源性；利用MEGA 5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并分析其進化關(guān)系。

表1 結(jié)球甘藍生長素相關(guān)基因克隆引物

1.6 基因的熒光定量分析

采用實時熒光定量RT-PCR的方法，對各生長素相關(guān)基因表達的時空特異性進行分析。分別以蓮座期葉片、過渡期葉片與結(jié)球期葉片的cDNA為模板，參照TaKaRa SYBR? Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）試劑盒說明書（25 μL反應(yīng)液體系）檢測各生長素相關(guān)基因的表達情況。根據(jù)基因同源克隆所得的序列，利用Primer Primer 5.0軟件設(shè)計熒光定量引物，引物序列見表2。以TIPS和Actin2作為內(nèi)參基因（Chandna et al.，2012），反應(yīng)在C1000/CFX96儀器（Bio-Rad，美國）上完成，反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，退火溫度（表2）30 s，40個循環(huán)。利用Bio-RadCFX96熒光定量PCR儀CFX Manager Software軟件（2–ΔΔCT法）和Excel軟件進行數(shù)據(jù)處理。

表2 熒光定量PCR（qRT-PCR）引物

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析與生長素相關(guān)差異表達基因的篩選

為了篩選出可能參與甘藍葉片自然卷曲發(fā)育調(diào)控的生長素相關(guān)基因，對蓮座期葉片和結(jié)球期葉片進行轉(zhuǎn)錄組測序和對比分析，利用Trinity軟件對各樣品測序數(shù)據(jù)進行組裝，利用Blast軟件將序列與NT、NR、GO、COG、SwissProt、TrEMBL和KEGG等數(shù)據(jù)庫比對，共獲得54 209條Unigenes功能注釋信息，蓮座期葉片與結(jié)球期葉片間差異表達的基因共有1 768條，其中與生長素相關(guān)的差異表達基因有49條，包括涉及生長素動態(tài)平衡的基因8條，參與生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因33條，調(diào)控生長素極性運輸?shù)幕?條。利用RPKM值來反映Unigenes的表達豐度，以log2〔結(jié)球期葉片RPKM（T3）/蓮座期葉片RPKM（T6）〕絕對值≥2為標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計差異表達基因，依據(jù)差異顯著性由高到低的原則選取6個生長素相關(guān)基因進行后續(xù)分析，分別為涉及生長素動態(tài)平衡的基因BoASA1、BoILL6，調(diào)控生長素極性運輸?shù)幕駼oPIN4、BoSF21，涉及生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因BoGH3.5和BoARF8（表3）。15.45，BoPIN4基因為-2.24，BoSF21基因為2.83，BoGH3.5基因為4.74，BoARF8基因為2.87。蓮座期葉片的縱卷指數(shù)為-0.06，側(cè)卷指數(shù)為-0.19；結(jié)由此可見，除BoPIN4在卷曲程度更高的結(jié)球期葉片中表達量比蓮座期葉片低以外，其余5個基因在卷曲程度更高的結(jié)球期葉片中表達量均比蓮座期葉片高。

表3 結(jié)球甘藍生長素相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

2.2 基因克隆與cDNA序列分析

通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得上述6個生長素相關(guān)基因的Unigenes序列，與蕓薹屬數(shù)據(jù)庫進行比對分析發(fā)現(xiàn)，可從轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中獲得BoASA1、BoILL6、BoSF21、BoGH3.5、BoARF8的全長cDNA序列，其開放閱讀框（ORF）大小分別為1 785、1 386、1 035、1 776、2 406 bp；而BoPIN4只有部分cDNA序列。進一步以結(jié)球期葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，對這6個生長素相關(guān)基因進行PCR克隆驗證，獲得6個基因的全長cDNA序列。其中BoPIN4的cDNA序列長度為1 950 bp，其余5個基因的cDNA序列長度與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致。通過Bolbase數(shù)據(jù)庫的BLAST Search程序進行分析比對發(fā)現(xiàn)（表4），生長素動態(tài)平衡調(diào)控基因BoASA1、BoILL6分別與Bol044016、Bol006952一致性最高，分別定位于C09、C03染色體；生長素極性運輸調(diào)控基因BoPIN4、BoSF21分別與Bol014822、Bol009024一致性最高，均定位于C02染色體；生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因BoGH3.5、BoARF8分別與Bol032157、Bol012563一致性最高，分別定位于C09、C06染色體。

表4 結(jié)球甘藍生長素相關(guān)基因的cDNA序列分析

2.3 蛋白序列分析

利用ExPASy在線軟件分析6個蛋白序列的分子量、平均疏水性、理論等電點，發(fā)現(xiàn)BoASA1、BoARF8和BoGH3.5為可溶性蛋白（表5）。利用CBS網(wǎng)站在線軟件TMHMM Server v2.0與Signal 4.0分析發(fā)現(xiàn)BoILL6（第7～29位氨基酸處）、BoSF21（第114～136位氨基酸處）與BoPIN4（第7～26、41～60、69～91、101～123和130～152位氨基酸處）含跨膜域，BoILL6（第1～24位氨基酸處）含信號肽。利用CBS網(wǎng)站的在線軟件NetPhos 2.0對各蛋白序列進行磷酸化位點分析，發(fā)現(xiàn)各蛋白均具有多個可能的蛋白激酶磷酸化位點，以Ser位點為主。

通過NCBI在線Blast比對及myhits在線軟件Motif Scan分析各蛋白，繪制各蛋白結(jié)構(gòu)示意圖（圖1）。結(jié)果顯示：BoASA1含有保守的Anth_synt_I_ N結(jié)構(gòu)域與Chorismate_bind功能域，作為存在于序列N端的鄰氨基苯甲酸合成酶組件，Anth_synt_I_ N可以催化氨與分支酸的結(jié)合，Chorismate_bind功能域則是鄰氨基苯甲酸合成酶的催化區(qū)域；BoILL6含典型的M20_IAA_Hyd功能域，可水解IAA-Asp形成游離IAA；BoSF21含Ndr域，該結(jié)構(gòu)參與調(diào)控生長素極性運輸（Mudgil et al.，2013）；BoPIN4含保守的AEC（auxin efflux carrier）域與Mem_trans（membrane transport protein）域，是生長素運輸載體蛋白的特異性結(jié)構(gòu)域；BoGH3.5含1個GH3生長素響應(yīng)啟動子（GH3_arp）；BoARF8含1個保守的B3 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、生長素響應(yīng)因子（ARF）功能域與Auxin/IAA域。

表5 結(jié)球甘藍生長素相關(guān)基因編碼的蛋白質(zhì)特征

圖1 結(jié)球甘藍生長素相關(guān)基因的蛋白結(jié)構(gòu)示意圖

通過NCBI網(wǎng)站Blast比對，結(jié)果表明這6個生長素相關(guān)基因的編碼蛋白與蕪菁、擬南芥基因具有較高的一致性。結(jié)球甘藍BoASA1、BoILL6、BoPIN4、BoSF21、BoGH3.5、BoARF8與BrASA1、 BrILL6、BrPIN4、BrSF21、BrGH3、BrARF8的相似性最高，分別為98%、98%、95%、99%、98%、94%。在線收集各蛋白的同源序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖2），分析表明結(jié)球甘藍BoASA1、BoILL6與蕪菁BrASA1、BrILL6距離最近，與擬南芥AtASA1、AtILL6次之，都屬于生長素動態(tài)平衡調(diào)控蛋白；結(jié)球甘藍BoSF21、BoPIN4分別與蕪菁BrSF21、BrPIN4，擬南芥AtSF21、AtPIN4聚為一大分支，都屬于生長素極性運輸類蛋白；結(jié)球甘藍BoGH3.5、BoARF8分別與蕪菁BrGH3.5、BrARF8遺傳關(guān)系最近，與擬南芥次之，屬于生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)類蛋白。

圖2 結(jié)球甘藍生長素相關(guān)基因的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 生長素相關(guān)基因的時空表達特性分析

以結(jié)球甘藍蓮座期葉片、過渡期葉片和結(jié)球期葉片的cDNA為模板，TIPS和Actin2為內(nèi)參基因，通過熒光定量PCR檢測這6個生長素相關(guān)基因的表達情況。從圖3可以看出，生長素動態(tài)平衡調(diào)控類基因BoILL6與BoASA1的表達趨勢相同，過渡期、結(jié)球期2個時期葉片的表達量均高于蓮座期葉片表達量（圖3-a），分別是蓮座期葉片的14.5倍與42.8倍、3.87倍與12.33倍，這與轉(zhuǎn)錄組分析的2個基因表達變化趨勢一致。生長素極性運輸類基因BoPIN4與BoSF21的表達模式存在明顯差異，與蓮座期葉片相比，BoPIN4在結(jié)球期葉片中整體下調(diào)0.6倍；而BoSF21在過渡期葉片和結(jié)球期葉片的表達量分別為蓮座期葉片的22.1倍與29.8倍，呈顯著上升趨勢（圖3-b），這與轉(zhuǎn)錄組分析這2個基因的表達變化趨勢相同。生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)類基因BoGH3.5與BoARF8在各個時期葉片均有表達，BoARF8在結(jié)球期葉片中的表達量比蓮座期葉片高，但上升幅度相比于轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果較??；BoGH3.5在過渡期葉片與結(jié)球期葉片中的表達量分別為蓮座期葉片的1.59倍與3.65倍（圖3-c），與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果相符。

圖3 結(jié)球甘藍生長素相關(guān)基因的時空表達特性

從圖3還可以看出，與較平展的蓮座期葉片相比，除了BoPIN4在結(jié)球期葉片中表達量下調(diào)外，其余5個基因均在結(jié)球期葉片中上調(diào)表達（圖3-d），這與轉(zhuǎn)錄組分析的各基因表達變化模式一致。

3 結(jié)論與討論

生長素在植物體內(nèi)主要通過動態(tài)平衡調(diào)控、極性運輸與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程發(fā)揮其對生長發(fā)育的調(diào)節(jié)作用（Chitwood et al.，2012）。生長素通過調(diào)控葉片背/腹面細(xì)胞生長與分裂，對葉片卷曲發(fā)育具有重要影響（Tsukaya，2003；Li et al.，2007）。研究發(fā)現(xiàn)，生長素穩(wěn)態(tài)調(diào)控基因UGT84B1、IATM1與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因WRKY71-1在擬南芥中過量表達，均能夠使葉片發(fā)生卷曲（Jackson et al.，2002；Qin et al.，2005；Qin et al.，2013）；在煙草中，iaaM的超表達會促進生長素含量升高，進而引起植株葉片皺縮和卷曲（李朝霞 等，2013）。生長素濃度的升高或降低均會導(dǎo)致葉片的形態(tài)改變（Jyothilakshmi et al.，2008）。在擬南芥中，屬于M20家族的AtILL6基因超表達不僅能通過水解IAA-Ala促進植物體內(nèi)生長素含量升高，還能通過水解茉莉酸共軛物JAIle間接促進生長素含量升高，進而調(diào)節(jié)植物形態(tài)建成（Emilie et al.，2013）。AtASA1基因的高表達能夠促進生長素水平升高（Sun et al.，2009），而ASA1功能的缺失會降低內(nèi)源生長素含量（Stepanova et al.，2005）。本試驗獲取的甘藍BoILL6、BoASA1基因與擬南芥AtILL6、AtASA1同源性分別高達84%、90%，經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)BoILL6蛋白中存在典型的M20_IAA_Hyd結(jié)構(gòu)域、BoASA1中存在典型的Anth_synt_I_N與Chorismate_bind結(jié)構(gòu)域。進一步進行熒光定量分析發(fā)現(xiàn)，BoILL6、BoASA1在卷曲的結(jié)球期葉片中的表達量較平展的蓮座期葉片劇烈上調(diào)。由此推測，甘藍結(jié)球期葉片BoILL6和BoASA1表達量升高，導(dǎo)致葉片中生長素濃度升高，進而參與結(jié)球甘藍球葉卷曲發(fā)育表型的調(diào)控。

生長素極性運輸在葉片對稱發(fā)育過程中具有重要作用。本試驗從結(jié)球甘藍中獲得了BoPIN4與BoSF21基因，分析表明BoPIN4含典型生長素運輸載體蛋白具有的AEC域，在結(jié)球期葉片中的表達量較蓮座期葉片下降了0.6倍；BoSF21含Ndr結(jié)構(gòu)域，與NDL1同屬N-MYC家族，在結(jié)球期葉片中的表達量較蓮座期上升了29.8倍，這與Mudgil等（2013）發(fā)現(xiàn)擬南芥AtNDL1負(fù)調(diào)節(jié)AtPIN1表達的結(jié)果一致。在擬南芥中，AtNDL1超表達會造成葉序異常發(fā)育（Mudgil et al.，2013），生長素外輸載體AtPIN功能缺失會導(dǎo)致擬南芥產(chǎn)生葉脈粗壯的融合葉或主葉脈分叉的寬大葉片（Sawchuk et al.，2013）。由此推測，BoSF21可能通過負(fù)調(diào)控BoPIN4的表達參與生長素極性運輸，進而在結(jié)球甘藍葉片形態(tài)發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

在生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，生長素響應(yīng)因子ARF處于中心位置（Li et al.，2015），而GH3家族是其下游靶基因之一（Yang et al.，2006）。有關(guān)報道表明，生長素響應(yīng)因子ARF3在番茄中過量表達，會導(dǎo)致葉片下卷（Tamar et al.，2012）；在擬南芥中，屬于GH3基因家族的ASR1基因過量表達，引起蓮座葉片向下卷曲、側(cè)根生長受阻（李志邈，2004）。筆者從結(jié)球甘藍中克隆獲得的BoARF8、BoGH3.5基因，分析發(fā)現(xiàn)BoARF8含有Arf功能域，BoGH3.5含生長素響應(yīng)啟動子GH3_arp。隨著結(jié)球甘藍葉片的卷曲，結(jié)球期葉片被包裹于甘藍葉球中導(dǎo)致見光少或未見光，而ARF8基因的表達又需要光誘導(dǎo)（Tian et al.，2004），這可能就是導(dǎo)致本試驗中熒光定量PCR檢測顯示BoARF8在結(jié)球期葉片中表達量上升幅度比轉(zhuǎn)錄組分析差異小的原因。但是，本試驗中轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析和熒光定量PCR檢測結(jié)果均表明結(jié)球期葉片中BoARF8與BoGH3.5基因的表達量均較蓮座期上調(diào)，BoGH3.5基因上調(diào)的幅度較BoARF8的上調(diào)幅度大，這與Yang等（2006）發(fā)現(xiàn)水稻ARF8基因正調(diào)控GH3基因表達的結(jié)論相符。

綜上所述，本試驗在對結(jié)球甘藍蓮座期葉片和結(jié)球期葉片進行轉(zhuǎn)錄組測序和分析的基礎(chǔ)上，初步明確了顯著差異表達的6個生長素相關(guān)基因（log2絕對值＞2）。同時在對結(jié)球甘藍生長發(fā)育過程的形態(tài)觀察中發(fā)現(xiàn)由蓮座期進入過渡期以及結(jié)球期后，葉片的分化速度明顯加快，且剛分化出的葉片形態(tài)已有了明顯的改變。因此，筆者在后續(xù)進行熒光定量PCR檢測基因表達時增加了過渡期的材料。對比轉(zhuǎn)錄組和熒光定量PCR分析的基因表達差異的結(jié)果，雖然由于兩種情況的取材時間點稍有差異，造成所檢測的基因表達變化的倍數(shù)不同，但是兩種情況下6個基因的整體變化趨勢一致。尤其是熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示BoILL6、BoASA1、BoSF21等3個生長素相關(guān)基因的表達變化顯著，結(jié)球期葉片相對蓮座期葉片的表達差異均高達12倍以上，且在3個時期葉片中的表達量呈逐漸上升的趨勢，說明這3個基因與結(jié)球甘藍葉片發(fā)育過程中葉片卷曲程度具有緊密相關(guān)性。依據(jù)前述外源生長素涂抹后使葉片呈現(xiàn)偏上性生長的表型（Keller & van Volkenburgh，1997；李朝霞 等，2013），以及擬南芥中AtILL6、AtASA1和AtSF21基因功能分析結(jié)果（Stepanova et al.，2005；Sun et al.，2009；Emilie et al.，2013），推測甘藍結(jié)球期葉片中這3個基因表達量較蓮座期葉片顯著升高，可能會提高結(jié)球期葉片中游離態(tài)生長素濃度以及改變?nèi)~片中生長素的極性分布，使結(jié)球期葉片向上、向內(nèi)生長，呈現(xiàn)自然卷曲的表型，從而通過生長素途徑影響甘藍葉片卷曲發(fā)育。接下來的工作是對這些基因進行結(jié)球甘藍遺傳轉(zhuǎn)化和表型分析，以便進一步探討其在甘藍葉片卷曲發(fā)育過程中的重要作用。

李曙軒．1990．中國農(nóng)業(yè)百科全書．北京：農(nóng)業(yè)出版社：317-318．

李朝霞，殷嫻，江一希，姜洋，肖尊安．2013．轉(zhuǎn)基因煙草中過量生長素對葉片生長發(fā)育的影響．北京師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，49（4）：369-373．

李志邈．2004．兩個與抗病、抗逆和發(fā)育相關(guān)的擬南芥激發(fā)標(biāo)簽突變體asr1和dai1的研究〔博士論文〕．杭州：浙江大學(xué)．

林瑩瑩，李曉云，劉帥，鐘玉婷，李玲．2015．過表達轉(zhuǎn)錄因子AhAREB1對擬南芥生長素分布的影響．華南師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，47（1）：87-92．

張林成，高啟國，蒲全明，任雪松，劉豫東，朱利泉，王小佳．2014．結(jié)球甘藍BoLH01和BoLH02基因的克隆與表達．作物學(xué)報，40（8）：1371-1379．

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所．2009．中國蔬菜栽培學(xué)．2版．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社：497-499．

Barkoulas M，Hay A，Kougioumoutzi E，Tsiantis M．2008．A developmental framework for dissected leaf formation in the Arabidopsis relative Cardamine hirsuta．Nature Genetics，40：1136-1141．

Bartel B，F(xiàn)ink G R．1995．ILR1，an amido hydrolase that releases active indole-3-acetic acid from conjugates．Science，268：1745-1748．

Chandna R，Augustine R，Bisht N C．2012．Evaluation of candidate reference genes for gene expression normalization in Brassica juncea using real time quantitative RT-PCR．PLoS One，7（5）：36918．

Cheng Y，Dai X，Zhao Y．2007．Auxin synthesized by the YUCCA flavin monooxygenases is essential for embry ogenesis and leaf formation in Arabidopsis．Plant Cell，19：2430-2439．

Chitwood D H，Headland L R，Ranjan A，Martinez C C，Braybrook S A，Koenig D P，Kuhlemeier Cris，Smith R S，Sinha N R．2012．Leaf asymmetry as a developmental constraint imposed by auxindependent phyllotactic patterning．The Plant Cell，24：2318-2327．

Emilie W，Laurence M，Rapha?l L，Emilie H，C lé ment H，Yann A，Michel M，F(xiàn)ranck P，Thierry H．2013．The amido-hydrolases IAR3 and ILL6 contribute to jasmonoyl-isoleucine hormone turnover and generate 12-hydroxy-jasmonic acid upon wounding in Arabidopsis leaves．Plant Biology，288（44）：31701-31714．

G?lweiler L，Guan C，M ü ller A，Wisman E，Mendgen K，Yephremov A．1998．Regulation of polar auxin transport by AtPIN1 in Arabidopsis vascular tissue．Science，282（5397）：2226-2230．

Harper R M，Stowe-Evans E L，Luesse D R，Muto H，Tatematsu K．2000．The NPH4 locus encodes the auxin response factor ARF7，a conditional regulator of differential growth in aerial Arabidopsis tissue．Plant Cell，12：757-770．

Ito H．1957．Effect of temperature and photoperiod on head formation of leafy head of Chinese cabbage．J Hort Assoc Japn，26：154-162．

Jackson R G，Kowalczyk M，Li Y，Higgins G，Ross J，Sandberg G，Bowles D J．2002．Over-expression of an Arabidopsis gene encoding a glucosyltransferase of indole-3-acetic acid：phenotypic characterisation of transgenic lines．Plant J，32：573-583．

Jyothilakshmi V，Claudia R，Yvonne V，Iris C，Ajit V，Bationa S，Ond E，Miroslav S，Ludwig-M ü ller J，Ralf O．2008．The role of auxins and cytokinins in the mutualistic interaction between Arabidopsis and Piriformospora indica．MPMI，21：1371-1383．

Keller C P，van Volkenburgh E．1997．Auxin-induced epinasty of tobacco leaf tissues （a nonethylene-mediated response）．Plant Physiol，13：603-610．

King J J，Stimart D P，F(xiàn)isher R H，Bleecker A B．1995．A mutation altering auxin homeostasis and plant morphology in Arabidopsis．Plant Cell，7：2023-2037．

Kr?uter-Canham R，Bronner R，Evrad J L，Hahne G，F(xiàn)riedt W，Steinmetz A．1997．A transmitting tissue- and pollen-expressed protein from sunflower with sequence similarity to the human RTP protein．Plant Sci，129：191-202．

Li L C，Kang D M，Chen Z L，Qu L J．2007．Hormonal regulation of leaf morphogenesis in Arabidopsis．J Inte Plant Biol，49：75-80．

Li L C，Qin G J，Tsuge T，Hou X H，Ding M Y，Aoyama T，Oka A，Chen Z L，Gu H Y，Zhao Y D，Qu L J．2008．SPOR OCYTELESS modulates YUCCA expression to regulate the development of lateral organs in Arabidopsis．New Phytol，179：751-764．

Li S B，OuYang W Z，Hou X J，Xie L L，Hu C G，Zhang J Z．2015．Genome-wide identification，isolation and expression analysis of auxin response factor（ARF）gene family in sweet orange（Citrus sinensis）．Front Plant Sci，6：119．

Lincoln C，Britton J H，Estelle M．1990．Growth and development of the axr1 mutants of Arabidopsis．Plant Cell，2：1071-1080．

Mudgil Y，Ghawana S，Jones A M．2013．N-MYC DOWNREGULATED-LIKE proteins regulate meristem initiation by modulating auxin transport and MAX2 expression．PLoS One，8（11）：77863．

Niyogi K K，F(xiàn)ink G R．1992．Two anthranilate synthase in Arabidopsis：defense-related regulation of the tryptophan pathway．Plant Cell，4（6）：721-733．

Qin G J，Gu H Y，Zhao Y D，Ma Z，Shi G L，Yang Y，Eran P，Chen H D，Liu M H，Chen Z L，Qu L J．2005．An indole-3-acetic acid carboxyl methyltransferase regulates Arabidopsis leaf development．The Plant Cell，17（10）：2693-2704．

Qin Z，Lyu H J，Zhu X L，Meng C，Quan T Y，Wang M C，Xia G M．2013．Ectopic expression of a wheat WRKY transcription factor gene TaWRKY71-1 results in hyponastic leaves in Arabidopsis thaliana．PLoS One，8（5）：e63033．

Romano C P，Robson P R，Smith H，Estelle M，Klee H．1995．Transgene-mediated auxin overproduction in Arabidopsis：hypocotyl elongation phenotype and interactions with the hy6-1 hypocotyl elongation and axr1 auxin-resistant mutants．Plant Mol Biol，27：1071-1083．

Sawchuk M G，Edgar A，Scarpella E．2013．Patterning of leaf vein networks by convergent auxin transport pathways．PLoS Genet，9（2）：1003294．

Stepanova A N，Hoyt J M，Hamilton A A，Alonso J M．2005．A link between ethylene and auxin uncovered by the characterization of two root-specific ethylene-insensitive mutants in Arabidopsis．Plant Cell，17（8）：2230-2242．

Sun J Q，Xu Y X，Ye S Q，Jiang H L，Chen Q，Liu F，Zhou W K，Chen R，Li X G，Olaf T，Wu X Y，Cohen J D，Palme K，Li C Y．2009．Arabidopsis ASA1 is important for jasmonate-mediated regulation of auxin biosynthesis and transport during lateral root formation．The Plant Cell，21：1495-1511．

Tamar Y，Irena P，Dror P，Gilgi F，Anna P，Moti S，Guy W，Johnpaul A，Ziva A，Yuval E．2012．Failure of the tomato transacting short Interfering RNA program to regulate auxin response factor 3 and ARF4 underlies the wiry leaf syndrome．Plant Cell，24（9）：3575-3589．

Tian C E，Muto H，Higuchi K，Matamura T，Tatematsu K，Koshiba T，Yamamoto K T．2004．Disruption and overexpression of auxin response factor 8 gene of Arabidopsis affect hypocotyl elongation and root growth habit，indicating its possible involvement in auxin homeostasis in light condition．The Plant Journal，40（3）：333-343．

Tsukaya H．2003．Organ shape and size：a lesson from studies of leaf morphogenesis．Current Opinion in Plant Biology，6（1）：57-62．

Ulmasov T，Hagen G，Guilfovle T J．1997．ARF1，a transcription factor that binds to auxin response elements．Science，276（5320）：1865-1868．

Wright R M，Hagen G，Guilfovle T．1987．An auxin-induced polypeptide in dicotyledonous plants．Plant Mol Biol，9：625-634.

Yang J H，Han S J，Yoon E K，Lee W S．2006．Evidence of an auxin signal pathway，microRNA167-ARF8-GH3，and its response to exogenous auxin in cultured rice cells．Nucleic Acids Research，34（6）：1892-1899．

Zhao Y，Christensen S K，F(xiàn)ankhauser C，Cashman J R，Cohen J D，Weigel D，Chory J. 2001. A role for flavin monooxy genase-like enzymes in auxin biosynthesis .Science，291：306-309.

Clone and Expression Analysis of Six Auxin-related Genes in Brassica oleracea L. var. capitata L.

PU Quan-ming1，GAO Qi-guo1*，ZHANG Lin-cheng1，SHI Song-mei1，LIU Xiao-huan1，ZHANG Ying1，BI Yun-long2，REN Xue-song1，LIU Yu-dong1，ZHU Li-quan2
（1Key Laboratory of Horticulture Science for Southern Mountainous Regions，Ministry of Education，College of Horticulture and Landscape Architecture，Southwest University， Chongqing 400716，China；2College of Agronomy and Biotechnology，Southwest University，Chongqing 400716，China）

Auxin plays an important role in regulating the process of Brassica oleracea L. var. capitata L. leaf curl．In order to find out the auxin relevant genes involved in cabbage leaf curling，we analyzed transcriptome of cabbage leaf at rosette and heading stages and identified 6 significantly differentially expressed auxin-related genes，including regulation of homeostasis genes（BoILL6，BoASA1），controlling polar transport genes（BoSF21，BoPIN4）and involving in signal transduction genes（BoARF8，BoGH3.5）．The full-length cDNA sequences of 6 genes were obtained，respectively using homologous clone method．The protein structure prediction revealed that 6 genes contained auxin-related domains．Phylogenetic analysis though MEGA 5.1 comparison displayed that these genes had the closest genetic relationship with correspondence genes of Brassica rapa，and Arabidopsis thaliana followed. The real-time Fluorescence quantitative PCR analysis suggested that the expression level of BoILL6，BoASA1 and BoSF21 showed significantly different trend．The expression level of these 3 genes in leaf during heading stage were 12 folds more than that in the leaf at rosette stage．The trend was consistent with the results of transcriptome analysis．The up-regulated expression of these 3 genes in the leaf during heading stage maybe lead to enhance the auxin concentration and change the auxin polar contribution in the leaves，and finally lead to format of the leaf curl．

Brassica oleracea L. var. capitata L.；Leaf curl；Auxin-related genes；Gene cloning；Expression analysis

蒲全明，男，碩士研究生，專業(yè)方向：甘藍重要品種性狀基因的分離與鑒定，E-mail：puquanming@163.com

*通訊作者（Corresponding author）：高啟國，男，副研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事甘藍重要品種性狀基因的分離與鑒定、十字花科植物自交不親和性等方面的研究，E-mail：gaoqg2004031@163.com

2015-08-26；接受日期：2015-09-14

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（“973”計劃）項目（2012CB113900），國家自然科學(xué)基金項目（30900986），重慶市自然科學(xué)基金重點項目（cstc2012jjB80010），中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資金資助項目（XDJK2010B010）