付 凌 宋劍波 胡春燕 曾黎明

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，南昌 330045)

?；撬崾菑V泛存在于人和動(dòng)物體內(nèi)的一種游離的含硫活性物質(zhì)，其不僅能從食物中直接獲取，還能通過半胱氨酸氧化轉(zhuǎn)氨基作用內(nèi)源生成。大量研究已經(jīng)證實(shí)?；撬峋哂卸喾N生理功能，如抗氧化作用、抗炎癥反應(yīng)、維持糖代謝以及血管舒張等［1-3］。不僅如此，由于?；撬嵩趧?dòng)物機(jī)體內(nèi)可同時(shí)作為神經(jīng)遞質(zhì)，其在神經(jīng)退化性疾病上的作用已經(jīng)在動(dòng)物營養(yǎng)和醫(yī)療等領(lǐng)域得到了廣泛的關(guān)注。

肝臟是合成牛磺酸的主要場所，大量臨床和基礎(chǔ)研究表明牛磺酸對肝臟損傷有保護(hù)作用。如Wei等［4］研究報(bào)道，?；撬崮軌蛞种品至言せ畹牡鞍准っ?p38MAPK)的磷酸化以及核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)的活性，從而緩解?；悄懰嵴T導(dǎo)的大鼠肝臟損傷。不僅如此，體外試驗(yàn)也證實(shí)了?；撬釋ρ趸瘧?yīng)激等誘導(dǎo)的肝臟細(xì)胞損傷也具有保護(hù)作用［5］。而目前關(guān)于?；撬犷A(yù)處理對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠急性肝臟損傷的保護(hù)作用研究較少，因此，本試驗(yàn)旨在探討添加2.5%的牛磺酸對LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肝臟損傷的緩解效果，以期為肝臟損傷的預(yù)防和治療及?；撬嵩趧?dòng)物營養(yǎng)上的運(yùn)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和試劑

30只癌癥研究小鼠(ICR小鼠)，雄性，體重(22±3)g，購于重慶市騰鑫生物技術(shù)有限公司。?；撬?T103829-100 g，純度 99%)和 LPS(L118716，純度99%)購于阿拉丁試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

小鼠預(yù)飼3 d后，隨機(jī)分為3組，每組10只(n=10):對照組和LPS組飼喂基礎(chǔ)飼糧(基礎(chǔ)飼糧購于重慶市騰鑫生物技術(shù)有限公司)，?；撬峤M在基礎(chǔ)飼糧中添加2.5%的?；撬帷Ｅ；撬岬奶砑恿繀⒄誐aia等［6］的研究結(jié)果設(shè)定。小鼠飼養(yǎng)在人工控制的環(huán)境中，12 h光照(07:00—19:00)和12 h黑暗，溫度(23±2)℃，濕度(50±10)%，自由采食和飲水。正式試驗(yàn)開始1周后，LPS組和牛磺酸組小鼠腹腔注射10 mg/kg的LPS(LPS溶解于生理鹽水，注射劑量為0.2 mL/只)，對照組小鼠腹腔注射同體積的生理鹽水。LPS注射24 h后，小鼠屠宰取樣。

1.3 測定指標(biāo)和方法

1.3.1 平均日增重和肝臟指數(shù)

試驗(yàn)期內(nèi)，每日稱量小鼠體重，計(jì)算平均日增重。LPS注射24 h后，所有小鼠頸椎脫臼死后無菌摘取肝臟，用濾紙吸去血液，用眼科剪剪去脂肪和系膜后稱重，計(jì)算肝臟指數(shù)。

肝臟指數(shù)(g/kg)=肝臟重量(g)/體重(kg)。

1.3.2 血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性的測定

小鼠處死前，于眼眶采血，3 500 r/min離心10 min，取上清用全自動(dòng)生化分析儀測定血清中ALT和AST活性，測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.3.3 肝臟氧化應(yīng)激參數(shù)的檢測

準(zhǔn)確稱取部分肝臟組織，按重量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入預(yù)冷的生理鹽水，冰水浴條件下機(jī)械勻漿，2 500 r/min離心10 min，取上清用于檢測肝臟丙二醛(MDA)含量以及谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性，檢測試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

1.3.4 肝臟組織形態(tài)檢測

取1 cm×1 cm×1 cm左右的肝臟組織樣品，保存于10%的福爾馬林溶液，然后制作石蠟切片，并進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色。

1.3.5 肝臟抗氧化基因及轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)、Kelch樣ECH相關(guān)蛋白(Keap1)表達(dá)的測定

肝臟總RNA的提取參照Trizol說明書，然后取1μg總RNA立即采用TaKaRa Prime Script RT Reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)。實(shí)時(shí)熒光定量方法參照TaKaRa SYBR Premix Ex Taq定量試劑盒說明書。利用2-△△Ct對定量結(jié)果進(jìn)行整理分析［5］，△△Ct=(Ct靶基因-Ct內(nèi)參基因)試驗(yàn)組-(Ct靶基因-Ct內(nèi)參基因)對照組。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 引物序列見表1。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理，然后采用SPSS 19.0對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(oneway ANOVA)，然后用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，P＜0.05為差異顯著。數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛磺酸對LPS處理小鼠平均日增重和肝臟指數(shù)的影響

由表2可知，LPS注射前，各組平均日增重?zé)o顯著差異(P＞0.05);注射 LPS后，LPS組平均日增重較對照組顯著下降(P＜0.05)，而?；撬峤M則與這2組均沒有顯著差異(P＞0.05)。此外，LPS組肝臟指數(shù)較對照組顯著上升(P＜0.05)，而?；撬峤M肝臟指數(shù)則與對照組差異不顯著(P＞0.05)，說明添加?；撬峋徑饬诵∈蟾闻K損傷。

2.2 ?；撬釋?LPS處理小鼠血清 ALT和 AST活性的影響

由表3可知，與對照組相比，LPS組血清ALT和AST活性分別增加了61%和30%(P＜0.05)，由此可見LPS造成了小鼠肝臟損傷。與對照組相比，?；撬峤M血清ALT和AST活性分別增加了40%(P＜0.05)和 18%(P＞0.05)，這說明，在本試驗(yàn)中，添加2.5%的?；撬釋PS誘導(dǎo)的肝臟損傷起到了一定的緩解作用。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物Table 1 The primer sequences for real-time qPCR

表2 小鼠平均日增重和肝臟指數(shù)Table 2 Average daily gain and liver index of mice(n=10)

表3 小鼠血清ALT和AST活性Table 3 Serum ALT and AST activities of mice(n=10) U/L

2.3 ?；撬釋PS處理小鼠肝臟氧化應(yīng)激參數(shù)的影響

由表4可知，與對照組相比，腹腔注射LPS顯著增加了肝臟MDA含量并降低了GPx的活性(P＜0.05);添加?；撬釋PS引起的肝臟 MDA含量增加和GPx活性降低起到了一定的緩解作用，但是差異不顯著(P＞0.05)。各組肝臟SOD和CAT活性均沒有顯著變化(P＞0.05)。

表4 小鼠肝臟氧化應(yīng)激參數(shù)Table 4 Liver oxidative stress parameters of mice(n=10)

2.4 ?；撬釋PS處理小鼠肝臟形態(tài)的影響

由圖1可知，對照組小鼠肝臟組織細(xì)胞排列緊密有序，結(jié)構(gòu)完整，未出現(xiàn)任何損傷跡象;LPS組小鼠肝臟細(xì)胞排列紊亂疏松，且呈現(xiàn)出中性淋巴細(xì)胞侵潤;而?；撬峤M較LPS組肝臟損傷情況要輕。

圖1 肝臟形態(tài)學(xué)檢測Fig.1 Liver morphological detection(400×)

2.5 ?；撬釋PS處理小鼠肝臟抗氧化基因及Nrf2和Keap1表達(dá)的影響

由圖2可知，與對照組相比，腹腔注射LPS顯著下調(diào)了肝臟GPx1、SOD1以及Nrf2的相對表達(dá)量(P＜0.05);盡管添加牛磺酸對肝臟 SOD1的相對表達(dá)量沒有產(chǎn)生顯著影響(P＞0.05)，但是顯著上調(diào)了肝臟GPx1和Nrf2的相對表達(dá)量(P＜0.05)，并且GPx1的相對表達(dá)量還達(dá)到與對照組差異不顯著(P＞0.05)。此外，牛磺酸和LPS處理對肝臟GPx2、SOD2、CAT以及Keap1的相對表達(dá)量均沒有顯著影響(P＞0.05)。

3 討論

Li等［7］研究表明，腹腔注射 100 mg/kg的LPS顯著增加了斷奶仔豬肝細(xì)胞的核溶解、核固縮以及細(xì)胞增殖血液ALT和AST活性。Roller等［8］研究了LPS對小鼠肝臟的損傷作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)了肝細(xì)胞的凋亡反應(yīng)，且顯著增加了血液ALT和AST活性，其機(jī)制可能是由于LPS介導(dǎo)了環(huán)氧化酶的表達(dá)。在本試驗(yàn)中，注射10 mg/kg LPS影響了小鼠的肝臟形態(tài)和肝臟指數(shù)，且顯著增加了血清ALT和AST活性，與上述前人報(bào)道一致。正常情況下，ALT和AST主要存在于肝臟細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)肝臟受到損傷時(shí)，ALT和AST被釋放進(jìn)入血液，因此血液ALT和AST活性是主要的肝臟損傷指標(biāo)［9］。Maia等［6］研究報(bào)道，添加2.5%?；撬崮軌蝻@著緩解小鼠氧化應(yīng)激損傷，且對生產(chǎn)性能具有一定的促進(jìn)作用。因此，本試驗(yàn)選用2.5%作為?；撬岬奶砑恿浚Y(jié)果發(fā)現(xiàn)?；撬犸@著降低了小鼠的肝臟指數(shù)，并對LPS誘導(dǎo)的血清ALT和AST活性升高起到了一定的緩解。此外，其他一些研究也表明牛磺酸對四氯化碳(CCl4)和冷缺血再灌注誘導(dǎo)的大鼠肝臟損傷均具有保護(hù)作用［10-11］。然而，Deminice 等［12］最近研究表明，添加?；撬岵]有對膽堿缺乏誘導(dǎo)的大鼠肝臟損傷起到緩解作用。這可能是由于牛磺酸對不同肝臟損傷模型的敏感性存在差異等造成的。

圖2 小鼠肝臟抗氧化基因及Nrf2和Keap1的表達(dá)Fig.2 The expression of liver antioxidant genes，Nrf2 and Keap1 of mice(n=10)

許多研究已經(jīng)證實(shí)，肝臟損傷往往伴隨著氧化應(yīng)激，且氧化應(yīng)激對肝臟損傷或肝臟疾病的發(fā)生和發(fā)展具有促進(jìn)作用［13-14］。Zhu 等［15］研究表明，在CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝臟損傷模型中，肝臟脂質(zhì)氧化和MDA含量顯著增加;Kim等［16］也報(bào)道了大鼠在急性熱應(yīng)激后肝臟MDA含量顯著增加，微陣列分析發(fā)現(xiàn)與氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)。在本試驗(yàn)中，注射LPS顯著增加了小鼠肝臟MDA含量，并抑制了肝臟GPx的活性。MDA是脂質(zhì)氧化產(chǎn)物，目前已經(jīng)被廣泛當(dāng)作一種氧化應(yīng)激標(biāo)記物，而GPx是機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分。由此可見，本試驗(yàn)中LPS誘導(dǎo)了小鼠肝臟氧化應(yīng)激。近年來，?；撬岬目寡趸饔靡呀?jīng)得到證實(shí)，因此?；撬嵋脖粡V泛用于氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的研究。Zhang等［17］建立了鐵誘導(dǎo)的氧化損傷，結(jié)果表明添加?；撬犸@著緩解了脂質(zhì)氧化，并提高了抗氧化物酶的活性，從而抑制了氧化應(yīng)激介導(dǎo)的肝臟細(xì)胞凋亡。而在本試驗(yàn)中，盡管添加?；撬釋PS誘導(dǎo)的肝臟MDA含量增加和GPx活性降低具有一定的緩解作用，但是差異不顯著。這與Jeon等［18］的研究結(jié)果存在一定的分歧，他們報(bào)道?；撬崮軌蝻@著抑制LPS誘導(dǎo)的氧自由基產(chǎn)生，從而緩解了氧化損傷。通過仔細(xì)比較發(fā)現(xiàn)，Jeon等［18］的試驗(yàn)與本研究存在很大的差異，例如?；撬岷蚅PS作用劑量和檢測指標(biāo)等，這些差異可能最終導(dǎo)致了研究結(jié)果的不一致。

抗氧化基因的表達(dá)對抗氧化物酶的釋放起著直接調(diào)控作用，因此本試驗(yàn)進(jìn)一步檢測了肝臟抗氧化基因的表達(dá)。與肝臟抗氧化物酶活性一致，LPS抑制了肝臟 GPx1和SOD1的表達(dá)，但是對GPx2、SOD2以及CAT的表達(dá)沒有顯著影響。此外，本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)添加?；撬犸@著緩解了LPS對GPx1表達(dá)的抑制作用。目前有關(guān)于?；撬釋Px1表達(dá)的上調(diào)作用鮮有報(bào)道，但是Chang等［19］研究也表明，在飲水中添加0.35%或0.70%的?；撬峥赏ㄟ^上調(diào)過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPAR-α)和偶聯(lián)蛋白2(UCP2)的表達(dá)介導(dǎo)SOD和CAT活性，從而緩解高脂飼糧誘導(dǎo)的小鼠肝脂肪變性和氧化應(yīng)激。此外，Chen等［20］也報(bào)道了?；撬崮軌蚓徑饩凭T導(dǎo)的肝臟炎癥基因上調(diào)，從而緩解氧化損傷。

大量研究表明，氧化應(yīng)激能夠激活多條信號(hào)通路，從而介導(dǎo)抗氧化基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。Nrf2/Keap1信號(hào)通路是介導(dǎo)氧化應(yīng)激的一條重要通路，研究表明，Nrf2敲出小鼠更容易受到氧自由基的攻擊，造成氧化損傷［21-22］。此外，Nrf2/Keap1信號(hào)通路在肝臟疾病、癌癥以及一些氧化應(yīng)激相關(guān)疾病上起著重要的作用［23-24］。正常情況下，Nrf2在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)與Keap1緊密結(jié)合，并快速降解。而在氧化應(yīng)激條件下，Keap1蛋白半胱氨酸殘基增多，從而引起Keap1結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)而失去了與Nrf2結(jié)合的活性。細(xì)胞質(zhì)游離的Nrf2能夠轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，從而介導(dǎo)抗氧化基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)［25］。Nrf2/Keap1信號(hào)通路下游涉及到多種抗氧化基因的表達(dá)，其中包括 GPx、SOD、CAT、過氧化物酶、硫氧還蛋白(Trx)、血紅素加氧酶(HO-1)以及醌氧化還原酶等抗氧化物酶［25］。Agca 等［26］研究表明，?；撬崮軌蚣せ頝rf2信號(hào)，從而緩解糖尿病大鼠腦氧化損傷。此外，體外試驗(yàn)也證明了?；撬崽幚鞷AW 264.7巨噬細(xì)胞能夠增加Nrf2向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，并上調(diào)Trx和HO-1等抗氧化基因的表達(dá)，從而緩解過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激［27］。在本試驗(yàn)中，肝臟Keap1的表達(dá)沒有受到LPS和牛磺酸的顯著影響，LPS下調(diào)了肝臟Nrf2的表達(dá)，而添加?；撬犸@著緩解了LPS對Nrf2表達(dá)的抑制。由此可以推斷，牛磺酸激活了Nrf2/Keap1信號(hào)通路，從而介導(dǎo)了抗氧化基因的表達(dá)，近增強(qiáng)了小鼠肝臟抗氧化能力并緩解了LPS誘導(dǎo)的肝臟損傷。

4 結(jié) 論

腹腔注射LPS誘導(dǎo)了小鼠肝臟損傷和氧化應(yīng)激，而添加2.5%的?；撬犸@著降低了LPS誘導(dǎo)小鼠的肝臟指數(shù)，且上調(diào)了肝臟GPx1和Nrf2的表達(dá)，對LPS誘導(dǎo)的肝臟損傷和氧化應(yīng)激均起到一定的緩解作用。

［1］ RIPPS H，SHEN W.Review:taurine:a“very essential”amino acid［J］.Molecular Vision，2012，18:2673-2686.

［2］ STIPANUK M H，UEKI I.Dealing with methionine/homocysteine sulfur:cysteine metabolism to taurine and inorganic sulfur［J］.Journal of Inherited Metabolic Disease，2011，34(1):17-32.

［3］ STIPANUK M H.Role of the liver in regulation of body cysteine and taurine levels:a brief review［J］.Neurochemical Research，2004，29(1):105-110.

［4］ WEI S D，HUANG Q Y，LI J Z，et al.Taurine attenuates liver injury by downregulating phosphorylated p38 MAPK of Kupffer cells in rats with severe acute pancreatitis［J］.Inflammation，2012，35(2):690-701.

［5］ REDMOND H P，WANG J H，BOUCHIER-HAYES D.Taurine attenuates nitric oxide-and reactive oxygen intermediate-dependent hepatocyte injury［J］.Archives of Surgery，1996，131(12):1280-1287.

［6］ MAIA A R，BATISTA T M，VICTORIO J A，et al.Taurine supplementation reduces blood pressure and prevents endothelial dysfunction and oxidative stress in post-weaning protein-restricted rats［J］.PLoS One，2014，9(8):e105851.

［7］ LI Q，LIU Y L，CHE Z Q，et al.Dietary L-arginine supplementation alleviates liver injury caused by Escherichia coli LPS in weaned pigs［J］.Innate Immunity，2012，18(6):804-814.

［8］ ROLLER J，LASCHKE M W，SCHEUER C，et al.Heme oxygenase(HO)-1 protects from lipopolysaccharide(LPS)-mediated liver injury by inhibition of hepatic leukocyte accumulation and improvement of microvascular perfusion［J］.Langenbeck’s Archives of Surgery，2010，395(4):387-394.

［9］ GURUNG R B，PURBE B，GYAWALI P，et al.The ratio of aspartate aminotransferase to alanine aminotransferase(AST/ALT):the correlation of value with underlying severity of alcoholic liver disease［J］.Kathmandu University Medical Journal，2013，11(43):233-236.

［10］ TASCI I，MAS N，MAS M R，et al.Ultrastructural changes in hepatocytes after taurine treatment in CCl4induced liver injury［J］.World Journal of Gastroenterology，2008，14(31):4897-4902.

［11］ WETTSTEIN M，H?USSINGER D.Taurine attenuates cold ischemia-reoxygenation injury in rat liver［J］.Transplantation，2000，69(11):2290-2296.

［12］ DEMINICE R，ROSA F T，DA SILVA L E C M，et al.Taurine supplementation does not decrease homocysteine levels and liver injury induced by a cholinedeficient diet［J］.Life Sciences，2014，105(1/2):43-47.

［13］ LIU Y T，YANG L Q，TAO K M，et al.Protective effects of hydrogen enriched saline on liver ischemia reperfusion injury by reducing oxidative stress and HMGB1 release［J］.BMC Gastroenterology，2014，14(1):12.

［14］ MATSUO K，SASAKI E，HIGUCHI S，et al.Involvement of oxidative stress and immune-and inflammation-related factors in azathioprine-induced liver injury［J］.Toxicology Letters，2014，224(2):215-224.

［15］ ZHU X，ZHANG F，ZHOU L，et al.Diallyl trisulfide attenuates carbon tetrachloride-caused liver injury and fibrogenesis and reduces hepatic oxidative stress in rats［J］.Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology，2014，387(5):445-455.

［16］ KIM K J，HONG H D，LEE O H，et al.The effects of Acanthopanax senticosus on global hepatic gene expression in rats subjected to heat environmental stress［J］.Toxicology，2010，278(2):217-223.

［17］ ZHANG Z Y，LIU D，YI B，et al.Taurine supplementation reduces oxidative stress and protects the liver in an iron-overload murine model［J］.Molecular Medi-cine Reports，2014，10(5):2255-2262.

［18］ JEON S H，LEE M Y，RAHMAN M M，et al.The antioxidant，taurine reduced lipopolysaccharide(LPS)-induced generation of ROS，and activation of MAPKs and Bax in cultured pneumocytes［J］.Pulmonary Pharmacology ＆ Therapeutics，2009，22(6):562-566.

［19］ CHANG Y Y，CHOU C H，CHIU C H，et al.Preventive effects of taurine on development of hepatic steatosis induced by a high-fat/cholesterol dietary habit［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59(1):450-457.

［20］ CHEN X，SEBASTIAN B M，TANG H，et al.Taurine supplementation prevents ethanol-induced decrease in serum adiponectin and reduces hepatic steatosis in rats［J］.Hepatology，2009，49(5):1554-1562.

［21］ KURZATKOWSKI D M，TROMBETTA L D.Maneb causes pro-oxidant effects in the hippocampus of Nrf2 knockout mice［J］.Environmental Toxicology and Pharmacology，2013，36(2):427-436.

［22］ WRUCK C J，F(xiàn)RAGOULIS A，GURZYNSKI A，et al.Role of oxidative stress in rheumatoid arthritis:insights from the Nrf2-knockout mice［J］.Annals of the Rheumatic Diseases，2011，70(5):844-850.

［23］ GIUDICE A，ARRA C，TURCO M C.Review of molecular mechanisms involved in the activation of the Nrf2-ARE signaling pathway by chemopreventive agents［J］.Methods in Molecular Biology，2010，647:37-74.

［24］ SINHA D，BISWAS J，BISHAYEE A.Nrf2-mediated redox signaling in arsenic carcinogenesis:a review［J］.Archives of Toxicology，2013，87(2):383-396.

［25］ STEPKOWSKI T M，KRUSZEWSKI M K.Molecular cross-talk between the NRF2/KEAP1 signaling pathway，autophagy，and apoptosis［J］.Free Radical Biology and Medicine，2011，50(9):1186-1195.

［26］ AGCA C A，TUZCU M，HAYIRLI A，et al.Taurine ameliorates neuropathy via regulating NF-κB and Nrf2/HO-1 signaling cascades in diabetic rats［J］.Food and Chemical Toxicology，2014，71:116-121.

［27］ JANG JS，PIAO SY，CHA Y N，et al.Taurine chloramine activates Nrf2，increases HO-1 expression and protects cells from death caused by hydrogen peroxide［J］.Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition，2009，45(1):37-43.