張家明，許多現(xiàn)，李相昕，齊曉芬，張 旭，于殿宇*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超臨界CO2酯交換法制備低能SLS型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)工藝

張家明，許多現(xiàn)，李相昕，齊曉芬，張 旭，于殿宇*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

在超臨界CO2狀態(tài)下，采用脂肪酶RMIM催化乙酸乙酯與一級大豆油反應(yīng)制備SLS型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)，分別應(yīng)用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)考察酶用量、反應(yīng)壓力、溫度和時(shí)間對乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率的影響。結(jié)果表明，最佳工藝條件為酶用量2.9%、反應(yīng)時(shí)間13.1 h、反應(yīng)壓力9.4 MPa、反應(yīng)溫度49.0 ℃，此條件下乙酸乙酯的轉(zhuǎn)化率可達(dá)到36.1%，經(jīng)純化后獲得純度為90.3%、熱值為22.35 kJ/g的SLS型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)，與普通大豆油相比，熱值降低了42%。

超臨界CO2；脂肪酶；結(jié)構(gòu)脂質(zhì)；乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率

油脂能賦予食品獨(dú)特的口感與風(fēng)味，是食品的重要組成部分，但高脂肪的攝入會(huì)引起肥胖、某些癌癥和心血管疾病等[1-3]。目前，肥胖病人及相關(guān)疾病在逐年增加，因而，開發(fā)口感、風(fēng)味等性質(zhì)與天然油脂相同，而發(fā)熱量較低的低能油脂已成為人們研究的熱點(diǎn)[4-6]。

酯交換生產(chǎn)低能油脂主要有化學(xué)法和酶法兩種[7]。傳統(tǒng)的酯交換生產(chǎn)低能油脂產(chǎn)品主要是采用化學(xué)催化法合成，但此法存在著反應(yīng)溫度高、化學(xué)污染嚴(yán)重、產(chǎn)物色澤差等缺點(diǎn)；目前，國內(nèi)外多以酶催化法合成，該法在有機(jī)溶劑和無溶劑中反應(yīng)都取得了較好進(jìn)展，但在超臨界二氧化碳（supercritical CO2，SC-CO2）狀態(tài)酶法催化合成低能油脂鮮有相關(guān)報(bào)道。SC-CO2狀態(tài)下酶反應(yīng)，是近年來生物工程新開拓的領(lǐng)域[8-9]。當(dāng)CO2達(dá)到臨界溫度（31.1 ℃）和壓力（7.28 MPa）以上時(shí)，物理性質(zhì)介于流體和氣體之間，CO2顯示出較大的溶解能力和較高傳遞特性，從而可大大降低酶反應(yīng)過程的傳質(zhì)阻力，提高酶反應(yīng)速率[10]；另外，SC-CO2無毒、不可燃、化學(xué)惰性佳、易與反應(yīng)物底物分離[11-13]。這些優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)使其在食品工業(yè)上的應(yīng)用具有廣闊的發(fā)展前景。由于乙酸酸性較強(qiáng)，在反應(yīng)體系中可能會(huì)影響脂肪酶的活性，體系中乙酸的含量過高也會(huì)產(chǎn)生大量的羧基基團(tuán)，從脂肪酶表面奪走部分必需水，而且可以從油水界面進(jìn)入到周圍的水層中，導(dǎo)致底物抑制效應(yīng)的發(fā)生[14]。因此，本實(shí)驗(yàn)以乙酸乙酯和一級大豆油為原料，對超臨界狀態(tài)下利用1,3特異性脂肪酶催化合成低能SLS型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)進(jìn)行研究，探討反應(yīng)壓力、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和酶用量對轉(zhuǎn)化率的影響，進(jìn)而最大限度地合成Sn-1、Sn-3為短鏈、Sn-2為長鏈的長短鏈脂肪酸甘油三酯（SLS型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)）。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆一級油 九三糧油工業(yè)集團(tuán)有限公司；無水乙醇、冰醋酸（分析純） 黑龍江雙城市鑫田化學(xué)試劑制造有限公司；固定化脂肪酶RMIM（酶活力275 IUN/G）丹麥諾維信公司；CO2（純度＞99.99%） 北京京高氣體有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫水浴鍋 余姚市東方電工儀器廠；高壓反應(yīng)釜威海新元化工機(jī)械有限公司；ZK-GT2A型分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；XW-80A 微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠；RE-51A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海博通經(jīng)貿(mào)有限公司；DF-101 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 上海卓康生物科技有限公司；分子蒸餾儀 德國UIC gmbh公司；GC-14B氣相色譜儀 日本島津公司；ZDHW-5000微機(jī)全自動(dòng)量熱儀 鶴壁華源儀器。

1.3 方法

1.3.1 乙酸乙酯的制備

在50 mL圓底燒瓶中加入9.5 mL（0.2 mol）無水乙醇和6 mL（0.1 mol）冰醋酸，再小心加入2.5 mL濃硫酸，混勻后加入沸石，再裝上冷凝管。小心加熱反應(yīng)瓶，緩慢回流0.5 h，冷卻反應(yīng)物，將回流裝置改成蒸餾裝置，接受瓶用冷水冷卻，蒸出生成的乙酸乙酯，直到餾出液約為反應(yīng)物總體積的1/2為止。在餾出液中慢慢加入飽和碳酸鈉振蕩至不再有CO2氣體產(chǎn)生為止。將混合液轉(zhuǎn)入分液漏斗，分去下層水溶液，有機(jī)層用5 mL飽和氯化鈉洗滌，再用5 mL氯化鈣洗滌，最后用水洗滌一次，分去下層液體。有機(jī)層倒入干燥三角燒瓶中，用無水硫酸鎂干燥。將干燥后的有機(jī)物進(jìn)行蒸餾，收集72～78 ℃餾分乙酸乙酯，稱量收集到的乙酸乙酯的質(zhì)量。

1.3.2 酶促酯化

在高壓反應(yīng)釜中按2∶1的物質(zhì)的量比加入乙酸乙酯與一級大豆油和2%的水分，同時(shí)加入轉(zhuǎn)子和一定量的脂肪酶，將反應(yīng)釜密封后充入少量CO2以置換出反應(yīng)釜中的空氣，同時(shí)試漏，確定反應(yīng)釜密封情況良好后，在加壓泵的作用下充入CO2使反應(yīng)釜內(nèi)達(dá)到一定壓力，然后將反應(yīng)釜置于水浴鍋中，調(diào)節(jié)磁力攪拌器的轉(zhuǎn)速至120 r/min，在一定溫度條件下反應(yīng)一定時(shí)間。

1.3.3 乙酸乙酯含量的檢測

采用薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）法進(jìn)行乙酸乙酯的定量和定性分析[15-17]。

1.3.4 酯交換率計(jì)算

式中：C0為反應(yīng)初始體系中乙酸乙酯的單位含量/（g/g）；C1為反應(yīng)完畢后體系乙酸乙酯的單位含量/（g/g）。

1.3.5 產(chǎn)品的純化

反應(yīng)完畢后，取出轉(zhuǎn)子，將反應(yīng)釜內(nèi)的物質(zhì)高速離心除去固定化脂肪酶，取上述物質(zhì)裝入分子蒸餾的物料瓶中，在冷阱中裝入液氮后，打開真空泵，對反應(yīng)產(chǎn)物脫氣，待脫氣完畢后，設(shè)定所需的蒸餾溫度100 ℃、真空度0.5～0.8 Pa，固定冷凝面溫度5 ℃，設(shè)定蒸餾刮膜轉(zhuǎn)速為150 r/min，調(diào)節(jié)進(jìn)料閥保持進(jìn)料流量約為1.5 mL/min（1 滴/3 s），進(jìn)而進(jìn)行分子蒸餾純化（在蒸餾過程中視液氮揮發(fā)程度及時(shí)補(bǔ)充冷阱中的液氮），對所得餾出物（主要成分為脂肪酸乙酯、乙酸乙酯、單甘酯、甘二酯等）和餾余物（重相主要成分為甘油三酯）分別進(jìn)行收集，將得到的餾余物利用壽佳菲等[18]在中長鏈脂肪酸甘油三酯的制備與分離純化研究中的分離純化方法，獲得提純后的產(chǎn)物并利用氣相色譜[19]對其進(jìn)行定性分析，從而確定獲得產(chǎn)物中以SLS型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)為主。再次利用壽佳菲等[18]研究，對所得產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步的純度檢測，按式（2）計(jì)算SLS型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的純度：

1.3.6 低能SLS型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)制備工藝優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對反應(yīng)壓力、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、酶用量采用Box-Behnken試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，以確定制備低能SLS型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)工藝條件，響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table1 Factors and levels used in Box-Behnken design

1.3.7 產(chǎn)品指標(biāo)的測定

碘值的測定：參照GB/T 5532—2008《動(dòng)植物油脂碘值的測定》；酸值的測定：參照GB/T 5530—2005《動(dòng)植物油脂酸值和酸度測定》；過氧化值的測定：參照GB/T 5538—2005《動(dòng)植物油脂過氧化值的測定》；皂化值的測定：參照GB/T 5534—2008《動(dòng)植物油脂皂化值的測定》；大豆油色澤的測定：參照GB/T 22460—2008《動(dòng)植物油脂羅維朋色澤測定》；油脂熱值的測定：參照粟智等[20]的研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶用量對乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率的影響

酶用量分別取 1%、2%、3%、4%、5% 時(shí)，固定反應(yīng)壓力9 MPa、反應(yīng)溫度50 ℃、反應(yīng)時(shí)間11 h，酶用量對乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率的影響見圖1。

圖1 酶用量對乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率的影響Fig.1 Effect of RMIM lipase concentration on ethyl acetate conversion rate

在超臨界高壓條件下，脂肪酶活力基本不受影響[21]。由圖1可知，隨著酶用量的增加，乙酸乙酯的轉(zhuǎn)化率也隨之提高，但當(dāng)酶用量達(dá)到3%以上時(shí)，乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率的增加趨勢不明顯，這可能是隨著酶用量的增加，酶分子與底物接觸的機(jī)會(huì)增加，反應(yīng)速率加快，酯化反應(yīng)程度提高，但酶用量達(dá)到3%后由于酶用量過高時(shí)，水解反應(yīng)所需的水分子不足，不能及時(shí)為水解提供所需的水分，導(dǎo)致反應(yīng)不能及時(shí)進(jìn)行。同時(shí)脂肪酶價(jià)格較高，出于成本考慮，酶用量選擇3%最為適宜。

2.1.2 反應(yīng)時(shí)間對乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率的影響

反應(yīng)時(shí)間分別取 7、9、11、13、15 h 時(shí)，固定酶用量3%、反應(yīng)壓力9 MPa、反應(yīng)溫度50 ℃，反應(yīng)時(shí)間對乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率的影響見圖2。

圖2 反應(yīng)時(shí)間對乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2 Effect of reaction time on ethyl acetate conversion rate

由圖2可知，開始時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，乙酸乙酯的轉(zhuǎn)化率不斷提高，但反應(yīng)時(shí)間達(dá)到13 h后上升效果不再顯著，這可能是因?yàn)殡S著反應(yīng)時(shí)間延長，底物質(zhì)量濃度減少和酶活力下降，使反應(yīng)速率逐漸減慢，轉(zhuǎn)化率的增長趨于平緩。綜合考慮反應(yīng)時(shí)間以13 h為宜。

2.1.3 反應(yīng)壓力對乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率的影響

反應(yīng)壓力分別取7、8、9、10、11 MPa時(shí)，固定酶用量3%、反應(yīng)溫度50 ℃、反應(yīng)時(shí)間13 h，反應(yīng)壓力對乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率的影響見圖3。

圖3 反應(yīng)壓力對乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Effect of reaction pressure on ethyl acetate conversion rate

壓力對脂肪酶本身體系影響不大，主要是它影響了SC-CO2的性質(zhì)，從而影響反應(yīng)速率及轉(zhuǎn)化率[22]。由圖3可知，隨著反應(yīng)壓力的增加，反應(yīng)速率加快，從而可相應(yīng)縮短反應(yīng)時(shí)間，當(dāng)壓力達(dá)到10 MPa以上時(shí)，乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率的提高不再顯著，因此反應(yīng)壓力10 MPa較為適宜。

2.1.4 反應(yīng)溫度對乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率的影響

反應(yīng)溫度分別取30、40、50、60、70 ℃時(shí)，固定酶用量3%、反應(yīng)壓力10 MPa、反應(yīng)時(shí)間13 h，反應(yīng)溫度對乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率的影響見圖4。

圖4 反應(yīng)溫度對乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 Effect of reaction temperature on ethyl acetate conversion rate

由圖4可知，當(dāng)溫度從30 ℃升至50 ℃時(shí)，乙酸乙酯的轉(zhuǎn)化率隨之逐漸上升，這說明隨著溫度的升高，脂肪酶的催化活性部位逐漸暴露，發(fā)揮出較強(qiáng)的活性。當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，脂肪酶催化活性達(dá)到極值，之后酯化程度開始下降，這有可能是較高溫度致使酶部分失活而引起的?？梢?，脂肪酶RMIM在催化酯化反應(yīng)的最佳溫度在50 ℃左右。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)[23-24]，以酶用量（A）、反應(yīng)時(shí)間（B）、反應(yīng)壓力（C）、反應(yīng)溫度（D）為自變量，以乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率為響應(yīng)值設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table2 Experimental design and results for response surface analysis

根據(jù)表2中乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率試驗(yàn)數(shù)據(jù)，應(yīng)用Design-Expert 7.5.0軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，所得主要分析結(jié)果見表3。

通過對試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率（Y）對自變量酶用量（A）、反應(yīng)時(shí)間（B）、反應(yīng)壓力（C）和反應(yīng)溫度（D）的回歸方程為：

Y=35.15－0.55A＋0.98B＋3.82C＋0.11D－0.55AB－0.59AC＋0.12AD－1.68BC＋1.55BD－2.73CD－3.46A2－3.22B2－5.26C2－4.48D2

表3 回歸變量方差分析結(jié)果Table3 Analysis of variance of regression model

從表3可以看出，失擬項(xiàng)P值為0.422 8＞0.05，表明失擬不顯著。模型的P值是0.000 1，可知該模型的預(yù)測值與實(shí)測值比較相符的；方程的相關(guān)系數(shù)R2為0.924 5，調(diào)整后的R2為0.863 4，表明模型可以解釋86.34%的超臨界條件乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率水平的變化，進(jìn)一步說明了回歸方程的擬合程度較好。

根據(jù)上述回歸方程繪出響應(yīng)面分析圖，以確認(rèn)酶用量、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)壓力、反應(yīng)溫度4 個(gè)因素對轉(zhuǎn)化率的影響，響應(yīng)面見圖5。

圖5 不同因素對乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots for the interactive effects of different factors on ethyl acetate conversion rate response

三維響應(yīng)面圖可用來直觀地表達(dá)各因素之間的相互作用[25]。任取兩個(gè)因素為自變量，固定其他因素使其編碼值為零水平，可以通過回歸方程計(jì)算出相應(yīng)的響應(yīng)值，繪出兩個(gè)因素與乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率之間關(guān)系的響應(yīng)面，可以更直觀地觀察兩因素的相互影響情況。最大的橢圓，即最外圍的橢圓代表在該圓上取值時(shí)，乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率最低，而最小的橢圓則表示在其上面取值時(shí)，乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率最高，最小與最大之間的等高線代表乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率逐漸變化。

對回歸方程求一階偏導(dǎo)數(shù)，當(dāng)響應(yīng)值乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率取最大值時(shí)，所得4 個(gè)因素最佳水平真實(shí)值分別為酶用量2.88%、反應(yīng)時(shí)間13.07 h、反應(yīng)壓力9.39 MPa、反應(yīng)溫度48.99 ℃，對應(yīng)乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率的最大值為35.94%。對4 個(gè)因素值進(jìn)行整理得到相應(yīng)條件為酶用量2.9%、反應(yīng)時(shí)間13.1 h、反應(yīng)壓力9.4 MPa、反應(yīng)溫度49.0 ℃。為了檢驗(yàn)運(yùn)用響應(yīng)面方法分析所得結(jié)果的可靠性，按照上述整理值進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到的乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率為36.1%。預(yù)測值與實(shí)測值之間具有良好的擬合性，從而證實(shí)了模型的有效性。

2.3 產(chǎn)物的定性分析及純度

對分離純化后的產(chǎn)物進(jìn)行甲酯化，利用氣相色譜檢測出脂肪酸中乙酸的總含量為65.93%；利用脂肪酶RMIM對產(chǎn)物進(jìn)行專一性切割，純化后得到2-單甘酯，再對其進(jìn)行甲酯化，利用氣相色譜測得2-單甘酯所含脂肪酸中乙酸的含量為10.01%，通過計(jì)算可知Sn-2位的乙酸含量為產(chǎn)物中脂肪酸總量的3.33%，又已知脂肪酸中乙酸總量為65.93%，所以Sn-1,3位所含乙酸含量為62.60%。若Sn-1位上的脂肪酸全部為乙酸（33.33%），則余下的乙酸在Sn-3位上即含量為29.30%，此時(shí)所得到的提純產(chǎn)物中SLS型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的最小含量為87.99%；若Sn-1,3位所含乙酸含量相同（31.30%），此時(shí)得到的SLS型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)最大含量為93.99%，因此，經(jīng)純化后的產(chǎn)物中一定存在SLS型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)并且含量在87.99%～93.99%之間。對產(chǎn)物進(jìn)一步進(jìn)行純度檢測，得出SLS型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的純度為90.3%。

2.4 大豆油脂處理前后的檢測指標(biāo)

表4 大豆油處理前后的檢測指標(biāo)Table4 Sensory and physiochemical indicators of soybean oil and SLS-type structured lipid

由表4可知，經(jīng)過超臨界CO2制備的SLS型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)，其檢測指標(biāo)均未發(fā)生明顯變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其各項(xiàng)理化指標(biāo)完全符合行業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用要求，具有良好的應(yīng)用性。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)是在超臨界條件下利用酯交換法制取低能SLS型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)，通過響應(yīng)面法優(yōu)化分析得到乙酸乙酯轉(zhuǎn)化的最優(yōu)條件：酶用量2.9%、反應(yīng)時(shí)間13.1 h、反應(yīng)壓力9.4 MPa、反應(yīng)溫度49.0 ℃。在此最優(yōu)條件下進(jìn)行酯交換反應(yīng)，得到的乙酸乙酯轉(zhuǎn)化率為36.1%，經(jīng)分子蒸餾純化后得到純度為90.3%，熱值為22.35 kJ/g的SLS型結(jié)構(gòu)脂質(zhì)，其熱值為普通大豆油的58%，達(dá)到了降低熱值的目的，可為以后工業(yè)化生產(chǎn)低能油脂提供依據(jù)。

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Process Optimization for Synthesis of Low-Energy SLS-Type Structured Lipid by Transesterifi cation in Supercritical CO2State Using Response Surface Methodology

ZHANG Jiaming, XU Duoxian, LI Xiangxin, QI Xiaofen, ZHANG Xu, YU Dianyu*
(School of Food Science and Technology, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

In the supercritical CO2state, the synthesis of lipid with SLS-type structure from the Rhizomucor miehei lipase (Lipozyme RMIM)-catalyzed reaction between ethyl acetate and fi rst-grade soybean oil was investigated. The effects of enzyme concentration, reaction pressure, temperature and time on the conversion rate of ethyl acetate were examined by the combined use of single factor design and response surface methodology. The results showed that the optimal parameters for preparing SLS-type structured lipid were determined as follows: in the presence of 2.9% lipase RMIM, reaction at 49.0 ℃and 9.4 MPa for 13.1 h. Under these conditions, the conversion rate of ethyl acetate reached 36.1% and after purifi cation of the fi nal product, a purity of 90.3% and a caloricity of 22.35 kJ/g (reduced by 42% as compared with that of ordinary soybean oil) were obtained.

supercritical CO2; lipase; structured lipid; ethyl acetate conversion rate

TS224.8

A

1002-6630（2015）20-0067-06

10.7506/spkx1002-6630-201520012

2015-02-09

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生SIPT計(jì)劃項(xiàng)目（201410224036）

張家明（1992—），男，本科，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程專業(yè)。E-mail：1742186793@qq.com

*通信作者：于殿宇（1964—），男，教授，博士，研究方向?yàn)榧Z油精深加工技術(shù)。E-mail：dyyu2000@126.com