楊 巍，王柏松，劉 晶，王 杰，章秋平，張素敏

（遼寧省果樹科學(xué)研究所，遼寧 熊岳 115009）

液相色譜法測定 獼猴桃果實(shí)中抗壞血酸含量的前處理技術(shù)優(yōu)化

楊 巍，王柏松，劉 晶，王 杰，章秋平，張素敏

（遼寧省果樹科學(xué)研究所，遼寧 熊岳 115009）

以獼猴桃果實(shí)為試材，去除果皮，切取月牙形果塊，按樣液比1∶4（g/mL）進(jìn)行研磨和勻漿破碎處理，通過浸提劑種類與質(zhì)量分?jǐn)?shù)、浸提溫度與時(shí)間以及貯存條件等實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，分析各處理樣品中抗壞血酸含量差異顯著性。結(jié)果表明：人工研磨與機(jī)械勻漿都是破碎處理的有效手段，其中機(jī)械勻漿是更為理想的破碎方法。浸提溫度、時(shí)間以及振蕩處理是影響樣品提取效果的主要因素，要把握適度，以在0 ℃條件下超聲波振蕩提取15 min為宜。樣品經(jīng)前處理后立即檢測與貯藏后檢測結(jié)果差異很大，最好立即分析。浸提液種類與質(zhì)量分?jǐn)?shù)、漿液是否分離、貯存溫度、光照是影響貯存效果的主要因素，利用較高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的酸性溶液作為浸提劑，破碎后進(jìn)行離心分離處理，然后置于冷、凍且避光條件下保存是比較理想的樣品貯存辦法。獼猴桃不同果實(shí)間抗壞血酸含量不存在顯著性差異，但仍應(yīng)十分注意材料的選取。

液相色譜；獼猴桃；抗壞血酸；前處理技術(shù)

抗壞血酸，即VC，是人體必需的具有保健功效的營養(yǎng)物質(zhì)[1-6]，主要存在于植物中，合成于線粒體，由載體運(yùn)輸[7-8]，尤其在水果、蔬菜中分布廣泛。因此，測定果蔬抗壞血酸含量對評定其營養(yǎng)價(jià)值具有重要意義。關(guān)于抗壞血酸相關(guān)研究由來已久，前人在抗壞血酸定性定量分析技術(shù)研究過程中陸續(xù)開發(fā)了分光光度法[9-12]、原子吸收光譜法、熒光分光光度法[13]、滴定分析法[14-15]和高效液相色譜法[16-18]等多種檢測方法，這些方法均具有各自的優(yōu)越性，同時(shí)也存在相應(yīng)的局限性。其中，高效液相色譜法具有靈敏度高、選擇性好、測定準(zhǔn)確等 優(yōu)點(diǎn)[19-21]，是近年來發(fā)展較快的最為先進(jìn)的一種分析方法，有很好的應(yīng)用前景。隨著色譜技術(shù)的完善與普及，液相色譜在水果營養(yǎng)品質(zhì)指標(biāo)分析中得到了廣泛的應(yīng)用，成為抗壞血酸定性、定量分析的有效手段，但科學(xué)、系統(tǒng)的前處理技術(shù)仍鮮見報(bào)道。本研究采用獼猴桃果實(shí)為試材，對樣品破碎方法、浸提劑種類、浸提條件與方式以及樣品貯存方法進(jìn)行了全面比對、篩查與優(yōu)化，旨在尋找科學(xué)、簡捷、高效的前處理技術(shù)，為利用液相色譜對抗壞血酸進(jìn)行精準(zhǔn)定性、定量分析提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

成熟的獼猴桃果實(shí)于2012年10月購于遼寧省熊岳正大超市。

抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TOLEDO十 萬分之一電子天平 瑞士梅特勒托利多儀器公司；超純水系統(tǒng) 美國密理博公司；制冰機(jī)日本三洋公司； KQ5200型超聲波提取器 江蘇昆山舒美超聲儀器有限公司；離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；U-3000型液相色譜儀（配有紫外檢測器） 美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

取大小相似、成熟度相近的獼猴桃果實(shí)，去除果皮，縱向切成月牙形果塊，以偏磷酸為浸提液，樣液比為1∶4（g/mL），于同一果實(shí)中取材進(jìn)行人工研磨和機(jī)械勻漿、超聲波處理溫度與時(shí)間以及樣品貯存條件的研究，材料破碎后轉(zhuǎn)移至離心管中在轉(zhuǎn)速為10 000 r/min條件下離心10 min，取上清液經(jīng)0.45 μm濾頭過濾保存，待上機(jī)檢測。以上每處理重復(fù)3 次。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

樣品破碎采用室溫（25 ℃）條件下人工研磨與機(jī)械勻漿兩種處理方式；浸提劑選擇0.0%、0.2%、2.0%、6.0% 4 種質(zhì)量分?jǐn)?shù)的偏磷酸溶液；超聲波振蕩于0 ℃和25 ℃條件下分別處理0、15、30 min；樣品貯存時(shí)，分別選擇浸提劑為水與0.2%偏磷酸溶液，漿液分離與共存，貯藏溫度為－50、4 ℃與25 ℃，貯藏環(huán)境為避光和照光；不同果實(shí)是于同一果箱中隨機(jī)抽取的樣品。

1.3.3 色譜條件

利用紫外檢測器進(jìn)行有機(jī)酸定量測定，采用Agilent ZOBAX C18柱（250 mm×4.6 mm），柱溫20 ℃，檢測波長260 nm，流速為1.0 mL/min，利用戴安變色龍軟件進(jìn)行儀器操作程序控制與數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜圖

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品（A）與樣品中（B）抗壞血酸色譜圖Fig.1 Chromatograms of ascorbic acid standard and sample

由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)溶液中抗壞血酸與樣品中抗壞血酸的保留時(shí)間均為3.973 min。

2.2 破碎處理方式對提取效果的影響

圖2 破碎處理方式對抗壞血酸含量的影響Fig.2 Ascorbe acid contents in kiwi pulp samples after manual grinding and mechanical homogenization

由圖2可知，獼猴桃果實(shí)經(jīng)人工研磨處理后抗壞血酸獲得量為138.877 2 mg/100 g，經(jīng)機(jī)械勻漿處理后抗壞血酸獲得量為157.783 4 mg/100 g，兩者相差18.906 2 mg/100 g，存在極顯著性差異。二者相較，以機(jī)械勻漿破碎效果更好。

2.3 偏磷酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對提取效果的影響

以4種不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)偏磷酸為提取劑對樣品進(jìn)行浸提處理，圖3結(jié)果表明，0.0%、0.2%、2.0%、6.0%偏磷酸浸提處理抗壞血酸獲得量不存在顯著性差異，但從數(shù)據(jù)量值觀察，有隨著偏磷酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高而抗壞血酸獲得量隨之增加的趨勢，說明浸提劑的酸性有利于抗壞血酸的溶出和保持。在抗壞血酸定量分析實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，在一定范圍內(nèi)，應(yīng)盡量選擇酸性較強(qiáng)的浸提劑，以使檢測數(shù)值更接近樣品中指標(biāo)的真實(shí)含量。

圖3 偏磷酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對抗壞血酸含量的影響Fig.3 Ascorbe acid contents in kiwi pulp samples extracted with different concentrations of metaphosphoric acid aqueous solution

2.4 超聲波振蕩時(shí)間和溫度對提取效果的影響

圖4 超聲波振蕩溫度和時(shí)間對抗壞血酸含量的影響Fig.4 Ascorbe acid contents in kiwi pulp samples extracted at different temperatures for different times

不同提取條件處理樣品抗壞血酸分析結(jié)果表明（圖4），6 種條件下抗壞血酸獲得量數(shù)值間不盡相同，但不存在顯著性差異。其中，25 ℃條件下未經(jīng)超聲波振蕩處理、25 ℃條件下超聲波振蕩浸提15 min、0 ℃條件下超聲波振蕩浸提15 min、0 ℃條件下超聲波振蕩浸提30 min抗壞血酸獲得量極其相近，說明使用這4種浸提劑處理樣品的方法具有幾近相同的效果。另外，0 ℃條件下未經(jīng)超聲波振蕩處理與25 ℃條件下超聲波振蕩浸提30 min抗壞血酸獲得量雖與以上4 種提取方式?jīng)]有顯著性差異，但數(shù)值明顯較低，分別為126.536 7 mg/100 g和121.710 8 mg/100 g。同時(shí)可以看出，在25 ℃條件下，浸提時(shí)間越長，抗壞血酸的獲得量反而越低，而在0 ℃條件下，浸提時(shí)間越長，抗壞血酸的獲得量隨之增加。從以上結(jié)果可看出，樣品浸提過程中溫度、時(shí)間以及是否采用振蕩輔助措施都會(huì)影響抗壞血酸的提取效果，在一定范圍內(nèi)，提高提取溫度、延長提取時(shí)間、采用振蕩提取方式都會(huì)提高抗壞血酸的獲得量，但如超出一定范圍，反而會(huì)導(dǎo)致抗壞血酸的轉(zhuǎn)化損失。綜合以上，0 ℃條件下超聲 波振蕩15 min是比較理想的抗壞血酸提取條件。

2.5 貯存條件對樣品抗壞血酸含量的影響

2.5.1 浸提劑種類對貯存效果的影響采用0.2%偏磷酸溶液與超純水作為樣品提取溶劑，機(jī)械勻漿破碎，經(jīng)離心分離后，放置于4 ℃冰箱中避光冷藏貯存，7 d后檢測抗壞血酸含量分別為153.970 1 mg/100 g和82.049 4 mg/100 g，二者差異極顯著，0.2%偏磷酸溶液勻漿樣品經(jīng)冷藏后抗壞血酸含量顯著高于利用水溶液勻漿所得經(jīng)冷藏貯存的樣品（圖5）。樣品如需貯存，應(yīng)注意浸提劑的選擇，其酸性作用對抗壞血酸含量的保持十分重要。

圖5 浸提劑種類對抗壞血酸含量的影響Fig.5 Ascorbe acid contents in kiwi pulp samples extracted with different extractants

2.5.2 漿液共存與分離對貯存效果的影響

圖6 漿液共存與分離對抗壞血酸含量的影響Fig.6 Ascorbe acid contents in kiwi pulp samples with and without centrifugation

樣品勻漿破碎處理后，部分直接轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，另一部分經(jīng)離心分離也轉(zhuǎn)移至離心管中，于－4 ℃冷藏避光條件下貯存7 d后，抗壞血酸定量檢測結(jié)果（圖6）表明，經(jīng)離心分離樣品貯存7 d后抗壞血酸含量為153.970 1 mg/100 g，未經(jīng)分離處理樣品抗壞血酸含量為139.658 1 mg/100 g，二者差異顯著。樣品破碎后離心除去其中的果肉碎屑再進(jìn)行貯存更有利于抗壞血酸指標(biāo)含量的保持。

2.5.3 貯存溫度對貯存效果的影響

圖7 貯存溫度對抗壞血酸含量的影響Fig.7 Ascorbe acid contents in kiwi pulp samples after storage at different temperatures

設(shè)置了－50 ℃避光貯藏7 d、4℃避光貯藏7 d、25 ℃避光貯藏7 d 3 個(gè)處理，結(jié)果表明（圖7），3 類樣品抗壞血酸含量較立即檢測樣品抗壞血酸含量均有不同程度的降低，立即檢測樣品抗壞血酸含量雖明顯高于4 ℃避光貯藏7 d的樣品，但不存在顯著性差異，而立即檢測樣品與其他兩種方式貯存樣品抗壞血酸含量卻存在著極顯著性差異，冷、凍環(huán)境較常溫條件明顯有利于樣品的保存，而冷藏與冷凍間溫度的變化卻沒有對指標(biāo)含量帶來顯著性影響。綜上，樣品經(jīng)前處理后最好立即檢測，如不能按時(shí)完成，以4 ℃避光冷藏貯存效果最好。

2.5.4 光照對貯存效果的影響

圖8 光照對抗壞血酸含量的影響Fig.8 Ascorbe acid contents in kiwi pulp samples after storage under dark and light conditions

樣品利用勻漿破碎，經(jīng)離心分離后置于培養(yǎng)箱中，在25 ℃條件下，一組進(jìn)行照光保存，光照強(qiáng)度為5 lx，一組利用雙層黑色塑料袋包裝再密封于紙箱中進(jìn)行避光保存，定量檢測結(jié)果表明（圖8），照光處理抗壞血酸含量為77.024 0 mg/100 g，避光處理含量為122.823 1 mg/100 g，二者存在極顯著性差異。貯藏過程中，遮光使樣品抗壞血酸含量得到了較好的保持。

2.6 獼猴桃不同果實(shí)抗壞血酸含量分析

3 個(gè)不同果實(shí)當(dāng)中，果A抗壞血酸含量為130.828 3 mg/100 g，果B為143.640 7 mg/100 g，果C為157.783 4 mg/100 g，果B較果A高12.8134 mg/100 g，果C較果B高14.1427 mg/100 g，依次相差10%左右，而果A與果C更是相差26.9551 mg/100 g，超過20%。獼猴桃不同果實(shí)間抗壞血酸含量雖不存在顯著性差異，但數(shù)值相差明顯（圖9）。

圖9 獼猴桃不同單果抗壞血酸含量Fig.9 Ascorbe acid contents in different kiwi fruits

3 討 論

3.1 樣品的前處理技術(shù)

本研究樣品前處理雖不是十分復(fù)雜，但也包含破碎、浸提與分離等多個(gè)環(huán)節(jié)，每一步驟都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的質(zhì)量，應(yīng)全面考慮、注意細(xì)節(jié)。浸提過程當(dāng)中溫度、時(shí)間、振蕩等提取條件與手段均會(huì)促進(jìn)抗壞血酸的獲得，這與劉劍利[22]、葉新紅[23]等在香菇多糖與葡萄多酚提取研究中的結(jié)論相似，但采用振蕩提取方式、提取溫度過高、提取時(shí)間過長都會(huì)使抗壞血酸的獲得量下降，在一般實(shí)驗(yàn)中建議采用0.2%偏磷酸溶液作為浸提劑在冰浴條件下振蕩提取15 min為宜。這與寧德生等[17]在對羅漢果抗壞血酸定量分析研究中對前處理時(shí)間的考察結(jié)論相同。

3.2 處理后樣品的保存

科學(xué)貯存的樣品，檢測結(jié)果能夠真實(shí)反映樣品中目標(biāo)物質(zhì)的實(shí)際存在，而不良的貯藏條件，所檢結(jié)果與樣品指標(biāo)真值含量相距甚遠(yuǎn)，不能作為科學(xué)分析的理論依據(jù)，樣品采集后應(yīng)盡量立即處理、檢測，直接獲得結(jié)果，再科學(xué)的貯藏技術(shù)也與新鮮樣品的分析結(jié)果存在一定的距離?？箟难崾且环N極易被氧化的物質(zhì)，因此，貯藏過程中樣品的狀態(tài)、溫度、光照等因素都會(huì)對檢測結(jié)果有較大的影響，漿液分離樣品貯藏后檢測結(jié)果明顯高于漿液共存的樣品，這可能是因?yàn)?，未?jīng)離心分離的樣品中含有很多果肉碎塊，其中一些有機(jī)物質(zhì)可能能夠促進(jìn)抗壞血酸的氧化轉(zhuǎn)化，而使其含量明顯下降。貯藏過程中的溫度與光照也十分關(guān)鍵，高溫、照光均能夠使樣品中的抗壞血酸發(fā)生變化，使其含量顯著下降。由此我們可以得出，經(jīng)前處理后的樣品最好立即進(jìn)行檢測分析[24]，如不能立即檢測，也要對樣品進(jìn)行離心分離去除部分雜質(zhì)后，在低溫、避光的環(huán)境下短期貯藏。王樂樂等[25]在刺梨果實(shí)VC含量分析中也有相似的結(jié)論。

3.3 材料的選取

不同單果指標(biāo)含量差異明顯，實(shí)驗(yàn)當(dāng)中應(yīng)注意試材的選取，以盡量減少選材所造成的誤差，確保實(shí)驗(yàn)的科學(xué)性。這與程志強(qiáng)等[26]在西瓜果實(shí)VC含量研究結(jié)果相同。植物生長與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中，由于種植品種、植株個(gè)體、生長氣候環(huán)境以及栽培管理技術(shù)水平的不同，而使不同材料本身相互間存在差異甚至相去甚遠(yuǎn)。由不同果實(shí)中抗壞血酸含量差異可以看出，材料間的差異確實(shí)能夠影響甚至改變處理間的結(jié)果，足以誤導(dǎo)對客觀規(guī)律的應(yīng)有認(rèn)識(shí)，甚至背道而馳。因此在同一實(shí)驗(yàn)不同處理過程中應(yīng)盡量在品種相同、個(gè)體長勢相近、同一地域和相同栽培管理方式的果園選取試材，有時(shí)甚至需要選取同一樹上、位置相近、外觀相似的果實(shí)，必要時(shí)可以選擇同一果實(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以進(jìn)一步減小誤差，提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。郜海燕[27]、田世平[28]等在桃品質(zhì)分析研究中對實(shí)驗(yàn)材料的選取均有相似嚴(yán)格的要求。

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Optimization of Pretreatment Conditions for Determination of Ascorbic Acid Content in Kiwi Fruit Pulp by Liquid Chromatography

YANG Wei, WANG Baisong, LIU Jing, WANG Jie, ZHANG Qiuping, ZHANG Sumin (Liaoning Institute of Pomology, Xiongyue 115009, China)

Ripe kiwi fruits were peeled, cut into crescent pieces and ground with aqueous metaphosphoric acid at a solid to water ratio of 1:4 manually or by mechanical homogenization, and then the mash was ultrasonically extracted, centrifuged and stored until being analyzed for the ascorbic acid content by liquid chromatography. The pretreatment conditions including manual or mechanical grinding, extractant type and concentration, extraction temperature and time, and storage conditions were optimized. Signifi cant difference analyses were carried out among various processed samples. The results showed that both manual grinding and mechanical homogenization were effective means of mashing the fruit, and the latter method was superior to the former. Extraction temperature and time were identifi ed as main factors infl uencing extraction effi ciency. An extraction temperature of 0 ℃ and 10 min extraction proved optimal. Accurate results were obtained when the analysis was carried out immediately after sample preparation, signifi cantly different from those reported for the stored samples. Extractant type and concentration, separation of the mash, storage temperature, and light condition were main factors affecting the accuracy of the determination of ascorbic acid using the stored samples. The samples prepared by extraction using higher concentrations of acid and centrifugation should be stored at low temperatures in darkness if analysis cannot be performed immediately. Though no signifi cant difference in ascorbic acid content existed among three kiwifruits, much attention should be paid to selection of the test material.

liquid chromatography; kiwi fruit; ascorbic acid; pretreatment technologies

S661.1

A

1002-6630（2015）20-0163-05

10.7506/spkx1002-6630-201520031

2015-02-09

遼寧省百千萬人才工程項(xiàng)目；遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（20102223）

楊?。?972—），男，副研究員，碩士，研究方向?yàn)楣麡滟Y源品質(zhì)生理。E-mail：ywsys@yeah.net