王鑫，王淑紅(集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建廈門361021)

性別決定與性腺發(fā)育一直都是現(xiàn)代生物學(xué)研究的重要領(lǐng)域之一，它們是彼此緊密聯(lián)系的2個過程:性別決定首先確定了個體性腺發(fā)育的方向，性腺發(fā)育在性腺分化的基礎(chǔ)上，經(jīng)過遺傳、環(huán)境、生理等因素復(fù)雜的相互作用，最終發(fā)育成成熟的精巢和卵巢［1］。性別決定與性腺發(fā)育的作用機制可以歸納成2種類型:一類為遺傳決定系統(tǒng)(Genetic sex-determination system，GSD)，即由遺傳因素決定性別，主要指性染色體和性別決定基因的調(diào)控;另一類為環(huán)境決定系統(tǒng)(Environmental sex-determination system，ESD)，即周圍環(huán)境因子的調(diào)控，主要是性激素、環(huán)境因子等外部因素的作用。軟體動物性別決定與性腺發(fā)育的分子機制尚未明確，該過程相關(guān)的基因也尚未得到證實［2－6］，加上絕大多數(shù)軟體動物尚未發(fā)現(xiàn)性染色體和性別決定基因，因此軟體動物性腺發(fā)育的作用分子機制可能是環(huán)境決定系統(tǒng)。

在20世紀(jì)，研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)性激素包括雌二醇、睪酮和孕酮廣泛存在于腹足類［6－8］和雙殼類［9－10］等軟體動物中。Osada等［11］和Li等［12］研究發(fā)現(xiàn)在雙殼類生物體內(nèi)注射雌二醇能促進卵黃的生成并調(diào)節(jié)排卵過程。Varaksina等［13］報道在蝦夷扇貝(Mizuhopecten yessoensis)體內(nèi)注射雌二醇、睪酮和孕酮后能刺激成體樣品的卵子發(fā)生和精子發(fā)生，導(dǎo)致卵母細胞直徑的增長以及性腺重量的增加。但是，Scott［3－4］綜述了200多篇主張軟體動物存在脊椎動物類型類固醇激素觀點的學(xué)術(shù)論文，指出目前沒有確切證據(jù)表明軟體動物能夠合成脊椎動物類型的類固醇激素。因此，盡管軟體動物體內(nèi)存在類似于脊椎動物的雌激素和雄激素，但由于缺乏對其生物合成途徑或來源的了解以及有關(guān)激素受體的直接證據(jù)，脊椎動物類型的類固醇激素在軟體動物性腺分化中的作用仍是一個未解之謎。

維甲酸X受體是核受體家族重要的組成成員，其主要功能是作為轉(zhuǎn)錄因子來參與生物發(fā)育、細胞分化、新陳代謝以及細胞凋亡過程。RXR還是孤兒受體家族的一員，目前還沒有找到RXR的天然配體。軟體動物RXR基因的相關(guān)研究已經(jīng)越來越受到重視。2004年，Nishikawa等［14］研究發(fā)現(xiàn)TBT與TPT能改變?nèi)薘XR的表達水平;Castro等［15］在對狗巖螺的試驗中發(fā)現(xiàn)性畸變的誘導(dǎo)是由RXR信號途徑調(diào)控的。2011年，Horiguchi等［16］向疣荔枝螺注射了9cRA，通過實時熒光定量PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)TcRXR的mRNA水平在性畸變個體的陰莖和輸精管顯著上升，這說明RXR參與了有機錫致疣荔枝螺性畸變的過程。這表明RXR基因確實參與了TBT等有機錫化合物調(diào)控軟體動物性腺發(fā)育的過程。

雜色鮑(Haliotis diversicolor)，屬于腹足綱(Gastropoda)、前鰓亞綱(Prosobranchia)、原始腹足目(Archaeogastropoda)、鮑科(Haliotidae)、鮑屬(Haliotis)，是我國南方重要經(jīng)濟貝類之一，闡明雜色鮑性腺發(fā)育的分子機制對于雜色鮑的健康養(yǎng)殖有著重要的意義。筆者以雜色鮑為研究對象，采用實時定量PCR技術(shù)研究RXR基因在雜色鮑性腺發(fā)育不同階段的表達情況，確認(rèn)雜色鮑性腺分化的關(guān)鍵窗口期。然后，采用RNA干擾技術(shù)，在雜色鮑性腺分化的關(guān)鍵時期沉默RXR基因、RXR基因以及細胞凋亡相關(guān)基因在雜色鮑性腺分化與發(fā)育中的作用。

1 材料與方法

1．1 試驗動物 試驗用雜色鮑購自于廈門市翔安區(qū)培陽水產(chǎn)養(yǎng)殖公司并放養(yǎng)在培陽水產(chǎn)養(yǎng)殖公司，每天都由養(yǎng)殖公司工作人員喂養(yǎng)新鮮江蘺(Gracilaria verrucosa)，海水溫度控制在25℃左右。每月解剖樣本時挑選重量一致、附著力強的健康鮑魚。解剖鮑魚時，分別采集頭部組織、肝胰腺組織以及性腺組織，液氮速凍后置于－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2 dsRNA的合成 以Trizol法提取雜色鮑總RNA并通過反轉(zhuǎn)錄得到的線性化cDNA為模板，通過PCR技術(shù)擴增了雜色鮑RXR基因的干擾片段，然后通過目的基因與質(zhì)粒載體連接、感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化和篩選、質(zhì)粒插入片段的檢測、質(zhì)粒測序等步驟制備得到合成dsRNA所需的線性化DNA。采用體外轉(zhuǎn)錄法合成dsRNA。0．5 ml PCR管加入以下反應(yīng)體系:1 μg 線性化的 DNA、20 μl 10 × 轉(zhuǎn)錄緩沖液、10 μl 10 mmol/L ATP、10 μl 10 mmol/L CTP、10 μl 10 mmol/L GTP、10 μl 10 mmol/L UTP、1 μl RNase inhibitor、2 μl RNA polymerase、5 μl 0．1 mol/L DTT，加入 DEPC 水至 100 μl。試驗完成后，取少量樣品用1．2%瓊脂糖凝膠電泳檢測dsRNA的質(zhì)量，同時用紫外分光光度計檢測dsRNA的濃度。剩余的樣品加入1 μl RNase inhibitor，－80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3 RNA干擾試驗 將暫養(yǎng)7 d的雜色鮑分成3組:第1組在鮑魚肝胰腺的中間部位注射1．5 μg/b．w．的滅菌海水;第2組在鮑魚肝胰腺的中間部位注射1．5 μg/b．w．的dsRNA-EGFP;鮑魚肝胰腺的中間部位注射 1．5 μg/b．w．的 dsRNA-RXR。注射完成后將鮑魚放回之前的缸中放養(yǎng)。48 h后解剖鮑魚進行RNA提取。

1．4 實時定量PCR試驗 實時定量熒光PCR反應(yīng)體系(10 μl):SYBR Green PCR Master Mix 5 μl、上游引物 F 0．5 μl、下游引物 R 0．5 μl、cDNA 模板 4 μl。

實時定量熒光PCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)熱5 min;95℃變性15 s，60℃退火1 min，40個循環(huán);最后，進行溶解曲線分析:95℃ 5 s，65℃ 1 min，從65℃升溫至97℃(每10 s上升0．11 ℃)。

定量的結(jié)果采用 LightCycler?480Software1．5分析，運用Pfaff法(RQ=(1+E)△Cq，△Cq=最小的Cq值分別減去各組織樣本的Cq值，E為不同基因引物的擴增效率)，并使用SPSS19．0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，用RQ值表示基因的表達水平。

2 結(jié)果與分析

2．1 雜色鮑卵巢發(fā)育過程中RXR的表達變化 根據(jù)前期對雜色鮑性腺石蠟切片的顯微鏡觀察結(jié)果(性腺的顏色、體積、生殖細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及占主體的生殖細胞的類型等)，將雜色鮑的性腺發(fā)育周期分為4個時期:休止期、增殖期、生長期、成熟期。根據(jù)前期對雜色鮑卵巢內(nèi)參基因的篩選，將OAZ1作為卵巢內(nèi)基因相對表達的最適內(nèi)參。

從圖1可以看出，在卵巢組織中RXR基因在性腺發(fā)育增殖期和生長期的表達量顯著上調(diào)(P＜0．05);此后，在性腺發(fā)育成熟期和休止期的表達量顯著下調(diào)。在雌性雜色鮑頭部組織中，RXR基因在性腺發(fā)育的增殖期表達量顯著上調(diào)(P＜0．05);在性腺發(fā)育生長期、成熟期和休止期表達量顯著下調(diào)。在雌性雜色鮑肝胰腺組織，RXR在性腺發(fā)育的增殖期時表達量顯著上調(diào)(P＜0．05);在性腺發(fā)育生長期、成熟期和休止期時表達量顯著下調(diào)。在雄性雜色鮑頭部組織，RXR基因在性腺發(fā)育的增殖期時表達量顯著上調(diào)(P＜0．05);在性腺發(fā)育生長期、成熟期和休止期時表達量顯著下調(diào)。在雄性雜色鮑肝胰腺組織中，RXR基因在性腺發(fā)育生長期的表達量顯著上調(diào)(P＜0．05);在性腺發(fā)育成熟期時表達量顯著下調(diào)表達;在性腺發(fā)育休止期時表達量呈上升趨勢;在性腺發(fā)育增殖期，表達量顯著下調(diào)。

2．2 RXR基因的RNA干擾結(jié)果 為了檢測RXR基因沉默對雌性雜色鮑RXR基因的表達的影響，利用熒光定量PCR技術(shù)分析RXR基因沉默后樣品中RXR基因的mRNA表達水平。從圖2可以看出，在雌性個體頭部組織中，處理組RXR基因表達水平與空白對照組以及陰性對照組相比無顯著性差異。從圖3可以看出，在雌性個體卵巢組織中，處理組RXR基因表達水平與空白對照組以及陰性對照組相比顯著性下降(P ＜0．05)。

3 討論

在脊椎動物中，RXR基因參與多種重要的生理過程，包括胚胎發(fā)育、細胞增殖與分化、新陳代謝等。脊椎動物體內(nèi)的RXR有3種亞型(α、β、γ)，能夠與維生素D受體、甲狀腺激素受體、過氧化物酶體增殖物激活受體、膽汁酸受體等核受體形成異源二聚體發(fā)揮調(diào)控作用［17］。在甲殼類動物體內(nèi)，RXR基因能與蛻皮激素形成異源二聚體［18］。目前，關(guān)于軟體動物RXR基因的研究主要集中在TBT等有機錫化合物誘導(dǎo)RXR的非正常表達，進而導(dǎo)致性畸變現(xiàn)象［19］。在性畸變后期，由于卵巢內(nèi)輸精管的產(chǎn)生導(dǎo)致輸卵管阻塞以及卵巢內(nèi)的精子發(fā)生，受到性畸變影響的軟體動物都會出現(xiàn)性腺發(fā)育不良的現(xiàn)象，進而出現(xiàn)種族繁育危機［20－22］。筆者主要研究RXR基因在雜色鮑性腺發(fā)育過程中的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RXR在卵巢、雌性個體頭部組織、雌性個體肝胰腺組織、雄性個體頭組織和雌性個體肝胰腺組織的表達量在增殖期均存在顯著差異，這證實了RXR不僅在脊椎動物體內(nèi)參與了細胞增值與分化的過程，在軟體動物體內(nèi)同樣存在該作用，同時也表明增殖期可能是RXR基因在雜色鮑性腺發(fā)育過程中起調(diào)控作用的的窗口期，為后面的RNA干擾試驗提供了基礎(chǔ)。同時，在雄性個體肝胰腺組織，RXR基因在性腺發(fā)育增殖期時表達量顯著下調(diào)，這與其他組織的表達情況不同，說明在雄性雜色鮑體內(nèi)RXR基因在不同組織發(fā)揮調(diào)控作用的時間點不同，也可能RXR基因在性腺發(fā)育過程中有其他作用。

RNA干擾技術(shù)能夠快速有效沉默某個基因的表達，進而影響該基因的功能作用。目前，RNA干擾技術(shù)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用在脊椎動物與非脊椎動物中。但是，在軟體動物中，這項技術(shù)還處于初步完善的階段。有些腹足類生物神經(jīng)系統(tǒng)的研究和頭足類觸手肌肉的分化的研究已經(jīng)使用該項技術(shù);對于雙殼類生物，F(xiàn)abioux等［5］通過對牡蠣性腺注射vasa-like雙鏈RNA，結(jié)果表明注射后的牡蠣生殖細胞不在分化并且過早的出現(xiàn)減數(shù)分裂過程，甚至出現(xiàn)不育現(xiàn)象。筆者通過對雌性雜色鮑肝胰腺中間部位注射RXR雙鏈RNA來檢測RXR基因mRNA的表達水平。結(jié)果表明，在雌性個體頭部組織中處理組RXR基因表達水平與空白對照組以及陰性對照組相比無顯著性差異;在雌性個體卵巢組織中，處理組RXR基因表達水平同空白對照組以及陰性對照組相比顯著性下降(P＜0．05)。在卵巢中RXR基因表達的顯著性下調(diào)，說明RXR雙鏈RNA體外注射能有效沉默卵巢中RXR基因的表達;雌性個體頭部組織中的RXR表達量沒有變化可能有2個方面的原因:注射到取樣間隔時間(48 h)較短，以至于沉默效果還未在雌性個體頭部組織中發(fā)揮作用，或者是因為RXR雙鏈RNA在未到達目的組織的時候已經(jīng)被降解。

綜上所述，筆者研究了RXR基因在雜色鮑性腺發(fā)育中的周年表達情況。這些研究結(jié)果有助于闡明雜色鮑性腺發(fā)育的分子機制，進一步豐富了軟體動物繁殖生物學(xué)和水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué)的知識，并為軟體動物的性腺分化與發(fā)育分子機制的研究提供了理論依據(jù)。

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